联产人尿激肽释放酶的纯化工艺
作者：何国振 汤丽云 郑丽君
单位：何国振 郑丽君(广东燕塘生物化学药业有限公司，广州510507)；汤丽云(华南农业大学生物技术学院，广州510642)
关键词：人尿激肽释放酶；亲和层析；分离纯化
药物生物技术990209 摘 要 为解决联产工艺人尿激肽释放酶(HUKN)的纯化，用CM-Sepharose FF、D EAE-Sepharose FF和Aprotinin-Sepharose CL-4B亲和层析柱纯化HUKN，可得到HPLC单峰、比活性293.9EU/mg的产品。收率为48.6%。本工艺简单、容易放大，能适合大规模生产的需要。
Human Urinary Kallikrein Purification Combined
with Urinary Trypsin Inh ibitor
, 百拇医药
He Guozhen, Tang Liyun1, Zheng Lijun
(Gungdong Yantang Biochemistry Pharmaceutical Co., Ltd., Guangzhou 510 507; 1 Biotechnology college, South China Agricultural University, Guangzh ou 510642)
Abstract The purification method of human urinary kallikrein (HU KN) combined with urinary trypsin inhibitor was reported. HUKN had been purified by use of CM-Sepharose FF, DEAE-Sepharose FF and Aprotinin-Sepharose CL-4B chromatography. The purified HUKN with a specific activity of 293.9 EU/mg pro tein and the recovery rate of 48.6% was a single peak on HPLC. The technology is simple, and can be enlarged easily. It fits in with the need of HUKN manufac ture.
, 百拇医药
Key Words Human Urinary Kallikrein, Affinity chromatography, Is olation and Purification
Frey和他的同事于1926年在人尿中发现了人尿激肽释放酶[1][Hum an Urinary Kallikrein(EC3.4.21.8),HUKN]。HUKN是一种丝氨酸蛋白酶，它通过限制性蛋白水解作用，从激肽原释放激肽，它对其它蛋白没有或有很弱的水解活性[2]。
来源于猪的胰腺或颌下腺的激肽释放酶已被制成药品应用于临床，治疗高血压、心绞痛、冠状动脉硬化、男性不育症、微循环障碍等疾病[3，4]。未见有用HUKN制成药品上市的报道，如能用HUKN作药品，它应优于来源于猪的胰腺或颌下腺的激肽释放酶。
国外已有报道HUKN分离纯化的方法[1，2，5，6]，这些方法因步骤繁琐，应用于工业化生产尚有一定的困难[7]。国内阎家麒等报道了HUKN的生产工艺[7]，得到了比活性为28U/mg的产品；他们还报道了人尿胰蛋白酶抑制剂(HUTI)与HUKN联产纯化的方法[8]，他们顺序地先纯化HUKN，后纯化HUTI。本文根据我们的生产实践，报道另一条联产HUKN的工艺，与阎家麒等报道的方法相反，我们顺序地先纯化HUTI，后纯化HUKN。本文只报道利用生产HUTI时某步骤的废弃物纯化HUKN的方法。该工艺简单、容易放大，纯化的HUKN纯度高，可进行规模化生产。
, 百拇医药
1 材 料
1.1 原料
生产HUTI时某纯化步骤的废弃物。
1.2 试剂
DEAE-Sepharose FF, CM-Sepharose FF, Sepharose CL-4B为瑞典Pharmacia公司产品，醋酸及其它试剂均为国产化学纯或分析纯试剂。抑肽酶为自制产品，纯度为HPLC单峰，比活性为大于6500KIU/mg。
2 方 法
2.1 测定方法
激肽释放酶的活力测定按文献[9]进行；蛋白含量测定按Lowry法[10]；高效液相色谱：Waters高效液相色谱仪、Biosepsec-s2000(300×7.8mm)色谱柱、流动相为0.02mol/L,pH6.8 KH2PO4-Na2HPO4(含0.25NaCl)缓冲液。
, 百拇医药
2.2 Aprotinin-Sepharose CL-4B的制备
取1000ml Sepharose CL-4B,加150g CNBr活化，洗净后加入8×107KIU的抑肽酶，4℃下反应18h，然后依次用下述溶液洗涤：碳酸氢钠缓冲液0.1mol/L；Tris-HCl缓冲液(pH7.5)0.2mol/L；醋酸钠缓冲液(pH4.0)0.1mol/L(含1.0mol/LNaCl)；乙醇胺(pH8.0)0.1mol/L及水。洗净后即可装柱使用。
2.3 样品处理
将从生产人尿胰蛋白酶抑制剂时某纯化步骤取得的废弃液用10000u的超滤膜超滤去盐，同时，用0.1mol/L NaAc-HAc(pH4.0)缓冲液置换，并将体积减至最少。待上柱用。
3 结 果
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3.1 CM-Sepharose FF柱层析
用0.1mol/L NaAc-HAc(pH4.0)缓冲液平衡CM-Sepharose FF柱，将处理过的样品上柱，用平衡缓冲液冲洗后再用含0.3mol/LNaCl的平衡缓冲液洗脱，收集洗脱液部分，结果见图1。
Column:2.6cm×50cm; Starting & Washing buffer:0.1mol/L,pH4.0 Na Ac-HAc bu ffer;
Eluent:0.1mol/L,pH4.0 NaAc-HAc buffer containing 0.3mol/L NaCl.
Fig 1 CM-Sepharose FF Chromatography of HUKN
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3.2 DEAE-Sepharose FF柱层析
将从CM-Sepharose FF柱层析收集的洗脱液上经0.05 mol/L, pH6.7 Na2HPO4-NaH2PO4(含0.1mol/L NaCl)缓冲液平衡好的DEAE-Sepha rose FF柱，用0.15mol/L,pH6.7Na2HPO4-NaH2PO4(含0.1mol/L NaCl)缓冲 液冲洗后再用0.3mol/L,pH6.7 Na2HPO4-NaH2PO4(含0.1mol/L NaCl)缓冲 液洗脱，收集洗脱液部分，结果见图2。
, 百拇医药 Column:2.6cm×50 cm; Starting buffer: 0.05mol/L, pH6.7 Na2HPO4-NaH2PO4 buffer
containing 0.1mol/L NaCl;Washing buffer:0.15 mol/L,pH6.7Na2HPO4-NaH2PO4 buffer containing 0.1mol/l NaCl;
Eluent:0.3 mol/L,pH 6.7 Na2HPO4- NaH2PO4 buffer containing 0.1mol/L NaCl.
, 百拇医药
Fig 2 DEAE-Sepharose FF Chromatography of HUKN
3.3 Aprotinin-Sepharose CL-4B柱层析
将从DEAE-Sepharose FF柱层析收集的洗脱液部分上经0.1mol/L,pH7.8Na2HPO4-NaH2PO4(含0.1mol/LNaCl)的平衡缓冲液平衡好的Aprotinin-SepharoseCL-4B柱，用0.1mol/L,pH7.0Na2HPO4-NaH2PO4(含0.1mol/LNaCl)缓冲液冲洗后，用0.1mol/L，pH3.5NaAc-HAc缓冲液洗脱，收集洗脱液部分，结果见图3。
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Column:1.6cm×25cm; Starting buffer: 0.1 mol/L, pH7.8 Na2HPO 4-NaH2PO4 buffer
containing 0.1mol/L NaCl; Washing buffer: 0.1 mol/L,Ph7.0 Na2HPO 4-NaH2PO4 buffer
containing 0.1mol/L NaCl; Eluent: 0.1 mol/L, pH3.5 NaA c-HAc
Fig 3 Aprotinin-Sepharose CL-4B Chromatography of HUKN
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3.4 人尿激肽释放酶纯化 结果见表1。
Tab 1 Purification of Human Urinary Kallikrein Step
Total Protein
(mg)
Total Act.
(EU)
Sp.Act.
(EU/mg)
Yield
( %)
Purif.
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Factor
Staring Material
14146.2
22634
1.6
100
(1)
CM-Spharose FF
4266.5
17066
4.0
75.4
, 百拇医药
2.5
DEAE-Sepharose FF
995.9
11951
12.0
52.8
7.5
Aprotinin-Sepharose CL-4B
37.4
11000
293.9
48.6
, 百拇医药
183.7
3.5 高效液相层析
从Aprotinin-Sepharose CL-4B柱洗脱下的HUKN经超滤去盐浓缩，经高效液相层析，得一个峰，见图4。
Support: Biosep sec-s200 7.8mm×300mm
Buffer:0.02mmol/L,pH6.8 KH2PO4-Na2HPO4 buffer containing 0.25mol /L NaCl
Flow rate:0.5 ml/min
, 百拇医药
Detection:UV 280nm
Fig 4 HPLC of Human Urinary Kallikrein
4 讨 论
本文用简单而又极其有效的方法提纯了从生产HUTI废弃物中来的HUKN。HUKN是单链氨基酸序列的糖蛋白[5，6]，HPLC单峰结果表明HUKN的纯度很高。前人使用了各种各样的方法提纯以人尿为起始原料的HUKN[1，2，5，6，7，8，11，12]，包括DEAE-SephadexA-50层析；SephadexG-25、SephadexG-100、SephadexG-150、SephacrylS-200凝胶过滤；Aprotinin-Sepharose CL-4B亲和层析等，得到了不同纯度的HUKN。本文以从生产人尿胰蛋白酶抑制剂废弃物中的HUKN为起始原料，而且基于从大规模生产方面考虑，做到上样量大、层析速度快、产品纯度高、工艺放大容易，有机地将CM-SephroseFF、DEAE-SephroseFF和亲和层析结合起来，生产出高纯度的HUKN。CM-SephroseFF层析可去除产品所含的微黄色，而且柱子再生容易，因此设计在层析的第一步；DEAE-Sephrose FF层析进一步纯化，利于下一步的亲和层析；Aprotinin-SephroseCL-4B层析将HUKN的比活提高了一百多倍，得到单峰的产品。本工艺简单、容易放大，能适合大规模生产的需要。
, 百拇医药
参考文献
1 Matsuda Y, Miyazaki K, Moriya H, et al. Studies on urinary kall ikreins. I. Purification and characterization of human urinary kallikreins. J Biochem,1976，80(4)∶671
2 Geiger R, Fritz H. Human urinary kallikrein. In:Methods In Enzymology,1981,80∶466
3 张天民.血管舒缓素的生产工艺和临床应用.生化药物杂志，1984，4(1)∶1
4 金夕坤.胰激肽释放酶国外临床概况.生化药物杂志，1984，4(1)∶61
, http://www.100md.com
5 Ole-MoiYoi O, Spragg J, Austen K F. Structural studies of human urina ry kallikrein(Urokallikrein).Proc Natl Acad Sci, 1979,76(7)∶3121
6 Lottspeich F, Geiger R, Henschen A, et al. N-terminal amino acid seque nce of human urinary kallikrein homology with other serine proteases. Hoppe- Seyler′s Z Physio Chem, 1979，360∶1947
7 阎家麒，李德印.人尿激肽释放酶生产工艺研究.生化药物杂志，1991，11(1)∶72
8 阎家麒，戴承铨，朱建梅，等.人尿胰蛋白酶抑制剂与激肽释放酶联产及纯化的研 究.中国生化药物杂志，1992，12(1)∶9
, http://www.100md.com
9 上海药品标准.上海：上海人民出版社，1980∶120
10 Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,et al. Protein measurement with the F olin-phenol reagent.J Biol Chem,1951,193:265
11 Hial V,Diniz C R, Mares-guia M. Purification and properties of a huma n urinary kallikrein(Kininogenase). Biochemistry,1974,13(21)∶4 311
12 Morichi S, Sako E, Hasegawa E, et al, Large-Scale purification characte rization of human urinary kallikrein. Chem Pharm Bull, 1984,32( 3)∶1152
收稿日期:1998-08-08, 百拇医药
单位：何国振 郑丽君(广东燕塘生物化学药业有限公司，广州510507)；汤丽云(华南农业大学生物技术学院，广州510642)
关键词：人尿激肽释放酶；亲和层析；分离纯化
药物生物技术990209 摘 要 为解决联产工艺人尿激肽释放酶(HUKN)的纯化，用CM-Sepharose FF、D EAE-Sepharose FF和Aprotinin-Sepharose CL-4B亲和层析柱纯化HUKN，可得到HPLC单峰、比活性293.9EU/mg的产品。收率为48.6%。本工艺简单、容易放大，能适合大规模生产的需要。
Human Urinary Kallikrein Purification Combined
with Urinary Trypsin Inh ibitor
, 百拇医药
He Guozhen, Tang Liyun1, Zheng Lijun
(Gungdong Yantang Biochemistry Pharmaceutical Co., Ltd., Guangzhou 510 507; 1 Biotechnology college, South China Agricultural University, Guangzh ou 510642)
Abstract The purification method of human urinary kallikrein (HU KN) combined with urinary trypsin inhibitor was reported. HUKN had been purified by use of CM-Sepharose FF, DEAE-Sepharose FF and Aprotinin-Sepharose CL-4B chromatography. The purified HUKN with a specific activity of 293.9 EU/mg pro tein and the recovery rate of 48.6% was a single peak on HPLC. The technology is simple, and can be enlarged easily. It fits in with the need of HUKN manufac ture.
, 百拇医药
Key Words Human Urinary Kallikrein, Affinity chromatography, Is olation and Purification
Frey和他的同事于1926年在人尿中发现了人尿激肽释放酶[1][Hum an Urinary Kallikrein(EC3.4.21.8),HUKN]。HUKN是一种丝氨酸蛋白酶，它通过限制性蛋白水解作用，从激肽原释放激肽，它对其它蛋白没有或有很弱的水解活性[2]。
来源于猪的胰腺或颌下腺的激肽释放酶已被制成药品应用于临床，治疗高血压、心绞痛、冠状动脉硬化、男性不育症、微循环障碍等疾病[3，4]。未见有用HUKN制成药品上市的报道，如能用HUKN作药品，它应优于来源于猪的胰腺或颌下腺的激肽释放酶。
国外已有报道HUKN分离纯化的方法[1，2，5，6]，这些方法因步骤繁琐，应用于工业化生产尚有一定的困难[7]。国内阎家麒等报道了HUKN的生产工艺[7]，得到了比活性为28U/mg的产品；他们还报道了人尿胰蛋白酶抑制剂(HUTI)与HUKN联产纯化的方法[8]，他们顺序地先纯化HUKN，后纯化HUTI。本文根据我们的生产实践，报道另一条联产HUKN的工艺，与阎家麒等报道的方法相反，我们顺序地先纯化HUTI，后纯化HUKN。本文只报道利用生产HUTI时某步骤的废弃物纯化HUKN的方法。该工艺简单、容易放大，纯化的HUKN纯度高，可进行规模化生产。
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1 材 料
1.1 原料
生产HUTI时某纯化步骤的废弃物。
1.2 试剂
DEAE-Sepharose FF, CM-Sepharose FF, Sepharose CL-4B为瑞典Pharmacia公司产品，醋酸及其它试剂均为国产化学纯或分析纯试剂。抑肽酶为自制产品，纯度为HPLC单峰，比活性为大于6500KIU/mg。
2 方 法
2.1 测定方法
激肽释放酶的活力测定按文献[9]进行；蛋白含量测定按Lowry法[10]；高效液相色谱：Waters高效液相色谱仪、Biosepsec-s2000(300×7.8mm)色谱柱、流动相为0.02mol/L,pH6.8 KH2PO4-Na2HPO4(含0.25NaCl)缓冲液。
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2.2 Aprotinin-Sepharose CL-4B的制备
取1000ml Sepharose CL-4B,加150g CNBr活化，洗净后加入8×107KIU的抑肽酶，4℃下反应18h，然后依次用下述溶液洗涤：碳酸氢钠缓冲液0.1mol/L；Tris-HCl缓冲液(pH7.5)0.2mol/L；醋酸钠缓冲液(pH4.0)0.1mol/L(含1.0mol/LNaCl)；乙醇胺(pH8.0)0.1mol/L及水。洗净后即可装柱使用。
2.3 样品处理
将从生产人尿胰蛋白酶抑制剂时某纯化步骤取得的废弃液用10000u的超滤膜超滤去盐，同时，用0.1mol/L NaAc-HAc(pH4.0)缓冲液置换，并将体积减至最少。待上柱用。
3 结 果
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3.1 CM-Sepharose FF柱层析
用0.1mol/L NaAc-HAc(pH4.0)缓冲液平衡CM-Sepharose FF柱，将处理过的样品上柱，用平衡缓冲液冲洗后再用含0.3mol/LNaCl的平衡缓冲液洗脱，收集洗脱液部分，结果见图1。
Column:2.6cm×50cm; Starting & Washing buffer:0.1mol/L,pH4.0 Na Ac-HAc bu ffer;
Eluent:0.1mol/L,pH4.0 NaAc-HAc buffer containing 0.3mol/L NaCl.
Fig 1 CM-Sepharose FF Chromatography of HUKN
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3.2 DEAE-Sepharose FF柱层析
将从CM-Sepharose FF柱层析收集的洗脱液上经0.05 mol/L, pH6.7 Na2HPO4-NaH2PO4(含0.1mol/L NaCl)缓冲液平衡好的DEAE-Sepha rose FF柱，用0.15mol/L,pH6.7Na2HPO4-NaH2PO4(含0.1mol/L NaCl)缓冲 液冲洗后再用0.3mol/L,pH6.7 Na2HPO4-NaH2PO4(含0.1mol/L NaCl)缓冲 液洗脱，收集洗脱液部分，结果见图2。
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containing 0.1mol/L NaCl;Washing buffer:0.15 mol/L,pH6.7Na2HPO4-NaH2PO4 buffer containing 0.1mol/l NaCl;
Eluent:0.3 mol/L,pH 6.7 Na2HPO4- NaH2PO4 buffer containing 0.1mol/L NaCl.
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Fig 2 DEAE-Sepharose FF Chromatography of HUKN
3.3 Aprotinin-Sepharose CL-4B柱层析
将从DEAE-Sepharose FF柱层析收集的洗脱液部分上经0.1mol/L,pH7.8Na2HPO4-NaH2PO4(含0.1mol/LNaCl)的平衡缓冲液平衡好的Aprotinin-SepharoseCL-4B柱，用0.1mol/L,pH7.0Na2HPO4-NaH2PO4(含0.1mol/LNaCl)缓冲液冲洗后，用0.1mol/L，pH3.5NaAc-HAc缓冲液洗脱，收集洗脱液部分，结果见图3。
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Column:1.6cm×25cm; Starting buffer: 0.1 mol/L, pH7.8 Na2HPO 4-NaH2PO4 buffer
containing 0.1mol/L NaCl; Washing buffer: 0.1 mol/L,Ph7.0 Na2HPO 4-NaH2PO4 buffer
containing 0.1mol/L NaCl; Eluent: 0.1 mol/L, pH3.5 NaA c-HAc
Fig 3 Aprotinin-Sepharose CL-4B Chromatography of HUKN
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3.4 人尿激肽释放酶纯化 结果见表1。
Tab 1 Purification of Human Urinary Kallikrein Step
Total Protein
(mg)
Total Act.
(EU)
Sp.Act.
(EU/mg)
Yield
( %)
Purif.
, http://www.100md.com
Factor
Staring Material
14146.2
22634
1.6
100
(1)
CM-Spharose FF
4266.5
17066
4.0
75.4
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2.5
DEAE-Sepharose FF
995.9
11951
12.0
52.8
7.5
Aprotinin-Sepharose CL-4B
37.4
11000
293.9
48.6
, 百拇医药
183.7
3.5 高效液相层析
从Aprotinin-Sepharose CL-4B柱洗脱下的HUKN经超滤去盐浓缩，经高效液相层析，得一个峰，见图4。
Support: Biosep sec-s200 7.8mm×300mm
Buffer:0.02mmol/L,pH6.8 KH2PO4-Na2HPO4 buffer containing 0.25mol /L NaCl
Flow rate:0.5 ml/min
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Detection:UV 280nm
Fig 4 HPLC of Human Urinary Kallikrein
4 讨 论
本文用简单而又极其有效的方法提纯了从生产HUTI废弃物中来的HUKN。HUKN是单链氨基酸序列的糖蛋白[5，6]，HPLC单峰结果表明HUKN的纯度很高。前人使用了各种各样的方法提纯以人尿为起始原料的HUKN[1，2，5，6，7，8，11，12]，包括DEAE-SephadexA-50层析；SephadexG-25、SephadexG-100、SephadexG-150、SephacrylS-200凝胶过滤；Aprotinin-Sepharose CL-4B亲和层析等，得到了不同纯度的HUKN。本文以从生产人尿胰蛋白酶抑制剂废弃物中的HUKN为起始原料，而且基于从大规模生产方面考虑，做到上样量大、层析速度快、产品纯度高、工艺放大容易，有机地将CM-SephroseFF、DEAE-SephroseFF和亲和层析结合起来，生产出高纯度的HUKN。CM-SephroseFF层析可去除产品所含的微黄色，而且柱子再生容易，因此设计在层析的第一步；DEAE-Sephrose FF层析进一步纯化，利于下一步的亲和层析；Aprotinin-SephroseCL-4B层析将HUKN的比活提高了一百多倍，得到单峰的产品。本工艺简单、容易放大，能适合大规模生产的需要。
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参考文献
1 Matsuda Y, Miyazaki K, Moriya H, et al. Studies on urinary kall ikreins. I. Purification and characterization of human urinary kallikreins. J Biochem,1976，80(4)∶671
2 Geiger R, Fritz H. Human urinary kallikrein. In:Methods In Enzymology,1981,80∶466
3 张天民.血管舒缓素的生产工艺和临床应用.生化药物杂志，1984，4(1)∶1
4 金夕坤.胰激肽释放酶国外临床概况.生化药物杂志，1984，4(1)∶61
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5 Ole-MoiYoi O, Spragg J, Austen K F. Structural studies of human urina ry kallikrein(Urokallikrein).Proc Natl Acad Sci, 1979,76(7)∶3121
6 Lottspeich F, Geiger R, Henschen A, et al. N-terminal amino acid seque nce of human urinary kallikrein homology with other serine proteases. Hoppe- Seyler′s Z Physio Chem, 1979，360∶1947
7 阎家麒，李德印.人尿激肽释放酶生产工艺研究.生化药物杂志，1991，11(1)∶72
8 阎家麒，戴承铨，朱建梅，等.人尿胰蛋白酶抑制剂与激肽释放酶联产及纯化的研 究.中国生化药物杂志，1992，12(1)∶9
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9 上海药品标准.上海：上海人民出版社，1980∶120
10 Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,et al. Protein measurement with the F olin-phenol reagent.J Biol Chem,1951,193:265
11 Hial V,Diniz C R, Mares-guia M. Purification and properties of a huma n urinary kallikrein(Kininogenase). Biochemistry,1974,13(21)∶4 311
12 Morichi S, Sako E, Hasegawa E, et al, Large-Scale purification characte rization of human urinary kallikrein. Chem Pharm Bull, 1984,32( 3)∶1152
收稿日期:1998-08-08, 百拇医药