柱层析法制备高纯人血FIX研究初探
作者：蔡骏 张捷 张静 刘颖 初毅波 李南林 张丽丽
单位：成都生物制品研究所第一研究室，成都610063
关键词：凝血酶原复合物；人凝血因子Ⅸ；人凝血因子Ⅱ
摘 要 鉴于临床上对高纯病毒灭活制剂的要求 摘 要 鉴于临床上对高纯病毒灭活制剂的要求，建立了以人新鲜血浆为原料，用DEAE-Sephadex A50,DEAE-Sepharose FF和Heparin-Sepharose CL-6B制备高纯度FⅨ的方法，FⅨ比活为35±2.0IU/mg，回收率为30±4%，纯化3500倍。此工艺在制备高纯度FⅨ方面有很好的规模化前景。
Preliminary Research of Preparation of Highly Purified Human
, http://www.100md.com Plasma FactorⅨ with Conventional Chromatography
Cai Jun， Zhang Jie， Zhang Jing, Liu Ying, Chu Yibo, Li Nanglin， Zhang Lili
(First Resarch Department Cheng Du Institute of Biological Products Chengdu 610063)
Abstract A highly Purified Human Plasma FactorⅨ has been prepared from pooled Human plas ma by using conventional chromatography procedure combining three Steps based on DEAE ion exchange and Heparin affinity.The spcific activity of the product was 35±2IU/mg(n=10),Corresponding to purification factor of about 3500.
, 百拇医药
Key Word PCC, FⅨ, FⅡ, S/D method,lipid enveloped virus
乙型血友病的治疗方法现今仍为含有FⅨ的制剂如凝血酶原复合物(Prothrom in Complex Concentrate,PCC)或高纯度FⅨ的替代疗法。PCC是以血浆为原料经过一步阴离子层析吸附制得，比活一般为0.7～1.5IU/mg，较血浆大约提纯50～100倍，除FⅨ外，PCC一般还含有维生素K依赖蛋白如FⅡ(人凝血因子Ⅱ)，FⅦ(人凝血因子Ⅶ)，FⅩ(人凝血因子Ⅹ)，由于生产工艺的差异，还可能含有蛋白C，S，ITI(间α胰蛋白酶抑制剂)，高分子激肽原，C4C5，C9(补体4，5，9)[1]，长期输注PCC制品有可能会引发广泛性静脉栓塞。[2]Menache应用DEAE-Sephadex和DextranSulfate两步层析制备得到比活接近于10IU/mgFⅨ制品，[3]本文在此报道一种采用离子交换及肝素亲和层析制备高纯度人血FⅨ的工艺。
, http://www.100md.com
1 材料和仪器
血浆 本所血源室提供
DEAE-Sephadex A50,DEAE-Sepharose FF,Heparin-Sepharose CL-6B 均为瑞典Pharmaci a公司出品
层析柱 Φ1.6×40cm 瑞典LKB公司
Φ1.6×25cm 上海锦化仪器公司
超滤器 日本密滤膜公司
2 方 法
2.1 分离方法
, 百拇医药
2.1.1 DEAE-SephadexA50吸附 15g DEAE-Sephadex A50在pH7.0，0.075mol/LNaCl中溶胀，并在121℃灭菌30min。取新鲜血浆10L，多层纱布过滤，加入经预处理的A50凝胶4℃搅拌45min，分离凝胶及血浆。血浆用来制作白、球蛋白。用含0.01mol/L枸椽酸钠，0.2mol/LNaCl，pH7.01L三次洗涤凝胶后用含0.01mol/L枸椽酸钠，2mol/LNaCl,pH6.00.1L两次洗脱PCC，洗脱液超滤(Mr10000)透析除盐到生理盐水水平以下。尽快-20℃深冻。
2.1.2 DEAE-SepharoseFF层析 DEAE-SepharoseFF层析柱用0.006mol/L磷酸盐缓冲液pH6.0平衡。取A50PCC37℃融化后上样。洗脱液为含有0.005mol/L枸椽酸钠，0.05mol/L磷酸盐pH6.0的缓冲液，并含有0.16mol/L,0.19mol/L和0.28mol/LNaCl洗脱杂蛋白。DEAEPCC洗脱用pH8.0的同样缓冲液，含有0.36mol/LNaCl。
, http://www.100md.com
2.1.3 Heparin-SepharoseCL-6B层析
Heparin-SepharoseCL-6B层析柱用0.02mol/L枸椽酸钠pH7.4平衡。用DEAEPCC上样，平衡液洗涤，用同样的缓冲液含有0.25mol/LNaCl洗脱杂蛋白，再用0.35mol/LNaCl洗脱FIX。
2.2 检测方法
2.2.1 FIX凝固活性 高岭土凝血部分活酶时间(KPTT)法[4]，FⅡ凝固活性 凝血酶原时间(PT)法[4]。
2.2.2 凝血酶活性测定 参考文献[5]。
2.2.3 SDS-PAGE 分离胶15%，采用低Mr标准蛋白。
, http://www.100md.com
2.2.4 蛋白浓度 微量双缩脲法。
2.2.5 微量免疫电泳 按Grabbar-Wiliams immunoelectrophoresis法进行，兔抗人血清来自成都输血所。
3 结 果
3.1 FIX提纯 FIX纯化结果见表1。
Tab 1 FIX Purification
Protein
concentration(%)
Specific
acitivity(IU/mg)
, 百拇医药
Purfication factor
FIX
activity
Plasma
5.2±0.2
0.01±0.005
A50 PCC
3.0±0.3
1.0±0.21
100
(70±5)%
DEAE-SepharoseFF PCC
, 百拇医药
0.1±0.05
6.8±0.2
680
(50±5)%
Heparin-SepharoseCL-6B FIX
0.01±0.005
35±2
3500
(85±5)%
3.2 SDS-PAGE结果
SDS-PAGE结果见图1。
, 百拇医药
1.FIX；2.DEAE PCC；3.A50 PCC；
4.Plasma；5.Standard protein
Fig 1 Results of SDS-PAGE
3.3 免疫电泳结果
免疫电泳结果见图2。
1.A50 PCC;2.DEAE PCC;3.FIX against an anti-PCC plasma rabbit immune serum.
Fig 2 Results of immunoelectroporesis
, 百拇医药
4 讨 论
1)采用本工艺路线制备FIX比活为35IU/mg，已达到高纯制品的要求，而且FⅡ含量极低，几乎为基质乏FⅡ因子水平。DEAE-SephadexA50批量吸附FIX活性回收率约为70%；DEAE-SepharoseFFPCCFIX活性回收率约50%；Heparin-SepharoseCL-6B层析FIX活性回收率约85%；整个工艺总回收率约30%。
2)SDS-PAGE结果显示了血浆，A50PCC，DEAEPCC，FIX逐级纯化效果，而FIX仅含有两条带，大约Mr68000-69000为FIX，而另一带可能为ITI，与国外文献报导一致。现今为止只有单克隆抗体亲和层析才能达到单条带的电泳结果。
3)微量免疫电泳显示PCC中所含有白蛋白、球蛋白沉淀线在FIX制剂的免疫电泳图谱没有出现，显示了纯化效果。
4)凝血酶活性为阴性，揭示这种制剂是安全的，致静脉血栓的可能性极低。
, 百拇医药
5)我们也进行过S/D法[6]对FIX制剂病毒灭活试验，得到初步结果是，S/D试剂对FIX活性是安全的，今后采用S/D灭活病毒对FIX活性回收是有保障的。
6)该工艺和S/D法结合非常容易，有机溶剂和去污剂可在离子交换剂或亲和层析上；轻易去除，不需另附加去除病毒措施，如果再增加BMM膜去除病毒措施[7]，病毒安全性方面更有保障。
7)该工艺路线不仅能制备FIX，FⅡ，FⅦ，FⅩ等血浆组分均能在各个层析分离峰中回收，因此在血浆综合利用方面很有应用价值。
8)工艺流程中有制品融化过程，对FⅨ活性有影响，若在温度控制、工艺连续性及工艺参数方面进一步优化，纯化效果可能还会提高。
参考文献
1 Burnouf T,Michalski C,Goudemand M,et al.Properties of a Highly Purified Human Plasma Factor Ⅸ:C Therapeutic concentrate prepared by conventiona l chromatography. Vox Sang,1989,59(1)∶225
, 百拇医药
2 Kohler M,Heiden M,Harbaneur G,el al.Comparison of different prothrombin complex concentrate in vitro and vivo studies.Thromb Res,1990,60(1)∶63
3 Menache M,Behre H E.Orthner C,et al.Conagulation factor Ⅸ Concentrate:M ethod of proparation and assessment of potential vivo thrombenicity in animal mo dal.Blood, 1984,64(4)∶1220
4 王海龄，耿力，丁卫，等.单克隆抗体免疫亲和层析法纯化人的凝血因子Ⅸ.中国输血杂志，1989，2(3)∶111
5 中国生物制品规程.一部.北京：中国人口出版社1995.248
6 Horowitz B.Wiebe M E,Lippin A,et al.Inactivation of viruses of in lablie blood derivatives I.Disruption of lipid enveloped viruses by tri(n-butyl)phosp hate detergent combination.Tramsfusion.1985,25(2)∶516
7 刘世维，倪道明，吕临红，等.BMM膜病毒过滤系统在血液制品中使用初步研究.中国输血杂志，1994，7(增刊)∶36
收稿日期:1998-11-30, http://www.100md.com
单位：成都生物制品研究所第一研究室，成都610063
关键词：凝血酶原复合物；人凝血因子Ⅸ；人凝血因子Ⅱ
摘 要 鉴于临床上对高纯病毒灭活制剂的要求 摘 要 鉴于临床上对高纯病毒灭活制剂的要求，建立了以人新鲜血浆为原料，用DEAE-Sephadex A50,DEAE-Sepharose FF和Heparin-Sepharose CL-6B制备高纯度FⅨ的方法，FⅨ比活为35±2.0IU/mg，回收率为30±4%，纯化3500倍。此工艺在制备高纯度FⅨ方面有很好的规模化前景。
Preliminary Research of Preparation of Highly Purified Human
, http://www.100md.com Plasma FactorⅨ with Conventional Chromatography
Cai Jun， Zhang Jie， Zhang Jing, Liu Ying, Chu Yibo, Li Nanglin， Zhang Lili
(First Resarch Department Cheng Du Institute of Biological Products Chengdu 610063)
Abstract A highly Purified Human Plasma FactorⅨ has been prepared from pooled Human plas ma by using conventional chromatography procedure combining three Steps based on DEAE ion exchange and Heparin affinity.The spcific activity of the product was 35±2IU/mg(n=10),Corresponding to purification factor of about 3500.
, 百拇医药
Key Word PCC, FⅨ, FⅡ, S/D method,lipid enveloped virus
乙型血友病的治疗方法现今仍为含有FⅨ的制剂如凝血酶原复合物(Prothrom in Complex Concentrate,PCC)或高纯度FⅨ的替代疗法。PCC是以血浆为原料经过一步阴离子层析吸附制得，比活一般为0.7～1.5IU/mg，较血浆大约提纯50～100倍，除FⅨ外，PCC一般还含有维生素K依赖蛋白如FⅡ(人凝血因子Ⅱ)，FⅦ(人凝血因子Ⅶ)，FⅩ(人凝血因子Ⅹ)，由于生产工艺的差异，还可能含有蛋白C，S，ITI(间α胰蛋白酶抑制剂)，高分子激肽原，C4C5，C9(补体4，5，9)[1]，长期输注PCC制品有可能会引发广泛性静脉栓塞。[2]Menache应用DEAE-Sephadex和DextranSulfate两步层析制备得到比活接近于10IU/mgFⅨ制品，[3]本文在此报道一种采用离子交换及肝素亲和层析制备高纯度人血FⅨ的工艺。
, http://www.100md.com
1 材料和仪器
血浆 本所血源室提供
DEAE-Sephadex A50,DEAE-Sepharose FF,Heparin-Sepharose CL-6B 均为瑞典Pharmaci a公司出品
层析柱 Φ1.6×40cm 瑞典LKB公司
Φ1.6×25cm 上海锦化仪器公司
超滤器 日本密滤膜公司
2 方 法
2.1 分离方法
, 百拇医药
2.1.1 DEAE-SephadexA50吸附 15g DEAE-Sephadex A50在pH7.0，0.075mol/LNaCl中溶胀，并在121℃灭菌30min。取新鲜血浆10L，多层纱布过滤，加入经预处理的A50凝胶4℃搅拌45min，分离凝胶及血浆。血浆用来制作白、球蛋白。用含0.01mol/L枸椽酸钠，0.2mol/LNaCl，pH7.01L三次洗涤凝胶后用含0.01mol/L枸椽酸钠，2mol/LNaCl,pH6.00.1L两次洗脱PCC，洗脱液超滤(Mr10000)透析除盐到生理盐水水平以下。尽快-20℃深冻。
2.1.2 DEAE-SepharoseFF层析 DEAE-SepharoseFF层析柱用0.006mol/L磷酸盐缓冲液pH6.0平衡。取A50PCC37℃融化后上样。洗脱液为含有0.005mol/L枸椽酸钠，0.05mol/L磷酸盐pH6.0的缓冲液，并含有0.16mol/L,0.19mol/L和0.28mol/LNaCl洗脱杂蛋白。DEAEPCC洗脱用pH8.0的同样缓冲液，含有0.36mol/LNaCl。
, http://www.100md.com
2.1.3 Heparin-SepharoseCL-6B层析
Heparin-SepharoseCL-6B层析柱用0.02mol/L枸椽酸钠pH7.4平衡。用DEAEPCC上样，平衡液洗涤，用同样的缓冲液含有0.25mol/LNaCl洗脱杂蛋白，再用0.35mol/LNaCl洗脱FIX。
2.2 检测方法
2.2.1 FIX凝固活性 高岭土凝血部分活酶时间(KPTT)法[4]，FⅡ凝固活性 凝血酶原时间(PT)法[4]。
2.2.2 凝血酶活性测定 参考文献[5]。
2.2.3 SDS-PAGE 分离胶15%，采用低Mr标准蛋白。
, http://www.100md.com
2.2.4 蛋白浓度 微量双缩脲法。
2.2.5 微量免疫电泳 按Grabbar-Wiliams immunoelectrophoresis法进行，兔抗人血清来自成都输血所。
3 结 果
3.1 FIX提纯 FIX纯化结果见表1。
Tab 1 FIX Purification
Protein
concentration(%)
Specific
acitivity(IU/mg)
, 百拇医药
Purfication factor
FIX
activity
Plasma
5.2±0.2
0.01±0.005
A50 PCC
3.0±0.3
1.0±0.21
100
(70±5)%
DEAE-SepharoseFF PCC
, 百拇医药
0.1±0.05
6.8±0.2
680
(50±5)%
Heparin-SepharoseCL-6B FIX
0.01±0.005
35±2
3500
(85±5)%
3.2 SDS-PAGE结果
SDS-PAGE结果见图1。
, 百拇医药
1.FIX；2.DEAE PCC；3.A50 PCC；
4.Plasma；5.Standard protein
Fig 1 Results of SDS-PAGE
3.3 免疫电泳结果
免疫电泳结果见图2。
1.A50 PCC;2.DEAE PCC;3.FIX against an anti-PCC plasma rabbit immune serum.
Fig 2 Results of immunoelectroporesis
, 百拇医药
4 讨 论
1)采用本工艺路线制备FIX比活为35IU/mg，已达到高纯制品的要求，而且FⅡ含量极低，几乎为基质乏FⅡ因子水平。DEAE-SephadexA50批量吸附FIX活性回收率约为70%；DEAE-SepharoseFFPCCFIX活性回收率约50%；Heparin-SepharoseCL-6B层析FIX活性回收率约85%；整个工艺总回收率约30%。
2)SDS-PAGE结果显示了血浆，A50PCC，DEAEPCC，FIX逐级纯化效果，而FIX仅含有两条带，大约Mr68000-69000为FIX，而另一带可能为ITI，与国外文献报导一致。现今为止只有单克隆抗体亲和层析才能达到单条带的电泳结果。
3)微量免疫电泳显示PCC中所含有白蛋白、球蛋白沉淀线在FIX制剂的免疫电泳图谱没有出现，显示了纯化效果。
4)凝血酶活性为阴性，揭示这种制剂是安全的，致静脉血栓的可能性极低。
, 百拇医药
5)我们也进行过S/D法[6]对FIX制剂病毒灭活试验，得到初步结果是，S/D试剂对FIX活性是安全的，今后采用S/D灭活病毒对FIX活性回收是有保障的。
6)该工艺和S/D法结合非常容易，有机溶剂和去污剂可在离子交换剂或亲和层析上；轻易去除，不需另附加去除病毒措施，如果再增加BMM膜去除病毒措施[7]，病毒安全性方面更有保障。
7)该工艺路线不仅能制备FIX，FⅡ，FⅦ，FⅩ等血浆组分均能在各个层析分离峰中回收，因此在血浆综合利用方面很有应用价值。
8)工艺流程中有制品融化过程，对FⅨ活性有影响，若在温度控制、工艺连续性及工艺参数方面进一步优化，纯化效果可能还会提高。
参考文献
1 Burnouf T,Michalski C,Goudemand M,et al.Properties of a Highly Purified Human Plasma Factor Ⅸ:C Therapeutic concentrate prepared by conventiona l chromatography. Vox Sang,1989,59(1)∶225
, 百拇医药
2 Kohler M,Heiden M,Harbaneur G,el al.Comparison of different prothrombin complex concentrate in vitro and vivo studies.Thromb Res,1990,60(1)∶63
3 Menache M,Behre H E.Orthner C,et al.Conagulation factor Ⅸ Concentrate:M ethod of proparation and assessment of potential vivo thrombenicity in animal mo dal.Blood, 1984,64(4)∶1220
4 王海龄，耿力，丁卫，等.单克隆抗体免疫亲和层析法纯化人的凝血因子Ⅸ.中国输血杂志，1989，2(3)∶111
5 中国生物制品规程.一部.北京：中国人口出版社1995.248
6 Horowitz B.Wiebe M E,Lippin A,et al.Inactivation of viruses of in lablie blood derivatives I.Disruption of lipid enveloped viruses by tri(n-butyl)phosp hate detergent combination.Tramsfusion.1985,25(2)∶516
7 刘世维，倪道明，吕临红，等.BMM膜病毒过滤系统在血液制品中使用初步研究.中国输血杂志，1994，7(增刊)∶36
收稿日期:1998-11-30, http://www.100md.com