固定化——提高基因工程菌稳定性的新策略
作者：陈志宏 吴梧桐 聂 凯
单位：陈志宏 吴梧桐(中国药科大学生化教研室，南京210009)；聂凯(北京医科大学药学系，北京100083)
关键词：固定化；基因工程菌；质粒；稳定性
药物生物技术990214 摘 要 重组DNA技术使生物技术取得了彻底性的变革，它可以提供具有极强选择性和累积目的代谢物能力的菌株。但为了进一步降低这些代谢物的生产成本，还需建立高效的生物转化体系及优化重组菌的培养环境。近年来，这些方面的发展主要体现在固定化技术在基因工程菌的应用上。本文在前人工作的基础上将游离及固定化重组菌进行了比较，并发现了固定化重组菌高稳定性的原因。另外还讨论了诸多培养条件对基因工程菌稳定性的影响。
Immobiliza tion-A New Strategy for Stability
, 百拇医药
Improvement of Genetic Engineering Bacteria
Chen Zhihong, Wu Wutong, Nie Kai1
(Department of Biochemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009；1School of Pharmaceutical Science,Beijing Medical University,Beijing 100083)
Abstract DNA recombinant technology have brought innovation to the biolog y technology, it can supply the strains with strong selectivity and ability of accumulating target metabolites.It is necessary to further decreasing the costs of these products, constructing a highly-effective bio-converse system.The d evelopment of this aspect was mainly reflected by the applying of immobilization of recombinant bacteria.According to the result of previous workers, we compared the free and immobilized system and realized the reason of high stability of plasmid.Some other culture conditions were also summerized.
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Key Words Immobilization, Gene-engineered bacteria, Plasmid, Stability
重组DNA技术可以提供具有极强选择性和累积目的代谢物能力的菌株[1]，但为了进一步降低这些代谢物的生产成本，还需建立高效的生物转化体系及优化重组菌的培养环境以期获得最佳表达。虽然“基因型加上环境等于表现型”，但微生物的环境控制经常被人们忽视或缺少认识。事实上，重组菌的最佳培养条件通常是与环境控制紧密相联的，因为微生物对环境理化性质的微小变化都十分敏感[2]。
工程菌生物反应器的反应性很大程度上受非转化细胞繁殖程度的影响。这种现象在中试及工业生产水平上也存在并使得重组菌的应用大受限制[3]。连续培养及批式培养中出现的非转化子(P-)均是由转化细胞(P+)退行而来的。可能缘于两种机制：分离不稳定性和结构不稳定性。前者源于一个不同细胞间质粒DNA分离的不完全系统；后者则是因质粒结构改变而引起。这些改变包括在质粒DNA上的缺失、插入和重排[4～6]。由此而产生的P-细胞则不具备产生目的代谢物的能力，而P+细胞因需合成更多的DNA、mRNA及蛋白而在生长上滞后于P-细胞。同时它们还必须与染色体基因竞争合成目的物所需的前体(如核苷酸、氨基酸等)，而且P+细胞的生长还依赖于质粒的数目、大小和蛋白产物的毒性等。所以，一旦在反应体系中产生P-细胞，就会导致体系中具有不同特性的P+、P-细胞共存，进而使反应后期几乎不再有什么收益。
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由于重组子的稳定性受遗传及环境因素两方面的控制，所以可以通过基因水平的控制和限制反应器中P-细胞的繁殖来加以提高。据此，Ensley提出了“选择性和非选择性”的概念[7]。“选择性”包括：1)在反应器中保持抗生素压力；2)通过质粒进行营养缺陷型互补；3)噬菌体抑制及4)转化子中自杀蛋白的表达。而“非选择性”方法包括：1)引入分离位点而使子细胞在分化过程中获得好的分离；2)插入一段生长基因及3)培养条件的控制。而质粒的稳定性不受培养过程中是否通氧影响。另外人们还采取了将菌体繁殖与产品转化分开两步进行的措施[3，21]。尽管进行了诸多优化生物反应器的尝试，但在工业规模的生产中均未获得成功。
人们发现如将基因工程及酶工程相结合则大规模培养过程中重组菌的稳定性问题可能会得到较好的解决[8]。最近已有一些固定化基因工程菌用于生产的报道，与传统培养方法相比，已显示出了一定的优势，如在稀溶液体系中具有较高的细胞浓度；克隆产物可长期生产；细胞可以得到介质的保护；无需进行产物分离；反应器中可积累高浓度产物，获得较好的传质特性；且整个方法便于自动化控制等。这一固定化基因工程菌目前已得到较快的发展(见表1)[9]。
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表1 固定化基因工程菌一览 包埋介质
重组菌
质 粒
克隆基因产物
参考文献
中空纤维
大肠杆菌
pBR322
β-内酰胺酶
8
硅酮泡沫
大肠杆菌
pOS101
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淀粉酶
12
硅酮聚物
大肠杆菌
pBR322
淀粉酶
12
琼脂
大肠杆菌
pBR322
人胰岛素原
13
卡拉胶
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啤酒酵母
人绒毛膜促性腺激素
14
海藻酸盐
大肠杆菌
pKK233
β-内酰胺酶
15
聚丙烯酰胺
大肠杆菌
pCBH4
氢气
16
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微载体
中国仓鼠细胞
人干扰素
17
卡拉胶
大肠杆菌
pTG201
儿茶酚-2，3-二氧化酶
10，19，22，23，25，31，32，33
海藻酸盐、聚丙烯酰胺、琼脂
枯草杆菌
pPCB6
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胰岛素原
26
卡拉胶
大肠杆菌
pMCT98
β-半乳糖苷酶
27
中空纤维
大肠杆菌
pPA22
6-氨基青霉烷酸
28
琼脂
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大肠杆菌
pPA102
青霉素酰化酶
30
1 固定化及游离工程菌稳定性的比较
将游离及固定化重组菌加以比较后发现，后者具有高细胞浓度、克隆产物高效表达、可长期保持质粒等特性。
1.1 目的产物的生产
固定化细胞E.coliBZ18(PTG201)比无选择压力的游离细胞产生目的产物的产量高20[10]倍。在凝胶表面50～150μm的距离内可以观察到有单层活细胞高密度生长，而在胶粒内部则无细胞生长。与之相似，E.coliC600(PBR322)在中空纤维膜反应器中也可高密度生长[8]。P+和P-细胞的生长速度因培养基的不同而改变，在基础培养基中，E.coliHB101的P+细胞比P-细胞的比生长速率低，而在丰富培养基中二者相同。在固定化体系中，细胞生长得更快，直到达到一个稳定状态，对相对游离体系而言，活细胞数目可达其11倍之多。Sayadi等人发现在丰富培养基中培养的固定化细胞，其质粒数几乎保持不变，而在基础培养基中质粒数会有很大下降。胶粒中的细胞浓度可受很多因素影响：如固定化介质、接种量、胶粒体积、载体浓度及溶氧浓度等[11]。
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1.2 克隆基因产物的表达
固定化方法对提高克隆基因产物合成量的影响对培养若干代后的细胞尤其显著。固定化的E.coliBZ18(pTG201)细胞在培养到第10代时，其产物儿茶酚-2，3-二氧化酶的产量有很大提高[10]。在一连续操作的中空纤维膜生物反应器中，可得到较高的β-内酰胺酶产率并能维持3周以上[8]。E.coliEC147在硅酮泡沫中被固定化后用于生产耐热淀粉酶，通过半连续培养可获得比游离细胞体系高5倍的产量[12]。通过高细胞浓度的固定化法可得到高浓度人胰岛素原[13]。用于生产α-人绒毛膜促性腺激素的啤酒酵母经过固定化后反应器的时空产量可提高20倍[14]。固定化体系与悬浮体系相比可选择性地高产量地积累β内酰胺酶[8]，固定化反应器运行到第3d和第100d的产量分别是后者的100倍和1000倍[15]。固定化带有C.freundiiTIT0101基因的E.coliHK-8细胞用于连续释放氢气，可获得极高产量并能长期连续反应[16]。在微载体上固定中国仓鼠细胞生产人干扰素可稳定生产一个月时间[17]。
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1.3 质粒的遗传稳定性
质粒的遗传稳定性是基因工程细胞最重要的因素，因为质粒是表达目的基因产物的载体。在固定化体系中P+细胞可稳定地遗传55代，传到第18代时，P+细胞量是游离细胞的3倍。比较了游离的和固定化的细胞在基础和LB培养基中的质粒遗传稳定性，发现在两种培养基中固定化细胞质粒的遗传稳定性较高[10]。与此相似，质粒PTG201可稳定存在于3种固定化的E.coli中[18]。在通纯氧的固定化体系中质粒的稳定性和拷贝数可较好地维持，到第200代时仍接近初始的100%[19]。与之相似，热稳定性淀粉酶基因在硅酮泡沫中可维持稳定。用棉布固定化可使pBR322在E.coli中维持较高稳定性[12]。具广泛宿主的自转染质粒PR4或与其类似的质粒，通常用作G细菌的载体完全整合入染色体中，在其宿主M.xan被固定化后也获得了良好的稳定性[20]。在研究了稳定对pTG2014质粒在E.coliW3101中稳定性的影响后发现，儿茶酚-2，3-二氧化酶的产量在解抑制温度42℃时有所提高，但质粒稳定性有所下降。但若采用两步连续培养则可克服质粒的低稳定性问题。第一步是固定化细胞在31℃表达抑制的情况下生长以防pTG201的丢失；被释放的细胞被连续地泵入第二步反应器，并于42℃解抑制的状态生产高水平的儿茶酚-2，3-二氧化酶[21]。相似的两步连续培养也曾被Barbotin等人采用[22]。第一步中的细胞在与前述方法相同的抑制状态下生长，在第二步中3-β-吲哚丙烯酸加入到体系中以利于色氨酸操纵子解抑制物的作用而提高eylE基因的翻译水平。在游离情况下连续分批培养重组菌，则会观察到质粒的稳定性存在着波动，而这种波动会在固定化体系中得到修正[23]。
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总之，与游离细胞体系相比，固定化技术可以明显提高基因工程细胞稳定性和目的基因表达产物的产量，并能保持宿主中质粒的稳定性和拷贝数。
2 固定化重组细胞的特点及质粒稳定性的原理
早期的观点认为固定化有利于维持重组体培养的稳定性，现在文献中相当多的资料表明在固定化条件下，不仅可以提高重组菌的稳定性还可以产生更多的克隆基因产物。其优点大致总结如下[9]：
1)许多质粒载体具有了更高的稳定性；
2)结构不稳定和缺失现象减少或消失；
3)初期菌株适应期消失了；
4)避免了在游离培养中因延长菌体生长期而出现的波动；
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5)使宿主中质粒拷贝数在更长时间内保持不变；
6)由于胶粒的机械特性使得P+和P-细胞在胶粒中不存在竞争；
7)允许少数几代P-细胞在脱离胶粒之前与P+细胞竞争；
8)在细胞脱离胶粒之前限制其分裂数；
9)脱落的细胞在完成多次分裂之前就被洗脱；
10)由P+细胞衍生而来的P-细胞在固定化体系中被位于胶粒更深处的新细胞不断补充，这些细胞的生长最初曾由于营养或氧气的缺乏而受到抑制；
11)可以获得更高密度的细胞和大量的克隆基因表达产物，因而可以减少反应器体积；
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12)便于大量减少回收费用。
在固定化体系中质粒稳定性的提高不能用单一的因素来解释。虽然P+和P-细胞之间有紧密的联系，但事实证明质粒在固定化细胞中的转移是不存在的。早期提出的隔室化理论并不能解释高稳定性，因为细胞长到第6代就足以将胶粒内部的空间充满。带有pTG201质粒的P+和P-细胞以87%和13%的比例共同固定化后繁殖了约80代，最后P+和P-细胞在胶粒中比例不变，而与游离细胞体系大不相同。这样就证明了质粒稳定性的提高归功于P-和P+细胞无法在胶粒中竞争[10]，以及固定化细胞在胶粒中繁殖缓慢的原因[24]。同时微环境在通过稳定性方面也发挥了很重要的作用。对于固定化体系可以保护基因的稳定性至今尚无一个确定的解释。然而，对于克隆基因分泌产物及其调控机制以及固定化细胞生理学的全面了解可以为重组细胞高稳定性提供更多的信息。就形态和通透性而言，观察重组细胞内部、细胞膜、细胞壁组成的变化是很重要的。它可以增加对重组菌中质粒高稳定性的了解。
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3 培养条件对质粒稳定性、菌体量及克隆基因产物的影响
游离细胞体系，固定化体系影响因素有接种量、各种介质、胶粒体积、基质浓度、营养缺陷、温度、pH以及溶氧浓度等。
3.1 接种量
重组细胞中质粒的稳定性程度受接种量的影响。早期的研究表明在胶粒表面50～150μm附近固定化细胞呈单层生长。在胶粒内部没有观察到细胞生长[3]。但减少接种量可以使胶粒表面和内部的重组细胞数均有较大程度的提高。这可能是由于胶粒中最初的低细胞量可以克服营养物质和氧气的传质限制，接种量在细胞固定化技术中的影响已有了系统的研究。
3.2 固定化介质
载体对于质粒稳定性以及产物表达量的提高尚无系统的研究，因此有关这一重要因素的信息很少。考察琼脂糖、藻酸盐、以及聚丙烯酸树脂等材料对生产胰岛素原的E.coli的包埋情况后认为，琼脂糖最为有效，因为它既无毒又可迅速释放包埋的标记胰岛素原。而藻酸盐和聚丙烯酸树脂只能释放15%～20%包埋的胰岛素原。所以多孔琼脂糖被选作生产胰岛素原的重组细胞的固定化载体[26]。KCl可使重组菌中质粒稳定性明显下降，但其作为硬化剂在卡拉胶固定化过程中，不影响菌体生长及质粒稳定性[27]。利用中空纤维膜固定化大肠杆菌生产6-氨基青霉烷酸，可以提高反应器中单位体积青霉素酰化酶的活性而实现高浓度青霉素的裂解[28]。另外还有一些其它载体如：硅酮聚合物、硅酮泡沫、棉布、和Cyclodex1微载体等。这些材料毒性低、机械强度及热稳定性高，且具有较好的亲水性。
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3.3 胶粒数量
Birbaum等人研究认为，胶粒在反应器中所占体积越大(即胶粒越多)重组基因生产目的产物的能力越强。在较低接种量的情况下，胰岛素原的产量随着胶粒数量的增加而增加。在胶粒数量过多时，从胶粒中游离出的细胞也会相应增加，但其内部的重组质粒则可保持较高的稳定性。显而易见，若要提高反应器的体积产量，就必须采用高浓度的固定化胶粒[13]。
3.4 介质浓度
有研究表明，凝胶浓度提高后，溶质扩散及溶氧摄取都随之降低而使转化反应受到影响[29]。同样，在胶浓度一定的情况下，对不同胶粒大小影响目的产物生产的情况进行的研究发现，转化反应同样受到胶粒直径的影响，直径越小则可获得越高的转化率[30]。一般来讲，多采用2%介质浓度用以固定化重组细胞。
3.5 营养缺失
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在游离细胞体系中，质粒的稳定性会受到营养限制的影响。同样，在固定化体系中葡萄糖、氮源、磷酸盐及镁盐中某一因素缺失都会影响到质粒稳定性。在这些限制性培养基中，游离及固定化系统中的P-细胞均会有所增加。但在固定化体系中情况要好得多。在上述诸因素中，磷酸盐和镁盐对质粒的稳定性影响最显著，这可能是由于导致胶粒中活细胞数目减少而造成的[31]。
3.6 培养温度及pH
温度和pH同样会影响克隆基因的表达，胰岛素原表达的最佳温度位于25～30℃之间，pH为7.0[13]，Sayadi等人研究了温度对E.coliB和E.coliW3101中的pTG201质粒稳定性的影响发现，31℃时质粒均稳定存在于宿主中，温度升高到42℃时，游离及固定化系统中质粒稳定性均有所下降，但固定化系统可适当增强重组细胞的热稳定性。这可能是因为介质中P-细胞与P+细胞相比缺乏竞争力的缘故。而游离系统与固定化系统相比，其克隆基因产物的表达水平也有很大降低[32]。
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为了将重组菌的生长及目的产物的生产两步分开，人们建立了基于温度变化的两步连续固定化培养法。第一步，温度控制在31℃，使E.coliB处于抑制状态而增加质粒的稳定性。从第一个反应器中释放的细胞不断地流入温度为42℃的第二个反应器中，该温度下可使重组细胞解除抑制而产生儿茶酚-2，3-二氧化酶[21]。这种温度迁移的去抑制作用并不影响胶粒中细胞的活性。但从事固定化重组菌研究的大多数工作者都选择37℃作为最佳培养温度。在研究了pH对固定化的哺乳动物细胞的影响后发现，控制pH在一定水平与不控制pH相比，可多获得40%的目的产物[17]。固定化体系的pH范围多选择在7.0～7.6之间。
3.7 溶氧浓度
Marin等人利用向反应器中通入纯氧的方法提高了固定化E.coliK12细胞中质粒的稳定性。这是因为重组细胞在通纯氧情况下比通空气的生长速度要慢，传代分化数目减少，从而使产生P-细胞的机率降低并进而提高重组细胞中质粒的稳定性。胶粒的形态测定显示，通纯氧10h与通空气培养相比，胶粒内部可形成更大的菌落，且菌落占胶粒体积的百分比更大。在通纯氧的情况下，质粒拷贝数及转化子数目可保持200代不变[19]。Huang等人也发现了类似的情况，他们认为通纯氧使质粒稳定性增加是由于重组菌生长速率降低及抑制了目的产物产生所致[33]。
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4 总结与展望
迄今为止人们构建了许多重组菌用于生产不同的生物活性物质，其中的大部分研究正处于中试放大阶段。重组菌的宿主多选用大肠杆菌，在对这些重组菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表达率都有了很大提高。在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压力稳定质粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法后，这种选择压力则可被省去。不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。因此固定化技术在重组菌生产目的产物的应用中与游离系统相比则更具有优势。
人们曾提出了许多关于固定化重组菌质粒稳定性的原因。而其中最值得注意的是对吸附于水不溶介质表面的重组细胞的代谢改变，生理学及形态学的观察。对游离及固定化的细胞膜、细胞壁的比较，DNA含量及其表达蛋白的比较等对提高质粒稳定性的研究也大有帮助。同样，分别位于胶粒内部及表层的重组菌所含质粒拷贝数也十分值得研究。如此诸多问题的解决仍有待致力于重组菌技术研究的工作人员的共同努力。
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随着基因工程技术的迅速发展及其产业化进程的深入，提高重组菌的稳定性以减少其遗传蜕变、降低生产成本等问题越来越为人们所关注。而固定化，这种传统的生物工程技术必将再次焕发它的青春。
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收稿日期：1998-05-12, 百拇医药
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工程菌生物反应器的反应性很大程度上受非转化细胞繁殖程度的影响。这种现象在中试及工业生产水平上也存在并使得重组菌的应用大受限制[3]。连续培养及批式培养中出现的非转化子(P-)均是由转化细胞(P+)退行而来的。可能缘于两种机制：分离不稳定性和结构不稳定性。前者源于一个不同细胞间质粒DNA分离的不完全系统；后者则是因质粒结构改变而引起。这些改变包括在质粒DNA上的缺失、插入和重排[4～6]。由此而产生的P-细胞则不具备产生目的代谢物的能力，而P+细胞因需合成更多的DNA、mRNA及蛋白而在生长上滞后于P-细胞。同时它们还必须与染色体基因竞争合成目的物所需的前体(如核苷酸、氨基酸等)，而且P+细胞的生长还依赖于质粒的数目、大小和蛋白产物的毒性等。所以，一旦在反应体系中产生P-细胞，就会导致体系中具有不同特性的P+、P-细胞共存，进而使反应后期几乎不再有什么收益。
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由于重组子的稳定性受遗传及环境因素两方面的控制，所以可以通过基因水平的控制和限制反应器中P-细胞的繁殖来加以提高。据此，Ensley提出了“选择性和非选择性”的概念[7]。“选择性”包括：1)在反应器中保持抗生素压力；2)通过质粒进行营养缺陷型互补；3)噬菌体抑制及4)转化子中自杀蛋白的表达。而“非选择性”方法包括：1)引入分离位点而使子细胞在分化过程中获得好的分离；2)插入一段生长基因及3)培养条件的控制。而质粒的稳定性不受培养过程中是否通氧影响。另外人们还采取了将菌体繁殖与产品转化分开两步进行的措施[3，21]。尽管进行了诸多优化生物反应器的尝试，但在工业规模的生产中均未获得成功。
人们发现如将基因工程及酶工程相结合则大规模培养过程中重组菌的稳定性问题可能会得到较好的解决[8]。最近已有一些固定化基因工程菌用于生产的报道，与传统培养方法相比，已显示出了一定的优势，如在稀溶液体系中具有较高的细胞浓度；克隆产物可长期生产；细胞可以得到介质的保护；无需进行产物分离；反应器中可积累高浓度产物，获得较好的传质特性；且整个方法便于自动化控制等。这一固定化基因工程菌目前已得到较快的发展(见表1)[9]。
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表1 固定化基因工程菌一览 包埋介质
重组菌
质 粒
克隆基因产物
参考文献
中空纤维
大肠杆菌
pBR322
β-内酰胺酶
8
硅酮泡沫
大肠杆菌
pOS101
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淀粉酶
12
硅酮聚物
大肠杆菌
pBR322
淀粉酶
12
琼脂
大肠杆菌
pBR322
人胰岛素原
13
卡拉胶
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啤酒酵母
人绒毛膜促性腺激素
14
海藻酸盐
大肠杆菌
pKK233
β-内酰胺酶
15
聚丙烯酰胺
大肠杆菌
pCBH4
氢气
16
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微载体
中国仓鼠细胞
人干扰素
17
卡拉胶
大肠杆菌
pTG201
儿茶酚-2，3-二氧化酶
10，19，22，23，25，31，32，33
海藻酸盐、聚丙烯酰胺、琼脂
枯草杆菌
pPCB6
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胰岛素原
26
卡拉胶
大肠杆菌
pMCT98
β-半乳糖苷酶
27
中空纤维
大肠杆菌
pPA22
6-氨基青霉烷酸
28
琼脂
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大肠杆菌
pPA102
青霉素酰化酶
30
1 固定化及游离工程菌稳定性的比较
将游离及固定化重组菌加以比较后发现，后者具有高细胞浓度、克隆产物高效表达、可长期保持质粒等特性。
1.1 目的产物的生产
固定化细胞E.coliBZ18(PTG201)比无选择压力的游离细胞产生目的产物的产量高20[10]倍。在凝胶表面50～150μm的距离内可以观察到有单层活细胞高密度生长，而在胶粒内部则无细胞生长。与之相似，E.coliC600(PBR322)在中空纤维膜反应器中也可高密度生长[8]。P+和P-细胞的生长速度因培养基的不同而改变，在基础培养基中，E.coliHB101的P+细胞比P-细胞的比生长速率低，而在丰富培养基中二者相同。在固定化体系中，细胞生长得更快，直到达到一个稳定状态，对相对游离体系而言，活细胞数目可达其11倍之多。Sayadi等人发现在丰富培养基中培养的固定化细胞，其质粒数几乎保持不变，而在基础培养基中质粒数会有很大下降。胶粒中的细胞浓度可受很多因素影响：如固定化介质、接种量、胶粒体积、载体浓度及溶氧浓度等[11]。
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1.2 克隆基因产物的表达
固定化方法对提高克隆基因产物合成量的影响对培养若干代后的细胞尤其显著。固定化的E.coliBZ18(pTG201)细胞在培养到第10代时，其产物儿茶酚-2，3-二氧化酶的产量有很大提高[10]。在一连续操作的中空纤维膜生物反应器中，可得到较高的β-内酰胺酶产率并能维持3周以上[8]。E.coliEC147在硅酮泡沫中被固定化后用于生产耐热淀粉酶，通过半连续培养可获得比游离细胞体系高5倍的产量[12]。通过高细胞浓度的固定化法可得到高浓度人胰岛素原[13]。用于生产α-人绒毛膜促性腺激素的啤酒酵母经过固定化后反应器的时空产量可提高20倍[14]。固定化体系与悬浮体系相比可选择性地高产量地积累β内酰胺酶[8]，固定化反应器运行到第3d和第100d的产量分别是后者的100倍和1000倍[15]。固定化带有C.freundiiTIT0101基因的E.coliHK-8细胞用于连续释放氢气，可获得极高产量并能长期连续反应[16]。在微载体上固定中国仓鼠细胞生产人干扰素可稳定生产一个月时间[17]。
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1.3 质粒的遗传稳定性
质粒的遗传稳定性是基因工程细胞最重要的因素，因为质粒是表达目的基因产物的载体。在固定化体系中P+细胞可稳定地遗传55代，传到第18代时，P+细胞量是游离细胞的3倍。比较了游离的和固定化的细胞在基础和LB培养基中的质粒遗传稳定性，发现在两种培养基中固定化细胞质粒的遗传稳定性较高[10]。与此相似，质粒PTG201可稳定存在于3种固定化的E.coli中[18]。在通纯氧的固定化体系中质粒的稳定性和拷贝数可较好地维持，到第200代时仍接近初始的100%[19]。与之相似，热稳定性淀粉酶基因在硅酮泡沫中可维持稳定。用棉布固定化可使pBR322在E.coli中维持较高稳定性[12]。具广泛宿主的自转染质粒PR4或与其类似的质粒，通常用作G细菌的载体完全整合入染色体中，在其宿主M.xan被固定化后也获得了良好的稳定性[20]。在研究了稳定对pTG2014质粒在E.coliW3101中稳定性的影响后发现，儿茶酚-2，3-二氧化酶的产量在解抑制温度42℃时有所提高，但质粒稳定性有所下降。但若采用两步连续培养则可克服质粒的低稳定性问题。第一步是固定化细胞在31℃表达抑制的情况下生长以防pTG201的丢失；被释放的细胞被连续地泵入第二步反应器，并于42℃解抑制的状态生产高水平的儿茶酚-2，3-二氧化酶[21]。相似的两步连续培养也曾被Barbotin等人采用[22]。第一步中的细胞在与前述方法相同的抑制状态下生长，在第二步中3-β-吲哚丙烯酸加入到体系中以利于色氨酸操纵子解抑制物的作用而提高eylE基因的翻译水平。在游离情况下连续分批培养重组菌，则会观察到质粒的稳定性存在着波动，而这种波动会在固定化体系中得到修正[23]。
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总之，与游离细胞体系相比，固定化技术可以明显提高基因工程细胞稳定性和目的基因表达产物的产量，并能保持宿主中质粒的稳定性和拷贝数。
2 固定化重组细胞的特点及质粒稳定性的原理
早期的观点认为固定化有利于维持重组体培养的稳定性，现在文献中相当多的资料表明在固定化条件下，不仅可以提高重组菌的稳定性还可以产生更多的克隆基因产物。其优点大致总结如下[9]：
1)许多质粒载体具有了更高的稳定性；
2)结构不稳定和缺失现象减少或消失；
3)初期菌株适应期消失了；
4)避免了在游离培养中因延长菌体生长期而出现的波动；
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5)使宿主中质粒拷贝数在更长时间内保持不变；
6)由于胶粒的机械特性使得P+和P-细胞在胶粒中不存在竞争；
7)允许少数几代P-细胞在脱离胶粒之前与P+细胞竞争；
8)在细胞脱离胶粒之前限制其分裂数；
9)脱落的细胞在完成多次分裂之前就被洗脱；
10)由P+细胞衍生而来的P-细胞在固定化体系中被位于胶粒更深处的新细胞不断补充，这些细胞的生长最初曾由于营养或氧气的缺乏而受到抑制；
11)可以获得更高密度的细胞和大量的克隆基因表达产物，因而可以减少反应器体积；
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12)便于大量减少回收费用。
在固定化体系中质粒稳定性的提高不能用单一的因素来解释。虽然P+和P-细胞之间有紧密的联系，但事实证明质粒在固定化细胞中的转移是不存在的。早期提出的隔室化理论并不能解释高稳定性，因为细胞长到第6代就足以将胶粒内部的空间充满。带有pTG201质粒的P+和P-细胞以87%和13%的比例共同固定化后繁殖了约80代，最后P+和P-细胞在胶粒中比例不变，而与游离细胞体系大不相同。这样就证明了质粒稳定性的提高归功于P-和P+细胞无法在胶粒中竞争[10]，以及固定化细胞在胶粒中繁殖缓慢的原因[24]。同时微环境在通过稳定性方面也发挥了很重要的作用。对于固定化体系可以保护基因的稳定性至今尚无一个确定的解释。然而，对于克隆基因分泌产物及其调控机制以及固定化细胞生理学的全面了解可以为重组细胞高稳定性提供更多的信息。就形态和通透性而言，观察重组细胞内部、细胞膜、细胞壁组成的变化是很重要的。它可以增加对重组菌中质粒高稳定性的了解。
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3 培养条件对质粒稳定性、菌体量及克隆基因产物的影响
游离细胞体系，固定化体系影响因素有接种量、各种介质、胶粒体积、基质浓度、营养缺陷、温度、pH以及溶氧浓度等。
3.1 接种量
重组细胞中质粒的稳定性程度受接种量的影响。早期的研究表明在胶粒表面50～150μm附近固定化细胞呈单层生长。在胶粒内部没有观察到细胞生长[3]。但减少接种量可以使胶粒表面和内部的重组细胞数均有较大程度的提高。这可能是由于胶粒中最初的低细胞量可以克服营养物质和氧气的传质限制，接种量在细胞固定化技术中的影响已有了系统的研究。
3.2 固定化介质
载体对于质粒稳定性以及产物表达量的提高尚无系统的研究，因此有关这一重要因素的信息很少。考察琼脂糖、藻酸盐、以及聚丙烯酸树脂等材料对生产胰岛素原的E.coli的包埋情况后认为，琼脂糖最为有效，因为它既无毒又可迅速释放包埋的标记胰岛素原。而藻酸盐和聚丙烯酸树脂只能释放15%～20%包埋的胰岛素原。所以多孔琼脂糖被选作生产胰岛素原的重组细胞的固定化载体[26]。KCl可使重组菌中质粒稳定性明显下降，但其作为硬化剂在卡拉胶固定化过程中，不影响菌体生长及质粒稳定性[27]。利用中空纤维膜固定化大肠杆菌生产6-氨基青霉烷酸，可以提高反应器中单位体积青霉素酰化酶的活性而实现高浓度青霉素的裂解[28]。另外还有一些其它载体如：硅酮聚合物、硅酮泡沫、棉布、和Cyclodex1微载体等。这些材料毒性低、机械强度及热稳定性高，且具有较好的亲水性。
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3.3 胶粒数量
Birbaum等人研究认为，胶粒在反应器中所占体积越大(即胶粒越多)重组基因生产目的产物的能力越强。在较低接种量的情况下，胰岛素原的产量随着胶粒数量的增加而增加。在胶粒数量过多时，从胶粒中游离出的细胞也会相应增加，但其内部的重组质粒则可保持较高的稳定性。显而易见，若要提高反应器的体积产量，就必须采用高浓度的固定化胶粒[13]。
3.4 介质浓度
有研究表明，凝胶浓度提高后，溶质扩散及溶氧摄取都随之降低而使转化反应受到影响[29]。同样，在胶浓度一定的情况下，对不同胶粒大小影响目的产物生产的情况进行的研究发现，转化反应同样受到胶粒直径的影响，直径越小则可获得越高的转化率[30]。一般来讲，多采用2%介质浓度用以固定化重组细胞。
3.5 营养缺失
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在游离细胞体系中，质粒的稳定性会受到营养限制的影响。同样，在固定化体系中葡萄糖、氮源、磷酸盐及镁盐中某一因素缺失都会影响到质粒稳定性。在这些限制性培养基中，游离及固定化系统中的P-细胞均会有所增加。但在固定化体系中情况要好得多。在上述诸因素中，磷酸盐和镁盐对质粒的稳定性影响最显著，这可能是由于导致胶粒中活细胞数目减少而造成的[31]。
3.6 培养温度及pH
温度和pH同样会影响克隆基因的表达，胰岛素原表达的最佳温度位于25～30℃之间，pH为7.0[13]，Sayadi等人研究了温度对E.coliB和E.coliW3101中的pTG201质粒稳定性的影响发现，31℃时质粒均稳定存在于宿主中，温度升高到42℃时，游离及固定化系统中质粒稳定性均有所下降，但固定化系统可适当增强重组细胞的热稳定性。这可能是因为介质中P-细胞与P+细胞相比缺乏竞争力的缘故。而游离系统与固定化系统相比，其克隆基因产物的表达水平也有很大降低[32]。
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为了将重组菌的生长及目的产物的生产两步分开，人们建立了基于温度变化的两步连续固定化培养法。第一步，温度控制在31℃，使E.coliB处于抑制状态而增加质粒的稳定性。从第一个反应器中释放的细胞不断地流入温度为42℃的第二个反应器中，该温度下可使重组细胞解除抑制而产生儿茶酚-2，3-二氧化酶[21]。这种温度迁移的去抑制作用并不影响胶粒中细胞的活性。但从事固定化重组菌研究的大多数工作者都选择37℃作为最佳培养温度。在研究了pH对固定化的哺乳动物细胞的影响后发现，控制pH在一定水平与不控制pH相比，可多获得40%的目的产物[17]。固定化体系的pH范围多选择在7.0～7.6之间。
3.7 溶氧浓度
Marin等人利用向反应器中通入纯氧的方法提高了固定化E.coliK12细胞中质粒的稳定性。这是因为重组细胞在通纯氧情况下比通空气的生长速度要慢，传代分化数目减少，从而使产生P-细胞的机率降低并进而提高重组细胞中质粒的稳定性。胶粒的形态测定显示，通纯氧10h与通空气培养相比，胶粒内部可形成更大的菌落，且菌落占胶粒体积的百分比更大。在通纯氧的情况下，质粒拷贝数及转化子数目可保持200代不变[19]。Huang等人也发现了类似的情况，他们认为通纯氧使质粒稳定性增加是由于重组菌生长速率降低及抑制了目的产物产生所致[33]。
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4 总结与展望
迄今为止人们构建了许多重组菌用于生产不同的生物活性物质，其中的大部分研究正处于中试放大阶段。重组菌的宿主多选用大肠杆菌，在对这些重组菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表达率都有了很大提高。在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压力稳定质粒的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法后，这种选择压力则可被省去。不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性。因此固定化技术在重组菌生产目的产物的应用中与游离系统相比则更具有优势。
人们曾提出了许多关于固定化重组菌质粒稳定性的原因。而其中最值得注意的是对吸附于水不溶介质表面的重组细胞的代谢改变，生理学及形态学的观察。对游离及固定化的细胞膜、细胞壁的比较，DNA含量及其表达蛋白的比较等对提高质粒稳定性的研究也大有帮助。同样，分别位于胶粒内部及表层的重组菌所含质粒拷贝数也十分值得研究。如此诸多问题的解决仍有待致力于重组菌技术研究的工作人员的共同努力。
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随着基因工程技术的迅速发展及其产业化进程的深入，提高重组菌的稳定性以减少其遗传蜕变、降低生产成本等问题越来越为人们所关注。而固定化，这种传统的生物工程技术必将再次焕发它的青春。
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收稿日期：1998-05-12, 百拇医药