复合蛋白酶抑制剂的实验研究
作者：刘 敏 杨继虞
单位：刘敏(上海医科大学药学院靶向制剂研究室，上海200032)；杨继虞(华西医科大学药学院生化教研室，成都610041)
关键词：蛋白酶抑制剂；胰岛素；血糖
药物生物技术990211 摘 要 以胰蛋白酶为代表，采用福林-酚试剂法，通过对各种类型蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶活性的抑制程度进行比较，筛选出一种广谱而价廉的复合蛋白酶抑制剂(SPI2+ET)，其对胰蛋白酶活性的抑制分数高达95%以上。以胰岛素作为模型药物，以(SPI2+ET)作为肠道消化酶抑制剂，制备胰岛素肠溶微球，灌胃可使正常大鼠产生明显的降血糖效果。
Study on Complex Protease Inhibitor
Liu Min, Yang Jiyu1
, http://www.100md.com
(Department of pharmacy,Shanghai Medical University,Shanghai 200032;
1Department of Pharmacy, West China Medical University, Chengdu 610041)
Abstract A complex protease inhibitor (SPI2+ET) is studied for protecting protein from degradating by enteric engymes. With FULIN-FEN mothod, the complex protease inhibitor(SPI2+ET) inhibits 95% pancreatin activity. Oral ente riccoated insulin microsphere can bring about a significant hypoglycemic effect. Experiment indicates the protection of complex inhibitor (SPI2+ET) apears to be a better method for oral administration of insulin.
, 百拇医药
Key Words Protease Inhibitor, Insulin, Blood-suger
肠道消化酶的代谢作用是影响蛋白和多肽类药物口服吸收的主要因素之一，而蛋白酶抑制剂的使用可保护蛋白质和多肽类药物免受消化酶的降解作用的影响。常用的酶抑制剂品种较多，其中包括：杆菌肽，抑肽酶，胰蛋白抑制剂，1，10-邻二杂氮菲，对羟基汞基苯甲酸，有机磷化合物(DFP)及嘌呤霉素等，其中应用最广，效果较好的是抑肽酶。但是抑肽酶成本较高，应用受到限制，而且对蛋白酶活性的抑制作用并未达到理想的效果。为了筛选出一种有效而价廉的蛋白酶抑制剂，本文以胰酶为代表，以抑肽酶作为参比物，通过比较各种酶抑制剂对胰酶活性的抑制程度进行筛选。为了检测筛选出的酶抑制剂在体内的作用，本文以胰岛素作为蛋白和多肽类药物的代表，采用肠溶材料——丙烯酸树脂作囊材，通过相分离法制备了胰岛素肠溶微球，给大鼠灌胃，测定大鼠血糖值，同时做对照实验，观察含酶抑制剂的胰岛素微球的降血糖的作用。
1 材 料
, 百拇医药
1.1 主要试剂
抑肽酶(AP)、苯*****(PMSF)和胰蛋白酶抑制剂I(SPⅠ1)均为美国Sigma公司产品，胰蛋白酶抑制剂Ⅱ(SPⅠ2)为四川大学生物化学教研室制备，胰蛋白酶抑制剂Ⅲ(ET)为上海试剂一厂产品；胰酶为内江生化制药厂产品；丙烯酸树脂为连云港制碘厂产品；结晶猪胰岛素(27.5IU/mg)为徐州生化制药厂产品；血糖测定试剂盒为保定长城临床试剂公司产品。
1.2 主要仪器
721型分光光度计为上海第三分析仪器厂制造；D25-2型电动搅拌器为杭州仪表电机厂制造；800型离心沉淀器为上海手术器械厂制造。
2 实验方法
2.1 胰酶活性的测定
, 百拇医药
以酪蛋白为底物，与一定浓度的胰酶溶液加pH7.0的磷酸缓冲溶液保温2h，立即加入三氯醋酸溶液中止反应，滤过，用福林-酚试剂与滤液发生显色反应，紫外测定，计算胰蛋白酶活性单位。
2.2 蛋白酶抑制剂的筛选
配制：单—酶抑制剂AP，PMSF，SPⅠ1及SPⅠ2，质量分数均为2mg/ml；复合酶抑制剂SPⅠ2与ET复合配制，前者质量分数为2mg/ml，后者质量分数为10mg/ml。测定方法取单一抑制剂，复合抑制剂1ml与1ml胰酶，3mlpH7.0磷酸缓冲液混合，使胰酶终质量分数为80μg/ml。各管在37℃保温2h，按照福林-酚试剂法测定各管中胰蛋白酶活性。做空白对照。
2.3 复合酶抑制剂对胰酶活性抑制曲线的绘制
精密量取质量分数为2mg/ml,SPⅠ20.05ml,0.10ml,0.20ml,0.30ml,0.50ml,0.80ml和1.00ml与质量分数为10mg/mlET1ml,胰酶1ml混合均匀，再分别加入pH7.0磷酸盐缓冲液，使其总体积为5.00ml，胰酶质量分数为80μg/ml，各管在37℃保温2h，按照福林-酚试剂法测定各管中胰蛋白酶的活性。同时做空白对照。
, 百拇医药
2.4 胰岛素微球的制备
将胰岛素溶于0.1mol/LHCL中，丙烯酸树脂溶于乙醇中，这两种溶液混合均匀再高速搅拌下分散于液体石蜡中，加明胶溶液胶化得微球。
2.5 动物实验
体重约200g雄性wistar大鼠饥饿16h后，复合酶抑制剂微球(SPⅠ2+ET)灌胃，立即从尾静脉取空白血样1ml，0.5h后，给大鼠灌胃胰岛素微球(10IU/kg)，每间隔2h取一次血样直至10h，血样在1h内分离出血清，测定血糖值，并计算其与初始血糖的比值—相对血糖浓度。同时作对照实验，仅给大鼠胰岛素微球(10IU/kg)直接灌胃，同上测定不同时间的相对血糖值。
3 结 果
3.1 胰酶活性的标准曲线
, 百拇医药
胰酶系自猪、羊或牛胰中提取的多种酶的混合物，其中包括胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶、α-糜蛋白酶、弹性蛋白酶及羧肽酶等。以胰酶为代表可以近似模拟体内肠道环境，筛选出的酶抑制剂具有广谱性。用福林-酚试剂法测定胰酶活性的标准曲线如下，见Fig1。说明：胰酶质量分数在20μg/ml～80μg/ml范围内，其活性测定的光密度值与浓度呈线性相关。r=0.9996。
Fig 1 Standard course
3.2 各种酶抑制剂对胰酶抑制能力的比较
各种酶抑制剂分别与胰酶反应，再测定胰蛋白酶的剩余活性，计算抑制率，结果见表1。说明：4种单一酶抑制剂中SPI2的抑制率最高81.64%；复合酶抑制剂(SPI2+ET)的抑制率为95.80%；两者均较文献报道的AP效果好。且复合酶抑制剂优于单一抑制剂。
, 百拇医药
Tab 1 Effect of inhibitors Species
AP
PMSF
SPI1
SPI2
SPI2+ET
Inibitory fraction(%)
64.52
26.56
17.84
81.64
, 百拇医药
95.80
3.3 质量分数不同的复合酶抑制剂(SPI2+ET)对胰酶活性的影响
配制质量分数不同的(SPI2+ET)，与胰酶反应一定时间，测定胰蛋白酶的剩余活性，计算活性分数，结果见表2。说明随着抑制剂(SPI2+ET)用量的增加，胰酶活性逐渐降低。当SPI2的浓度为2mg/ml,ET的浓度为10mg/ml时，胰酶的活性降低至本试验的最大值。Tab2 Effect of inhibitor (SPI2+ET) No.
1
2
3
4
, http://www.100md.com
5
6
7
8
SPI2(mg)
—
0.10
0.20
0.40
0.60
1.00
1.60
2.00
, 百拇医药
ET(mg)
—
10
10
10
10
10
10
10
Pancreatin
active fraction(%)
100
59.20
, 百拇医药
32.46
20.01
18.01
8.18
4.36
2.86
3.4 动物降血糖结果
分别给体重200g的雄性Wistar大鼠灌胃酶抑制剂(SPI2+ET)肠溶微球和胰岛素肠溶微球，测定大鼠不同时相的血糖值，并做对照实验，结果见图2。说明在复合酶抑制剂(SPI2+ET)的保护下，胰岛素微球中的胰岛素可以被小肠吸收入血液循环，而产生明显的降血糖效果，大鼠血糖最低值仅为其0时刻的65.12%。
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Fig 2 Hypoglycemic effect of Insulin microspheres administered
orally to normal rats.Data represent means(n=2)
4 讨 论
作为胃肠道给药途径有关肠道酶的研究曾引起广泛兴趣，主要指十二指肠下端的酶，其中有胰蛋白酶，α-糜蛋白酶，弹性蛋白酶及羧肽酶A等。这些酶pH8时活性最强。该类酶中，前3种为内切酶，其水解位点各不相同：胰蛋白酶主要水解碱性氨基酸羧基侧的肽键；α-糜蛋白酶水解芳香族氨基酸羧基侧的肽键；弹性蛋白酶水解脂肪族氨基酸羧基侧的肽键。羧肽酶A是外切酶，主要作用于游离羧基。这几种酶有以下的共性：①大部分酶的活性中心含有ser，属于丝氨酸类蛋白酶。②它们的活性均受Ca2+的影响，即Ca2+对它们降解蛋白酶的活性有稳定和激活作用。本文针对肠道消化酶的这个共性，筛选出复合酶抑制剂(SPI2+ET)，SPI2是从一种植物中提取出的胰蛋白酶抑制剂，是属于丝氨酸类蛋白酶抑制剂；ET是一种金属螯合剂，它可以络合Ca2+离子，使肠道酶降解蛋白质的活性降低，这两种不同类型抑制剂的共同作用，保护了蛋白质类药物胰岛素免受肠道酶的破坏，从而通过肠道吸收进入血，使大鼠血糖下降。
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参考文献
1 朱俭，曹凯鸣，周润琦，等.生物化学实验.上海：上海科学技术出版设社，1981.186
2 陈琼华，梅美珍，杨继虞，等.生物化学(第二版).北京：人民卫生出版社，1991.280
3 KidronM, Baron H M,Berry E. The absorption of insulin from various reg ious of the rate intesine. Life sci, 1982,31(25)∶2837
4 Yamamoto A, Hayakawa, E H, Lee V. Insulin and proinsulin proteolysis in mucosal homogenates of the albino rabbit: Implications in peptide delivery form nonoral routes. Life Sci, 1990,47(26)：2465
5 Fujii S, Yokoyamat, Ikegaya K. Promoting effect of the new chymotrypsin inhibitor FK-448 on the intestinal absorption of insulin in rats and dogs. J Pharm Pharmacol,1985,37(8)∶545
收稿日期:1998-09-21, 百拇医药
单位：刘敏(上海医科大学药学院靶向制剂研究室，上海200032)；杨继虞(华西医科大学药学院生化教研室，成都610041)
关键词：蛋白酶抑制剂；胰岛素；血糖
药物生物技术990211 摘 要 以胰蛋白酶为代表，采用福林-酚试剂法，通过对各种类型蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶活性的抑制程度进行比较，筛选出一种广谱而价廉的复合蛋白酶抑制剂(SPI2+ET)，其对胰蛋白酶活性的抑制分数高达95%以上。以胰岛素作为模型药物，以(SPI2+ET)作为肠道消化酶抑制剂，制备胰岛素肠溶微球，灌胃可使正常大鼠产生明显的降血糖效果。
Study on Complex Protease Inhibitor
Liu Min, Yang Jiyu1
, http://www.100md.com
(Department of pharmacy,Shanghai Medical University,Shanghai 200032;
1Department of Pharmacy, West China Medical University, Chengdu 610041)
Abstract A complex protease inhibitor (SPI2+ET) is studied for protecting protein from degradating by enteric engymes. With FULIN-FEN mothod, the complex protease inhibitor(SPI2+ET) inhibits 95% pancreatin activity. Oral ente riccoated insulin microsphere can bring about a significant hypoglycemic effect. Experiment indicates the protection of complex inhibitor (SPI2+ET) apears to be a better method for oral administration of insulin.
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Key Words Protease Inhibitor, Insulin, Blood-suger
肠道消化酶的代谢作用是影响蛋白和多肽类药物口服吸收的主要因素之一，而蛋白酶抑制剂的使用可保护蛋白质和多肽类药物免受消化酶的降解作用的影响。常用的酶抑制剂品种较多，其中包括：杆菌肽，抑肽酶，胰蛋白抑制剂，1，10-邻二杂氮菲，对羟基汞基苯甲酸，有机磷化合物(DFP)及嘌呤霉素等，其中应用最广，效果较好的是抑肽酶。但是抑肽酶成本较高，应用受到限制，而且对蛋白酶活性的抑制作用并未达到理想的效果。为了筛选出一种有效而价廉的蛋白酶抑制剂，本文以胰酶为代表，以抑肽酶作为参比物，通过比较各种酶抑制剂对胰酶活性的抑制程度进行筛选。为了检测筛选出的酶抑制剂在体内的作用，本文以胰岛素作为蛋白和多肽类药物的代表，采用肠溶材料——丙烯酸树脂作囊材，通过相分离法制备了胰岛素肠溶微球，给大鼠灌胃，测定大鼠血糖值，同时做对照实验，观察含酶抑制剂的胰岛素微球的降血糖的作用。
1 材 料
, 百拇医药
1.1 主要试剂
抑肽酶(AP)、苯*****(PMSF)和胰蛋白酶抑制剂I(SPⅠ1)均为美国Sigma公司产品，胰蛋白酶抑制剂Ⅱ(SPⅠ2)为四川大学生物化学教研室制备，胰蛋白酶抑制剂Ⅲ(ET)为上海试剂一厂产品；胰酶为内江生化制药厂产品；丙烯酸树脂为连云港制碘厂产品；结晶猪胰岛素(27.5IU/mg)为徐州生化制药厂产品；血糖测定试剂盒为保定长城临床试剂公司产品。
1.2 主要仪器
721型分光光度计为上海第三分析仪器厂制造；D25-2型电动搅拌器为杭州仪表电机厂制造；800型离心沉淀器为上海手术器械厂制造。
2 实验方法
2.1 胰酶活性的测定
, 百拇医药
以酪蛋白为底物，与一定浓度的胰酶溶液加pH7.0的磷酸缓冲溶液保温2h，立即加入三氯醋酸溶液中止反应，滤过，用福林-酚试剂与滤液发生显色反应，紫外测定，计算胰蛋白酶活性单位。
2.2 蛋白酶抑制剂的筛选
配制：单—酶抑制剂AP，PMSF，SPⅠ1及SPⅠ2，质量分数均为2mg/ml；复合酶抑制剂SPⅠ2与ET复合配制，前者质量分数为2mg/ml，后者质量分数为10mg/ml。测定方法取单一抑制剂，复合抑制剂1ml与1ml胰酶，3mlpH7.0磷酸缓冲液混合，使胰酶终质量分数为80μg/ml。各管在37℃保温2h，按照福林-酚试剂法测定各管中胰蛋白酶活性。做空白对照。
2.3 复合酶抑制剂对胰酶活性抑制曲线的绘制
精密量取质量分数为2mg/ml,SPⅠ20.05ml,0.10ml,0.20ml,0.30ml,0.50ml,0.80ml和1.00ml与质量分数为10mg/mlET1ml,胰酶1ml混合均匀，再分别加入pH7.0磷酸盐缓冲液，使其总体积为5.00ml，胰酶质量分数为80μg/ml，各管在37℃保温2h，按照福林-酚试剂法测定各管中胰蛋白酶的活性。同时做空白对照。
, 百拇医药
2.4 胰岛素微球的制备
将胰岛素溶于0.1mol/LHCL中，丙烯酸树脂溶于乙醇中，这两种溶液混合均匀再高速搅拌下分散于液体石蜡中，加明胶溶液胶化得微球。
2.5 动物实验
体重约200g雄性wistar大鼠饥饿16h后，复合酶抑制剂微球(SPⅠ2+ET)灌胃，立即从尾静脉取空白血样1ml，0.5h后，给大鼠灌胃胰岛素微球(10IU/kg)，每间隔2h取一次血样直至10h，血样在1h内分离出血清，测定血糖值，并计算其与初始血糖的比值—相对血糖浓度。同时作对照实验，仅给大鼠胰岛素微球(10IU/kg)直接灌胃，同上测定不同时间的相对血糖值。
3 结 果
3.1 胰酶活性的标准曲线
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胰酶系自猪、羊或牛胰中提取的多种酶的混合物，其中包括胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶、α-糜蛋白酶、弹性蛋白酶及羧肽酶等。以胰酶为代表可以近似模拟体内肠道环境，筛选出的酶抑制剂具有广谱性。用福林-酚试剂法测定胰酶活性的标准曲线如下，见Fig1。说明：胰酶质量分数在20μg/ml～80μg/ml范围内，其活性测定的光密度值与浓度呈线性相关。r=0.9996。
Fig 1 Standard course
3.2 各种酶抑制剂对胰酶抑制能力的比较
各种酶抑制剂分别与胰酶反应，再测定胰蛋白酶的剩余活性，计算抑制率，结果见表1。说明：4种单一酶抑制剂中SPI2的抑制率最高81.64%；复合酶抑制剂(SPI2+ET)的抑制率为95.80%；两者均较文献报道的AP效果好。且复合酶抑制剂优于单一抑制剂。
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Tab 1 Effect of inhibitors Species
AP
PMSF
SPI1
SPI2
SPI2+ET
Inibitory fraction(%)
64.52
26.56
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81.64
, 百拇医药
95.80
3.3 质量分数不同的复合酶抑制剂(SPI2+ET)对胰酶活性的影响
配制质量分数不同的(SPI2+ET)，与胰酶反应一定时间，测定胰蛋白酶的剩余活性，计算活性分数，结果见表2。说明随着抑制剂(SPI2+ET)用量的增加，胰酶活性逐渐降低。当SPI2的浓度为2mg/ml,ET的浓度为10mg/ml时，胰酶的活性降低至本试验的最大值。Tab2 Effect of inhibitor (SPI2+ET) No.
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SPI2(mg)
—
0.10
0.20
0.40
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ET(mg)
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Pancreatin
active fraction(%)
100
59.20
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32.46
20.01
18.01
8.18
4.36
2.86
3.4 动物降血糖结果
分别给体重200g的雄性Wistar大鼠灌胃酶抑制剂(SPI2+ET)肠溶微球和胰岛素肠溶微球，测定大鼠不同时相的血糖值，并做对照实验，结果见图2。说明在复合酶抑制剂(SPI2+ET)的保护下，胰岛素微球中的胰岛素可以被小肠吸收入血液循环，而产生明显的降血糖效果，大鼠血糖最低值仅为其0时刻的65.12%。
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Fig 2 Hypoglycemic effect of Insulin microspheres administered
orally to normal rats.Data represent means(n=2)
4 讨 论
作为胃肠道给药途径有关肠道酶的研究曾引起广泛兴趣，主要指十二指肠下端的酶，其中有胰蛋白酶，α-糜蛋白酶，弹性蛋白酶及羧肽酶A等。这些酶pH8时活性最强。该类酶中，前3种为内切酶，其水解位点各不相同：胰蛋白酶主要水解碱性氨基酸羧基侧的肽键；α-糜蛋白酶水解芳香族氨基酸羧基侧的肽键；弹性蛋白酶水解脂肪族氨基酸羧基侧的肽键。羧肽酶A是外切酶，主要作用于游离羧基。这几种酶有以下的共性：①大部分酶的活性中心含有ser，属于丝氨酸类蛋白酶。②它们的活性均受Ca2+的影响，即Ca2+对它们降解蛋白酶的活性有稳定和激活作用。本文针对肠道消化酶的这个共性，筛选出复合酶抑制剂(SPI2+ET)，SPI2是从一种植物中提取出的胰蛋白酶抑制剂，是属于丝氨酸类蛋白酶抑制剂；ET是一种金属螯合剂，它可以络合Ca2+离子，使肠道酶降解蛋白质的活性降低，这两种不同类型抑制剂的共同作用，保护了蛋白质类药物胰岛素免受肠道酶的破坏，从而通过肠道吸收进入血，使大鼠血糖下降。
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参考文献
1 朱俭，曹凯鸣，周润琦，等.生物化学实验.上海：上海科学技术出版设社，1981.186
2 陈琼华，梅美珍，杨继虞，等.生物化学(第二版).北京：人民卫生出版社，1991.280
3 KidronM, Baron H M,Berry E. The absorption of insulin from various reg ious of the rate intesine. Life sci, 1982,31(25)∶2837
4 Yamamoto A, Hayakawa, E H, Lee V. Insulin and proinsulin proteolysis in mucosal homogenates of the albino rabbit: Implications in peptide delivery form nonoral routes. Life Sci, 1990,47(26)：2465
5 Fujii S, Yokoyamat, Ikegaya K. Promoting effect of the new chymotrypsin inhibitor FK-448 on the intestinal absorption of insulin in rats and dogs. J Pharm Pharmacol,1985,37(8)∶545
收稿日期:1998-09-21, 百拇医药