极大螺旋藻胞外多糖EPⅡ的分离、纯化及免疫学研究
作者：吴 洁 张成武 刘义峰
单位：吴洁(中国药科大学微生物教研室，南京210009)；张成武(南京化工大学生物工程与科学系，南京210009)；刘义峰(南京大学医学院，南京210008)
关键词：极大螺旋藻；胞外多糖；理化特性；免疫活性
药物生物技术990208 摘 要 极大螺旋藻培养液经浓缩，脱盐，醇沉得胞外粗多糖(EPI)。EPⅠ依次经DE-52和SephadexG-100纯化得纯品多糖(EPⅡ)。经SephadexG-200检测，EPⅡ为均一组分，Mr60000。薄层层析、气相层析、红外光谱分析表明，EPⅡ是由L-岩藻糖，D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的酸性杂多糖，糖苷键为β型。免疫调节活性试验表明，EPⅡ有提高小鼠的NK细胞杀伤活力，促进IL-2产生及淋巴细胞和混合淋巴细胞转化功能。
Isolation,Purification and lmmunological Activities of
, http://www.100md.com
Extracellular Po lysaccharide EPⅡ from Spirulina Maxima
Wu Jie, Zhang Chengwu1, Liu Yifeng2
(Department of Microbiology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009; 1Department of Biotechnology and Science, Nanjing University of Chemi cal and technology, Nanjing 210009;2Medical College, Nanjing University, Nanjing 210008)
Abstract The raw extracellular polysaccharide(EPⅠ)was isolated from the fermentative solution through concentrating、desalting and precipitating with ethanal separately.EP Ⅰwas further purified by loading on DE-52 and Sephadx G-100 column chromatography,so EPⅡ was obtained.EPⅡ was identified by sephad ex G-200 to be homogenous,with the molecular weight 6.0×104.The ultraviolet spectrum of EPⅡ indicated that nucleic acid and protein are absent.The data of IR revealed that EPⅡ is chiefly linked by β-glycosidic bonds.Chemical compos ition analysis by TLC and GC showed that EPⅡ is composed of L-fucose，D-manno se，D-galatose，D-glucose and glucoronic acid.Immunological activity assays in dicated that EPⅡ could improve IL-2 production，killing activity of NK cells ，lymphocyte transformation and mixed lymphocyte response transformation in mice .
, http://www.100md.com
Key Words Spirulina maxima，Extracellular polysaccharide，Physicochemical properties，Immunological adjustment
螺旋藻(Spirulina)是一种无分支、螺旋型的丝状蓝藻，蓝藻胞外多糖对其能在生态环境中生存起着重要的作用[1]。小谷野等[2]研究发现，盐泽螺旋藻(Spirulina subsalsa)胞外多糖对肉瘤S180，肿瘤细胞株IMC具有明显抑制作用，同时具有免疫增强作用。我们也发现，极大螺旋藻(Spirulina maxima)胞外多糖(EPⅡ)对肿瘤细胞K562有显著的抑制作用，本文研究了EPⅡ的分离纯化、初步结构鉴定及部分免疫活性。
1 材 料
1.1 极大螺旋藻(Spirulina maxima)
, http://www.100md.com
藻种来源于美国Taxas大学藻种保藏中心，选用Zarrouk氏培养液，30±5℃，光强4000Lx，充气培养30d。
1.2 试剂
DE-52,Sephadex G-100,Sephadex G-200，标准Mr Dextran，咔唑，植物血凝素(PHA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)均为Sigma产品，RPMI-1640培液粉为美国GIBCO产品，K562人慢性粒细胞急变白血病细胞购自中科院上海细胞生物学研究所。其余为国产BR.或AR试剂。
1.3 仪器
721分光光度计为上海第三分析仪器厂产品；Kontron Uvikon 860型紫外可见扫描仪；Shima dzu GC-9A气相色谱仪；Nicolet-170x FT红外光谱仪；CO2培养箱；DG3022A酶标免疫检测仪。
, 百拇医药
1.4 动物
BALB/c小鼠：上海实验动物中心
2 方 法
2.1 分离纯化
取30d左右的培养液，绢筛过滤去藻体，浓缩后透析除盐，乙醇沉淀，丙酮脱水干燥得胞外粗多糖(EPⅠ)，EPⅠ经DE-52柱层析纯化，0.1～3.9mol/LNaCl梯度洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测，收集单一峰，经Sephadex G-100柱层析进一步纯化得纯品多糖(EPⅡ)。
2.2 纯度鉴定及分子量检测[3]
Sephadex G-200凝胶柱层析测其纯度，0.1mol/L NaCl洗脱，苯酚-硫酸法检测，作洗脱曲线，并测其洗脱体积Vt，以兰色葡聚糖和标准Mr分别为10400，41000，71400，580000的Dextran相继上柱，得Mr标准曲线，根据样品所测洗脱体积，查标准曲线可得多糖平均分子量。
, 百拇医药
2.3 紫外光谱及红外光谱分析[4，5]
紫外光谱：190～400cm-1区间扫描；红外光谱：KBr压片，4000～400cm-1区间扫描。
2.4 单糖组成分析
2.4.1 薄层层析 以2mol/L H2SO4水解浓缩样点硅胶板，展层剂为正丁醇∶乙酸乙酯∶异丙醇∶醋酸∶水=7∶20∶12∶7∶6，苯胺-邻苯二甲酸显色。
2.4.2 糖腈乙酸酯衍生物的气相层析 据文献方法[6]将水解样进行干燥，糖腈乙酸酯衍生化后进行气相色谱分析，色谱条件：5% OV-225/chromosorb WPVP 80～100目。
2.4.3 糖醛酸含量测定 硫酸-咔唑试剂法[7]，以葡萄糖醛酸为标样。
, 百拇医药
2.5 EPⅡ免疫活性测定[8]
2.5.1 动物分组 分组：(1)正常对照组(Normal group)；(2)免疫功能低下组(Weak group)(正常小组2次注射环磷酰胺(cAMP40mg/kg)，先静脉注射，4d后腹腔注射)；(3)免疫功能低下组+EPⅡ(Weak+EPⅡ)(小鼠静脉注射cAMP后，腹腔注射EPⅡ,50mg/kg,共5d，d6进行检测)。
2.5.2 淋巴细胞转化实验 取小鼠脾细胞(4×107个/ml),加RPMⅠ-1640完全培养液至3ml，再加入PHA100μg，置培养瓶中，于37℃5%CO2培养箱培养48h，将细胞液混匀，吸取细胞悬液100μl加到96孔板中，加入MTT继续培养4h，于570nm处测定A值。
2.5.3 混合淋巴细胞转化实验 取BALB/c鼠脾细胞(5×106个/ml)和NIH鼠脾细胞(5×106个/ml)各100μl，加PHA后于同样条件培养16～18h，悬液移入96孔培养板中，加入MTT继续培养4h，于570nm测A值。
, 百拇医药
2.5.4 IL-2活性检测 取转化的小鼠脾细胞培养液上清100μl，加入96孔培养板中，再加CTLL细胞100μl(1×105个/ml)同样条件培养48h，加入MTT继续培养4h，于570nm测A值。
2.5.5 NK细胞杀伤活力的检测 取小鼠脾细胞(2.5×107个/ml)与K562细胞(5×105个/ml)各100μl混匀，1000r/min离心5min，吸去悬液，细胞置96孔培养板中培养2h，加冰的RPMI-164050μl/孔，终止反应，于570nm处测A值。同时设自然释放管(100μlK562细胞，5×105个/ml)，按下式计算NK细胞杀伤活力。
3 结 果
3.1 纯度及分子量检测
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DE-52与Sephadex G-100柱层析所得为纯品多糖，冷冻干燥所得的EPⅡ为白色絮状粉末，溶于水呈粘稠状，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，Sephadex G-200柱层析洗脱峰为单一对称峰(见图1)，表明EPⅡ为均一组分，Mr为60000(见图2)
Fig 1 Gel Chromatography of EPⅠ on Sephadex G-200
Fig 2 Determination of molecular weight of EPⅡ by Sephadex G-200
3.2 紫外光谱和红外光谱
EPⅡ的紫外吸收光谱图无260nm和280nm吸收峰，表明不含核酸和蛋白质，红外光谱中两组宽峰3387、2954cm-1为多糖特征吸收峰(见Fig.3)另外还存在899cm-1吸收峰，表明EPⅡ分子结构中存在β型糖苷键。
, 百拇医药
Fig 3 The infrared spectrum of EPⅡ
3.3 单糖组成
EPⅡ完全酸水解产物经薄层分析显示，EPⅡ单糖组成中存在L-岩藻糖，D-甘露糖，D-半乳糖，葡萄糖醛酸，为进一步证实薄层层析结果，将EPⅡ水解产物糖腈乙酸酯衍生化后经气相层析分析，结果多了葡萄糖的存在，另外葡萄糖醛酸未出峰，这主要是由于葡萄糖醛酸衍生化后极性仍较大，不易气化；而葡萄糖由于含量较少，薄层层析灵敏度不高，因而未检测出，以肌醇六乙酰酯为内标，根据各个单糖的峰面积计算其摩尔比，并结合咔唑法测糖醛酸含量结果，可得EPⅡ中单糖的组成比为：L-岩∶D-甘∶D-半∶D-葡∶葡萄糖醛酸=1.00∶0.13∶0.060∶0.035∶0.68。
3.4 免疫活性测定
EPⅡ的免疫活性试验中，四种免疫指标的检测结果如Tab.1所示：在混合淋巴细胞转化和NK活力检测两组实验中，因环磷酰胺引起的免疫功能低下的小鼠，腹腔注射EPⅡ后，与免疫功能低下组与正常对照组相比，实验组均有显著提高(P<0.01)，其中NK杀伤活力超过正常值近1倍。在淋巴细胞转化实验中，小鼠腹腔注射EPⅡ后，与免疫功能低下组相比P<0.01，实验值(45.92)已与正常对照值(53.33)无显著差异，IL-2活性检测有相似的结果。
, http://www.100md.com
Tab 1 Results of four immunological activity assays (A×100) Immunological activity
Normal group
Weak group
Weak+EPⅡ
Lymphocyte transformation
53.33±6.08
39.83±31.5*
45.92±4.83
Mixed lymphocyte transformation
, 百拇医药
48.92±4.19
46.33±5.25
57.42±3.00*
IL-2 production
26.75±3.95
19.25±2.60*
23.25±3.14
Killing activity of NK cells
69.75±6.51
, http://www.100md.com
59.75±3.88*
112.0±789*
*:Compare with normal group (P<0.01):Compare with weak group (P<0.01)4 讨 论
我们从螺旋藻丝斜向纵切透射电镜的超微结构中观察到，藻细胞壁外无明显的胶鞘和粘液层结构，而培养液粘稠度较大，因此推测藻细胞向壁外释放的多糖大部分溶解在培养液中。
一般认为，多糖的抗肿瘤活性机理在于多糖能提高机体免疫功能而间接抑制肿瘤的生长[9]，鉴于前人及本实验室在胞外多糖抗肿瘤方面的实验结果，我们设计了此实验，从实验结果可初步认为，螺旋藻胞外多糖具有提高机体免疫功能的作用。
, 百拇医药
参考文献
1 Filkwill D L.Production，isolation，preliminary characterizatio n of the exopolysaccharide of Cyanobacterium Spirulina platensis. Biotechn Lett,1993,15(6)∶567
2 小谷野.JP61-158926,1985,7,18,1
3 曾和平，郭宝江.螺旋藻多糖的化学研究.药学学报，1995，30(11)∶856
4 吴梧桐，陈琼华，徐碧如.银耳孢子多糖的分离和分析.真菌学报 ，1982，1(2)∶119
5 方积年，叶淳渠，刘玉荣，等.竹黄多糖的研究.生物化学与生物物理学报 ，1980，12(4)∶365
, 百拇医药
6 李铁林，吴昌贤，张燕霞，等.糖和糖醇的气相色谱分析研究.分析化学， 1982，10(5)∶272
7 Dische Z. A new special color of hexuronic acids. J Biol Chem,1947, 167(1)∶189
8 方福德.现代医学实验技巧全书.北京：北京医科大学和中国协和 医科大学联合出版社，1995，446
9 邹建华.国外对多糖的抗肿瘤作用研究简况.国外医学中医中药分册，1991，13(6)∶321
收稿日期：1998-05-20, 百拇医药
单位：吴洁(中国药科大学微生物教研室，南京210009)；张成武(南京化工大学生物工程与科学系，南京210009)；刘义峰(南京大学医学院，南京210008)
关键词：极大螺旋藻；胞外多糖；理化特性；免疫活性
药物生物技术990208 摘 要 极大螺旋藻培养液经浓缩，脱盐，醇沉得胞外粗多糖(EPI)。EPⅠ依次经DE-52和SephadexG-100纯化得纯品多糖(EPⅡ)。经SephadexG-200检测，EPⅡ为均一组分，Mr60000。薄层层析、气相层析、红外光谱分析表明，EPⅡ是由L-岩藻糖，D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的酸性杂多糖，糖苷键为β型。免疫调节活性试验表明，EPⅡ有提高小鼠的NK细胞杀伤活力，促进IL-2产生及淋巴细胞和混合淋巴细胞转化功能。
Isolation,Purification and lmmunological Activities of
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Extracellular Po lysaccharide EPⅡ from Spirulina Maxima
Wu Jie, Zhang Chengwu1, Liu Yifeng2
(Department of Microbiology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009; 1Department of Biotechnology and Science, Nanjing University of Chemi cal and technology, Nanjing 210009;2Medical College, Nanjing University, Nanjing 210008)
Abstract The raw extracellular polysaccharide(EPⅠ)was isolated from the fermentative solution through concentrating、desalting and precipitating with ethanal separately.EP Ⅰwas further purified by loading on DE-52 and Sephadx G-100 column chromatography,so EPⅡ was obtained.EPⅡ was identified by sephad ex G-200 to be homogenous,with the molecular weight 6.0×104.The ultraviolet spectrum of EPⅡ indicated that nucleic acid and protein are absent.The data of IR revealed that EPⅡ is chiefly linked by β-glycosidic bonds.Chemical compos ition analysis by TLC and GC showed that EPⅡ is composed of L-fucose，D-manno se，D-galatose，D-glucose and glucoronic acid.Immunological activity assays in dicated that EPⅡ could improve IL-2 production，killing activity of NK cells ，lymphocyte transformation and mixed lymphocyte response transformation in mice .
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Key Words Spirulina maxima，Extracellular polysaccharide，Physicochemical properties，Immunological adjustment
螺旋藻(Spirulina)是一种无分支、螺旋型的丝状蓝藻，蓝藻胞外多糖对其能在生态环境中生存起着重要的作用[1]。小谷野等[2]研究发现，盐泽螺旋藻(Spirulina subsalsa)胞外多糖对肉瘤S180，肿瘤细胞株IMC具有明显抑制作用，同时具有免疫增强作用。我们也发现，极大螺旋藻(Spirulina maxima)胞外多糖(EPⅡ)对肿瘤细胞K562有显著的抑制作用，本文研究了EPⅡ的分离纯化、初步结构鉴定及部分免疫活性。
1 材 料
1.1 极大螺旋藻(Spirulina maxima)
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藻种来源于美国Taxas大学藻种保藏中心，选用Zarrouk氏培养液，30±5℃，光强4000Lx，充气培养30d。
1.2 试剂
DE-52,Sephadex G-100,Sephadex G-200，标准Mr Dextran，咔唑，植物血凝素(PHA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)均为Sigma产品，RPMI-1640培液粉为美国GIBCO产品，K562人慢性粒细胞急变白血病细胞购自中科院上海细胞生物学研究所。其余为国产BR.或AR试剂。
1.3 仪器
721分光光度计为上海第三分析仪器厂产品；Kontron Uvikon 860型紫外可见扫描仪；Shima dzu GC-9A气相色谱仪；Nicolet-170x FT红外光谱仪；CO2培养箱；DG3022A酶标免疫检测仪。
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1.4 动物
BALB/c小鼠：上海实验动物中心
2 方 法
2.1 分离纯化
取30d左右的培养液，绢筛过滤去藻体，浓缩后透析除盐，乙醇沉淀，丙酮脱水干燥得胞外粗多糖(EPⅠ)，EPⅠ经DE-52柱层析纯化，0.1～3.9mol/LNaCl梯度洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测，收集单一峰，经Sephadex G-100柱层析进一步纯化得纯品多糖(EPⅡ)。
2.2 纯度鉴定及分子量检测[3]
Sephadex G-200凝胶柱层析测其纯度，0.1mol/L NaCl洗脱，苯酚-硫酸法检测，作洗脱曲线，并测其洗脱体积Vt，以兰色葡聚糖和标准Mr分别为10400，41000，71400，580000的Dextran相继上柱，得Mr标准曲线，根据样品所测洗脱体积，查标准曲线可得多糖平均分子量。
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2.3 紫外光谱及红外光谱分析[4，5]
紫外光谱：190～400cm-1区间扫描；红外光谱：KBr压片，4000～400cm-1区间扫描。
2.4 单糖组成分析
2.4.1 薄层层析 以2mol/L H2SO4水解浓缩样点硅胶板，展层剂为正丁醇∶乙酸乙酯∶异丙醇∶醋酸∶水=7∶20∶12∶7∶6，苯胺-邻苯二甲酸显色。
2.4.2 糖腈乙酸酯衍生物的气相层析 据文献方法[6]将水解样进行干燥，糖腈乙酸酯衍生化后进行气相色谱分析，色谱条件：5% OV-225/chromosorb WPVP 80～100目。
2.4.3 糖醛酸含量测定 硫酸-咔唑试剂法[7]，以葡萄糖醛酸为标样。
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2.5 EPⅡ免疫活性测定[8]
2.5.1 动物分组 分组：(1)正常对照组(Normal group)；(2)免疫功能低下组(Weak group)(正常小组2次注射环磷酰胺(cAMP40mg/kg)，先静脉注射，4d后腹腔注射)；(3)免疫功能低下组+EPⅡ(Weak+EPⅡ)(小鼠静脉注射cAMP后，腹腔注射EPⅡ,50mg/kg,共5d，d6进行检测)。
2.5.2 淋巴细胞转化实验 取小鼠脾细胞(4×107个/ml),加RPMⅠ-1640完全培养液至3ml，再加入PHA100μg，置培养瓶中，于37℃5%CO2培养箱培养48h，将细胞液混匀，吸取细胞悬液100μl加到96孔板中，加入MTT继续培养4h，于570nm处测定A值。
2.5.3 混合淋巴细胞转化实验 取BALB/c鼠脾细胞(5×106个/ml)和NIH鼠脾细胞(5×106个/ml)各100μl，加PHA后于同样条件培养16～18h，悬液移入96孔培养板中，加入MTT继续培养4h，于570nm测A值。
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2.5.4 IL-2活性检测 取转化的小鼠脾细胞培养液上清100μl，加入96孔培养板中，再加CTLL细胞100μl(1×105个/ml)同样条件培养48h，加入MTT继续培养4h，于570nm测A值。
2.5.5 NK细胞杀伤活力的检测 取小鼠脾细胞(2.5×107个/ml)与K562细胞(5×105个/ml)各100μl混匀，1000r/min离心5min，吸去悬液，细胞置96孔培养板中培养2h，加冰的RPMI-164050μl/孔，终止反应，于570nm处测A值。同时设自然释放管(100μlK562细胞，5×105个/ml)，按下式计算NK细胞杀伤活力。
3 结 果
3.1 纯度及分子量检测
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DE-52与Sephadex G-100柱层析所得为纯品多糖，冷冻干燥所得的EPⅡ为白色絮状粉末，溶于水呈粘稠状，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，Sephadex G-200柱层析洗脱峰为单一对称峰(见图1)，表明EPⅡ为均一组分，Mr为60000(见图2)
Fig 1 Gel Chromatography of EPⅠ on Sephadex G-200
Fig 2 Determination of molecular weight of EPⅡ by Sephadex G-200
3.2 紫外光谱和红外光谱
EPⅡ的紫外吸收光谱图无260nm和280nm吸收峰，表明不含核酸和蛋白质，红外光谱中两组宽峰3387、2954cm-1为多糖特征吸收峰(见Fig.3)另外还存在899cm-1吸收峰，表明EPⅡ分子结构中存在β型糖苷键。
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Fig 3 The infrared spectrum of EPⅡ
3.3 单糖组成
EPⅡ完全酸水解产物经薄层分析显示，EPⅡ单糖组成中存在L-岩藻糖，D-甘露糖，D-半乳糖，葡萄糖醛酸，为进一步证实薄层层析结果，将EPⅡ水解产物糖腈乙酸酯衍生化后经气相层析分析，结果多了葡萄糖的存在，另外葡萄糖醛酸未出峰，这主要是由于葡萄糖醛酸衍生化后极性仍较大，不易气化；而葡萄糖由于含量较少，薄层层析灵敏度不高，因而未检测出，以肌醇六乙酰酯为内标，根据各个单糖的峰面积计算其摩尔比，并结合咔唑法测糖醛酸含量结果，可得EPⅡ中单糖的组成比为：L-岩∶D-甘∶D-半∶D-葡∶葡萄糖醛酸=1.00∶0.13∶0.060∶0.035∶0.68。
3.4 免疫活性测定
EPⅡ的免疫活性试验中，四种免疫指标的检测结果如Tab.1所示：在混合淋巴细胞转化和NK活力检测两组实验中，因环磷酰胺引起的免疫功能低下的小鼠，腹腔注射EPⅡ后，与免疫功能低下组与正常对照组相比，实验组均有显著提高(P<0.01)，其中NK杀伤活力超过正常值近1倍。在淋巴细胞转化实验中，小鼠腹腔注射EPⅡ后，与免疫功能低下组相比P<0.01，实验值(45.92)已与正常对照值(53.33)无显著差异，IL-2活性检测有相似的结果。
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Tab 1 Results of four immunological activity assays (A×100) Immunological activity
Normal group
Weak group
Weak+EPⅡ
Lymphocyte transformation
53.33±6.08
39.83±31.5*
45.92±4.83
Mixed lymphocyte transformation
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48.92±4.19
46.33±5.25
57.42±3.00*
IL-2 production
26.75±3.95
19.25±2.60*
23.25±3.14
Killing activity of NK cells
69.75±6.51
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59.75±3.88*
112.0±789*
*:Compare with normal group (P<0.01)
:Compare with weak group (P<0.01)4 讨 论我们从螺旋藻丝斜向纵切透射电镜的超微结构中观察到，藻细胞壁外无明显的胶鞘和粘液层结构，而培养液粘稠度较大，因此推测藻细胞向壁外释放的多糖大部分溶解在培养液中。
一般认为，多糖的抗肿瘤活性机理在于多糖能提高机体免疫功能而间接抑制肿瘤的生长[9]，鉴于前人及本实验室在胞外多糖抗肿瘤方面的实验结果，我们设计了此实验，从实验结果可初步认为，螺旋藻胞外多糖具有提高机体免疫功能的作用。
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参考文献
1 Filkwill D L.Production，isolation，preliminary characterizatio n of the exopolysaccharide of Cyanobacterium Spirulina platensis. Biotechn Lett,1993,15(6)∶567
2 小谷野.JP61-158926,1985,7,18,1
3 曾和平，郭宝江.螺旋藻多糖的化学研究.药学学报，1995，30(11)∶856
4 吴梧桐，陈琼华，徐碧如.银耳孢子多糖的分离和分析.真菌学报 ，1982，1(2)∶119
5 方积年，叶淳渠，刘玉荣，等.竹黄多糖的研究.生物化学与生物物理学报 ，1980，12(4)∶365
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6 李铁林，吴昌贤，张燕霞，等.糖和糖醇的气相色谱分析研究.分析化学， 1982，10(5)∶272
7 Dische Z. A new special color of hexuronic acids. J Biol Chem,1947, 167(1)∶189
8 方福德.现代医学实验技巧全书.北京：北京医科大学和中国协和 医科大学联合出版社，1995，446
9 邹建华.国外对多糖的抗肿瘤作用研究简况.国外医学中医中药分册，1991，13(6)∶321
收稿日期：1998-05-20, 百拇医药