红栓菌深层培养的研究
作者：徐旭东 尹鸿萍 肖灿鹏 曹幼琴
单位：徐旭东 尹鸿萍 肖灿鹏(中国药科大学微生物教研室，南京210009)；曹幼琴(南京大学生物系，南京，210093)
关键词：红栓菌；深层培养；胞外多糖
药物生物技术990304
摘 要 为了获得红栓菌胞外多糖，研究了红栓菌深层培养条件。用优化的发酵培养基，深层培养红栓菌，经28℃，160r/min的摇瓶培养，84h后，红栓菌胞外多糖的产量可达1.52g/L。在气升式发酵罐中进行培养，红栓菌菌丝球的生已长遵循Logistic模型，即Xt=(0.172e2.953t)/[1-0.328(1-e2.953t)],当通气量为0.8vvm时，培养84h后，胞外 多糖产量可以达到1.65g/L。
, http://www.100md.com
Study on the Submerged Culture
Method of Pycnoporus Cinnabarius
Xu Xudong, Yin Hongping, Xiao Canpeng, Cao Youqin1
(Department of Microbiology,China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, 1Department of Biology, Nanjing University, Nanjing 210093)
Abstract In order to obtain the exocellular polysacc haride(ECP) of Pycnoporusc innabairus,the production conditions of Pycnoporus cinn abarius in submerged cu lture were studied.The result showed that the ECP accumulated to 1.58g/L in shak flash under optimum conditions.The mycelium growth in air-lift fermentor follows Logistic law,i,e,Xt=(0.172e2.953t)/[1-0.328(1- e2.95 3t)],when the air flow attained 0.8vvm, the ECP for 84h were 1.68g/L.
, 百拇医药
Key Words Pycnoporus cinnabarius，Submerged culture，Exocellular polysaccharide
红栓菌(Pycnoporus cinnabarirus)在分类上属于多孔菌科，据文献记载有清热、解毒、消炎之功效[1]。现已证明，红栓菌固培物(子实体)多糖对于小鼠肉瘤S-180抑制率达90%[2]。红栓菌固培物水浸膏经临床验证，对食管癌、贲门癌有治疗作用。关于红栓菌深层培养产生的胞外多糖(exocellular polysaccharide,简称ECP)的性质研究，未见有报道，本文研究了红栓菌深层培养产生胞外多糖的工艺条件。
1 材料与方法
1.1 菌种及母种培养
红栓菌(Pycnoporus cinnabarius)，由南京大学生物系曹幼琴副教授提供。斜面培养采用常规的PDA培养基，培养温度28℃。
, 百拇医药
1.2 培养基
1.2.1 种子培养基 种子培养基采用基础培养基I(g/L)：葡萄糖20,KH2PO41.0,MgSO4.7H2O0.5,调pH5.8。按照最终含氮量0.42g/L浓度，试验各种氮源对菌丝得率的影响。
1.2.2 发酵培养基 发酵培养基采用基础培养基II(g/L)：葡萄糖20，酵母膏6.0,KH2PO41.0,MgSO47H2O0.5,调pH5.8。正交试验比较碳源，C/N比，培养基初始pH值，无机盐等各种影响胞外多糖产生的因素。
1.3 培养方法及工艺条件
1.3.1 培养方法 由PDA斜面中挑取1/3斜面的菌丝块(18mm×200mm试管)，接种于种子培养基中，28℃，120r/min下振荡培养3d，菌丝经打散后，以10%接种量接入摇瓶发酵培养基中，置于DRL-C大容量恒温振荡器上振荡培养。
, 百拇医药
1.3.2 工艺条件 在上述培养条件下，研究需氧量、接种量、种龄、温度等影响红栓菌胞外多糖产生的因素，并考察了在气升式发酵罐中的培养情况。
1.4 分析方法
1.4.1 菌丝生长量的测定 采用文献[3]中的方法。
1.4.2 还原糖的测定 斐林滴定法[4]。
1.4.3 多糖测定 采用文献[5]中的方法。
2 结 果
2.1 种子培养基的确定
比较了9种常见氮源对菌丝生长量的影响，结果见表1。
Tab1 Effect of nitrogen source on biomass Nitrogen source
, http://www.100md.com
Yeast exteract
Beef exteract
Peptone
Casein
Glutamine
Urea
NH4Cl
(NH4)2SO4
Biomass(g/L)
5.7
5.1
, 百拇医药
3.7
4.4
3.2
3.8
0.9
1.4
从表1可知，采用0.6%酵母浸膏可以获得最大的菌丝产量，故作为种子培养基氮源。
2.2 发酵培养基的确定
经预试，红栓菌可以很好地利用多种碳源，包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖及淀粉、菊粉、黄豆饼粉等。在氮源酵母膏含量固定为0.6%情况下，按照L9(34)正交试验，分析了碳源浓度、培养基初始pH值及对红栓菌产胞外糖的影响，结果表明，当葡萄糖含量为2.5%，KH2PO40.15%、MgSO4.7H2O为0.04%，培养基初始pH值为5.8时，摇瓶产生多糖可达1.46g/L，是适宜的发酵培养基。
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实验也表明，VB1,Ca2+,Zn2+,Mn2+,Fe2+等元素对红栓菌胞外多糖的产生影响不大。
2.3 深层培养工艺条件研究
采用上述培养基，在500ml摇瓶中试验了接种量、菌龄、装液量、温度对红栓菌胞外多糖产生的影响，结果如表2所示。Tab 2 Influence of 4 factors on production of ECP Factors
Inoculum(%)
Liquid volume(ml)
Age of seed(d)
Tempetrature(℃ )
, 百拇医药
Levels
5
10
15
60
80
100
1
2
3
26
28
30
ECP(g/L)
, http://www.100md.com
0.75
1.01
0.92
1.10
1.30
0.80
0.48
0.98
0.94
0.86
10.2
0.92
在80ml装液量条件下，用亚硫酸钠氧化法测得其溶氧系数Kd为3.06×10-7molO2/(ml.min.atm)。
, 百拇医药
采用上述优化的培养基及工艺条件，红栓菌摇瓶培养84h后，可积累胞外多糖1.52g/L。
2.4 气升式发酵罐中培养试验
在自制7L气升式发酵罐中的培养结果表明，当通气量达到0.8vvm时，发酵84h后，菌丝浓度达到了5.2g/L，红栓菌胞外多糖的浓度达到了1.65g/L。其培养过程如图1所示。
Fig 1 Time course of ECP fermentation in 7L fermentor
深层培养的起始pH5.8，然后逐渐下降，第60h降至最低(3.90)，然又开始上升，当残糖含量达到0.02%，pH升到5.0左右，培养过程结束。
利用发酵中菌体生长数据对真菌生长的Logistic方程进行模拟。得出菌丝增长的动力学模型为：
, http://www.100md.com
Xt=(0.172e2.953t)/[1-0.328(1-e2.953t)]
此模型与实验结果吻合良好，相关指数为0.996，见表3。
Tab 3 Mycelium concentration of fermentation in air-lift ferm entor Time(days)
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
, 百拇医药
3.0
3.5
Determination ata(g/L)
0.1
0.5
2.3
3.8
4.9
5.1
5.3
5.2
Model calculation data(g/L)
, 百拇医药
0.17
0.67
2.04
3.86
4.84
5 .13
5.21
5.22
3 讨 论
1)采用深层发酵获得高等真菌胞外多糖，周期短、产物易提纯、适应工业化生产，是目前高等真菌应用研究的一个趋势。
2)高等真菌菌丝在深层培养中若受到较大的剪切力，则菌丝易断裂，生长快，发酵粘稠，溶解氧扩散困难，从而影响胞外多糖产生。气升式发酵罐在此方面比搅拌式发酵罐有优越性。
, 百拇医药
3)丝状真菌生长动力学是以其重量(或浓度)直接对时间作图，与细菌生长曲线有较大区别。
4)本文中红栓菌深层培养目的产物主要指红栓菌菌丝生长过程中分泌到液体培养基中的多多糖部分，属于胞外多糖；文献中固培物(子实体)多糖是指红栓菌经固体培养，长成子实体后，将收获的子实体洗净，经常规的热水浸提得到的多糖部分，属于胞内多糖。两种多糖培养条件不同，产生部位也不一样，因而在结构组成及生物活性上，都有一定的区别。 参考文献
1 应建浙，卯晓岚，马启明，等.中国药用真菌图鉴.北京：科学出版社，1987.219
2 日本特许公报.2(4)-19(202)，17161-17171，1976；2(4)-28(256)，31957，1976；2(4)-38(266)，44601-44640，1977；2(4)-39(26)，45783-45799，1977.
3 金山タ
.茯苓菌丝的深层培养.应用微生物，1986，(3)：55
4 张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术.北京：高等教育出版社，1981.6
5 贾凌云，冯朴荪，谢建.云芝菌丝体悬浮液的流变特性及其在培养过程中的变化.生物工程学报，1993，9(1)：96
收稿日期：1999-03-02, 百拇医药
单位：徐旭东 尹鸿萍 肖灿鹏(中国药科大学微生物教研室，南京210009)；曹幼琴(南京大学生物系，南京，210093)
关键词：红栓菌；深层培养；胞外多糖
药物生物技术990304
摘 要 为了获得红栓菌胞外多糖，研究了红栓菌深层培养条件。用优化的发酵培养基，深层培养红栓菌，经28℃，160r/min的摇瓶培养，84h后，红栓菌胞外多糖的产量可达1.52g/L。在气升式发酵罐中进行培养，红栓菌菌丝球的生已长遵循Logistic模型，即Xt=(0.172e2.953t)/[1-0.328(1-e2.953t)],当通气量为0.8vvm时，培养84h后，胞外 多糖产量可以达到1.65g/L。
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Study on the Submerged Culture
Method of Pycnoporus Cinnabarius
Xu Xudong, Yin Hongping, Xiao Canpeng, Cao Youqin1
(Department of Microbiology,China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, 1Department of Biology, Nanjing University, Nanjing 210093)
Abstract In order to obtain the exocellular polysacc haride(ECP) of Pycnoporusc innabairus,the production conditions of Pycnoporus cinn abarius in submerged cu lture were studied.The result showed that the ECP accumulated to 1.58g/L in shak flash under optimum conditions.The mycelium growth in air-lift fermentor follows Logistic law,i,e,Xt=(0.172e2.953t)/[1-0.328(1- e2.95 3t)],when the air flow attained 0.8vvm, the ECP for 84h were 1.68g/L.
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Key Words Pycnoporus cinnabarius，Submerged culture，Exocellular polysaccharide
红栓菌(Pycnoporus cinnabarirus)在分类上属于多孔菌科，据文献记载有清热、解毒、消炎之功效[1]。现已证明，红栓菌固培物(子实体)多糖对于小鼠肉瘤S-180抑制率达90%[2]。红栓菌固培物水浸膏经临床验证，对食管癌、贲门癌有治疗作用。关于红栓菌深层培养产生的胞外多糖(exocellular polysaccharide,简称ECP)的性质研究，未见有报道，本文研究了红栓菌深层培养产生胞外多糖的工艺条件。
1 材料与方法
1.1 菌种及母种培养
红栓菌(Pycnoporus cinnabarius)，由南京大学生物系曹幼琴副教授提供。斜面培养采用常规的PDA培养基，培养温度28℃。
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1.2 培养基
1.2.1 种子培养基 种子培养基采用基础培养基I(g/L)：葡萄糖20,KH2PO41.0,MgSO4.7H2O0.5,调pH5.8。按照最终含氮量0.42g/L浓度，试验各种氮源对菌丝得率的影响。
1.2.2 发酵培养基 发酵培养基采用基础培养基II(g/L)：葡萄糖20，酵母膏6.0,KH2PO41.0,MgSO47H2O0.5,调pH5.8。正交试验比较碳源，C/N比，培养基初始pH值，无机盐等各种影响胞外多糖产生的因素。
1.3 培养方法及工艺条件
1.3.1 培养方法 由PDA斜面中挑取1/3斜面的菌丝块(18mm×200mm试管)，接种于种子培养基中，28℃，120r/min下振荡培养3d，菌丝经打散后，以10%接种量接入摇瓶发酵培养基中，置于DRL-C大容量恒温振荡器上振荡培养。
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1.3.2 工艺条件 在上述培养条件下，研究需氧量、接种量、种龄、温度等影响红栓菌胞外多糖产生的因素，并考察了在气升式发酵罐中的培养情况。
1.4 分析方法
1.4.1 菌丝生长量的测定 采用文献[3]中的方法。
1.4.2 还原糖的测定 斐林滴定法[4]。
1.4.3 多糖测定 采用文献[5]中的方法。
2 结 果
2.1 种子培养基的确定
比较了9种常见氮源对菌丝生长量的影响，结果见表1。
Tab1 Effect of nitrogen source on biomass Nitrogen source
, http://www.100md.com
Yeast exteract
Beef exteract
Peptone
Casein
Glutamine
Urea
NH4Cl
(NH4)2SO4
Biomass(g/L)
5.7
5.1
, 百拇医药
3.7
4.4
3.2
3.8
0.9
1.4
从表1可知，采用0.6%酵母浸膏可以获得最大的菌丝产量，故作为种子培养基氮源。
2.2 发酵培养基的确定
经预试，红栓菌可以很好地利用多种碳源，包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖及淀粉、菊粉、黄豆饼粉等。在氮源酵母膏含量固定为0.6%情况下，按照L9(34)正交试验，分析了碳源浓度、培养基初始pH值及对红栓菌产胞外糖的影响，结果表明，当葡萄糖含量为2.5%，KH2PO40.15%、MgSO4.7H2O为0.04%，培养基初始pH值为5.8时，摇瓶产生多糖可达1.46g/L，是适宜的发酵培养基。
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实验也表明，VB1,Ca2+,Zn2+,Mn2+,Fe2+等元素对红栓菌胞外多糖的产生影响不大。
2.3 深层培养工艺条件研究
采用上述培养基，在500ml摇瓶中试验了接种量、菌龄、装液量、温度对红栓菌胞外多糖产生的影响，结果如表2所示。Tab 2 Influence of 4 factors on production of ECP Factors
Inoculum(%)
Liquid volume(ml)
Age of seed(d)
Tempetrature(℃ )
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Levels
5
10
15
60
80
100
1
2
3
26
28
30
ECP(g/L)
, http://www.100md.com
0.75
1.01
0.92
1.10
1.30
0.80
0.48
0.98
0.94
0.86
10.2
0.92
在80ml装液量条件下，用亚硫酸钠氧化法测得其溶氧系数Kd为3.06×10-7molO2/(ml.min.atm)。
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采用上述优化的培养基及工艺条件，红栓菌摇瓶培养84h后，可积累胞外多糖1.52g/L。
2.4 气升式发酵罐中培养试验
在自制7L气升式发酵罐中的培养结果表明，当通气量达到0.8vvm时，发酵84h后，菌丝浓度达到了5.2g/L，红栓菌胞外多糖的浓度达到了1.65g/L。其培养过程如图1所示。
Fig 1 Time course of ECP fermentation in 7L fermentor
深层培养的起始pH5.8，然后逐渐下降，第60h降至最低(3.90)，然又开始上升，当残糖含量达到0.02%，pH升到5.0左右，培养过程结束。
利用发酵中菌体生长数据对真菌生长的Logistic方程进行模拟。得出菌丝增长的动力学模型为：
, http://www.100md.com
Xt=(0.172e2.953t)/[1-0.328(1-e2.953t)]
此模型与实验结果吻合良好，相关指数为0.996，见表3。
Tab 3 Mycelium concentration of fermentation in air-lift ferm entor Time(days)
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
, 百拇医药
3.0
3.5
Determination ata(g/L)
0.1
0.5
2.3
3.8
4.9
5.1
5.3
5.2
Model calculation data(g/L)
, 百拇医药
0.17
0.67
2.04
3.86
4.84
5 .13
5.21
5.22
3 讨 论
1)采用深层发酵获得高等真菌胞外多糖，周期短、产物易提纯、适应工业化生产，是目前高等真菌应用研究的一个趋势。
2)高等真菌菌丝在深层培养中若受到较大的剪切力，则菌丝易断裂，生长快，发酵粘稠，溶解氧扩散困难，从而影响胞外多糖产生。气升式发酵罐在此方面比搅拌式发酵罐有优越性。
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3)丝状真菌生长动力学是以其重量(或浓度)直接对时间作图，与细菌生长曲线有较大区别。
4)本文中红栓菌深层培养目的产物主要指红栓菌菌丝生长过程中分泌到液体培养基中的多多糖部分，属于胞外多糖；文献中固培物(子实体)多糖是指红栓菌经固体培养，长成子实体后，将收获的子实体洗净，经常规的热水浸提得到的多糖部分，属于胞内多糖。两种多糖培养条件不同，产生部位也不一样，因而在结构组成及生物活性上，都有一定的区别。 参考文献
1 应建浙，卯晓岚，马启明，等.中国药用真菌图鉴.北京：科学出版社，1987.219
2 日本特许公报.2(4)-19(202)，17161-17171，1976；2(4)-28(256)，31957，1976；2(4)-38(266)，44601-44640，1977；2(4)-39(26)，45783-45799，1977.
3 金山タ
.茯苓菌丝的深层培养.应用微生物，1986，(3)：554 张龙翔，张庭芳，李令媛.生化实验方法和技术.北京：高等教育出版社，1981.6
5 贾凌云，冯朴荪，谢建.云芝菌丝体悬浮液的流变特性及其在培养过程中的变化.生物工程学报，1993，9(1)：96
收稿日期：1999-03-02, 百拇医药