北方汉族人群PAH基因STR多态性分析及PKU产前基因诊断研究
作者：姜莉 金春莲 张学 林长坤 李红杰 孙桂凤 金春元 佟秉政 曲陆荣 孙开来
单位：姜莉 金春莲 张学 林长坤 李红杰 孙桂凤 金春元 孙开来(110001沈阳，中国医科大学遗传学研究室)；佟秉政、曲陆荣(第二临床医院)
关键词：
北方汉族人群PAH基因STR多态性分析及 PKU产前基因诊断研究 苯丙酮尿症(PKU)是由肝脏苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺陷引起的常染色体隐性遗传病。临床主要表现为智力低下。研究表明，PKU的分子基础主要是PAH基因的点突变。到1996年，汇集28个国家研究成果的PAH基因突变数据库已登记320余种PAH突变[1]。目前，直接检测PAH基因突变进行PKU基因诊断受到较大限制。我们应用PCR技术，分析了63例遗传上无相关的北方正常汉族个体的STR多态性分布，并联合应用PCR-STR连锁分析及PCR-DGGE突变检测技术，成功地进行了13例PKU高危胎儿的产前基因诊断，同时建立一种安全可靠、简便快速的PCR检测方法。
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1 材料和方法
1.1 样品来源及DNA提取 13个经典型PKU家系的外周血及胎儿羊水(妊娠16～20周)标本由中国医科大学第二临床医院提供。63例遗传上无相关的北方正常汉族个体由中国医科大学第一临床医院提供。按本室常规方法提取基因组DNA。
1.2 方法
1.2.1 PCR-STR连锁分析 根据文献[2]报道合成PCR引物。按前文报道方法PCR扩增后[3]，在含7mol尿素的6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离。电泳条件为50℃、40W、1小时30分钟，凝胶经Green-1荧光染料染色30分钟，于自动凝胶成像仪上观察、贮存。
1.2.2 PCR-DGGE突变检测分析 根据文献[4]分别合成用于DGGE的特殊引物E6、E7和E12。方法同前。扩增产物采用DGGE分析，制备6%聚丙烯酰胺/TAE凝胶，变性梯度范围为20%～80%，电泳条件为60℃、150V、6小时。泳毕，凝胶经溴化乙锭染色，于自动凝胶成像仪上观察、贮存。
, 百拇医药
2 结果
2.1 STR等位片段长度的多态性分布 应用F-dUTP标记PCR产物经毛细管高压电泳，GeneScan分析随机鉴定5例PKU家系成员STR等位片段长度，再依其为参考分子量标准，检测来自北方地区遗传上无相关的正常汉族个体63人，总计126条染色体，共检测出7种等位片段(表1)，依次为232bp(A)、236bp(B)、240bp(C)、244bp(D)、248bp(E)、252bp(F)和256bp(G)，其等位基因频率分别为0.056、0.103、0.048、0.206、0.444、0.111和0.032。根据如上检测结果计算其PIC为0.731。
表1 北方汉族人群PAH基因STR等位片段的分布
等位片段长度
染色体数
等位片段频率
, http://www.100md.com
多态信息量
232(A)
7
0.056
236(B)
13
0.103
240(C)
6
0.048
244(D)
26
0.206
, 百拇医药
0.731
248(E)
56
0.444
252(F)
14
0.111
256(G)
4
0.032
合计
126
1.000
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2.2 产前基因诊断结果 13个PKU家系的产前基因诊断结果如表2所示。表型正常的11例，其中8例已出生，于生后1～2周取血查血苯丙氨酸浓度均属正常，2例尚未出生，另1例因家庭问题于7个半月终止妊娠，取脐带血验证与羊水结果相同；PKU患儿2例，于5个月引产。产前诊断的代表性结果见图1，2。 表2 PKU家系的产前基因诊断结果及生后验证
家系
STR等位片段
产前诊断结论
综合判断
出生后验证
先证者
父亲
母亲
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胎儿
STR分析
DGGE分析
1
C/E
D/E
C/F
C/D
携带者
出生，正常
2
A/D
A/E
, 百拇医药
D/F
D/E
携带者
出生，正常
3
E/E
D/E
B/E
B/D
正常
出生，正常
4
E/F
, 百拇医药
D/E
E/F
E/F
患儿
5个月引产
5
E/F
E/F
D/E
D/F
携带者
7个半月引产
6
, 百拇医药
F/F
C/F
E/F
C/E
正常
出生，正常
7
D/D
D/E
D/F
D/F
携带者
出生，正常
, 百拇医药
8
E/E
E/F
E/F
E/E
患儿
5个月引产
9
D/E
D/E
D/E
D/E
不提供信息
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E7正常
出生，正常
10
D/E
E/E
A/D
A/E
正常或携带者
出生，正常
11
F/F
E/F
F/F
, 百拇医药
E/F
正常或携带者
出生，正常
12
D/D
D/E
D/D
D/D
携带者或患儿
E7正常
携带者
尚未出生
13
, 百拇医药
B/E
B/F
E/E
E/F
正常或携带者
尚未出生
图1 家系1、2、3的PAH基因PCR-STR连锁分析
图2 家系9的产前基因诊断结果
, 百拇医药
3 讨论
3.1 北方汉族人群PAH基因STR多态性 已有的研究表明PAH基因内含子3中存在的STR是迄今为止发现的多态信息量最高的PAH基因内多态标记。1993年，胡流清等报道在白种人检测到9种等位片段，国内宋日 方等[5]在中国正常人和PKU家系中分别检测出7种和9种等位片段，均以240bp和244bp的等位频率最高。我们在63例正常人中检测出7种等位片段，均在已报道的长度范围之内，但等位频率最高的片段为248bp，达44.4%(56/126)，明显高于白种人16%和亚洲日本人12.9%。我们的研究表明248bp可能是中国北方汉族人群中最常见的等位片段，这可能与不同人群、不同地域存在差异有关，对STR连锁分析有意义。我们对PAH基因STR分析得到的多态信息量(polymorphism information contents, PIC)为0.731；实际检测到的杂合子频率为78%(49/63)，明显高于已有报道的64%，可见该STR多态是PKU基因诊断非常有意义的遗传标记。
, 百拇医药
3.2 13例PKU产前基因诊断研究 我们在临床开展13例PKU产前基因诊断结果，其中，应用STR连锁分析准确进行产前基因诊断的有8例，占62%(8/13)，能进行50%排除诊断的有4例，占31%(4/13)，不提供信息的有1例，实际上能提供临床表型诊断的高达11例，占85%(11/13)，与国内文献报道相近[6]。由于STR多态可提供信息量有限，为此，我们采用PCR-DGGE直接检测突变方法，对2例PKU高危胎儿进行了产前基因诊断。以家系9(STR不提供信息)为例，经DGGE检测PAH E7结果，先证者及母亲均为含有正常带型d的4条带型(a、b、c、d)，父亲及胎儿均为d的纯合子(图2)，这一结果提示，先证者从携带者母亲获得突变的PAH基因，胎儿获得了母亲正常的PAH基因，因而排除胎儿为PKU患者，其表型正常。我们联合应用PCR-STR连锁分析及PCR-DGGE突变检测技术完成了13例PKU产前基因诊断，其中绝大部分已产后验证。鉴于此，我们提出如下方案：对于完整的PKU家系，首先选用PCR-STR连锁分析；对于STR多态不提供或不全提供信息时，第2步选用PCR-DGGE突变检测技术，然后二者综合分析。结合STR多态信息量和DGGE的高突变检出率，加上二者的非同位素性使其具有广泛的应用前景。应提及的是当这种联合方式也不能提供诊断时，应进一步检测其他外显子的点突变或用PCR-RFLP连锁分析提高其诊断率。
, 百拇医药
本课题由国家“八五”攻关项目(859180603)资助
参考文献
[1] Nowacki P, Byck S, Prevost L, et al. The PAH mutation analysis consortium database:update 1996. Nucleic Acids Res, 1997, 25(1)∶139-142.
[2] Alexei AG, Randy CE, Eileem RN, et al. A single polymorphic STR system in the human phenylalanine hydroxylase gene permits rapid prenatal diagnosis and carrier screenng for phenylketonuria. Hum Mol Genet, 1993,2(5)∶577-581.
, 百拇医药
[3] 李红杰，张学，金春元，等.PCR-DGGE法筛查PAH基因第6外显子突变——一种新的多态.中华医学遗传学杂志，1997，14(5)∶278-280.
[4] Per G, Valentino R, Nadia C, et al. Mutational spectrum of phenylalanine hydroxylase deficiency in sicily:implications for diagnosis of hyperphenylalaninemia in southern Europe. Hun Mol Genet，1993，2(10)∶1703-1707.
[5] 宋昉，吴冠芸，徐光芝，等.联合应用STR连锁分析与多重等位基因特异PCR进行PKU基因诊断.中华医学遗传学杂志，1997，14(1)∶9.
[6] 郑梅玲，丁琰.用PCR-STR、ASPCR、PCR-SSCP技术对PKU患者进行产前基因诊断.中华医学遗传学杂志，1997，14(6)∶354-367.
(收稿：1998-04-06 修回：1998-09-19), 百拇医药
单位：姜莉 金春莲 张学 林长坤 李红杰 孙桂凤 金春元 孙开来(110001沈阳，中国医科大学遗传学研究室)；佟秉政、曲陆荣(第二临床医院)
关键词：
北方汉族人群PAH基因STR多态性分析及 PKU产前基因诊断研究 苯丙酮尿症(PKU)是由肝脏苯丙氨酸羟化酶(PAH)缺陷引起的常染色体隐性遗传病。临床主要表现为智力低下。研究表明，PKU的分子基础主要是PAH基因的点突变。到1996年，汇集28个国家研究成果的PAH基因突变数据库已登记320余种PAH突变[1]。目前，直接检测PAH基因突变进行PKU基因诊断受到较大限制。我们应用PCR技术，分析了63例遗传上无相关的北方正常汉族个体的STR多态性分布，并联合应用PCR-STR连锁分析及PCR-DGGE突变检测技术，成功地进行了13例PKU高危胎儿的产前基因诊断，同时建立一种安全可靠、简便快速的PCR检测方法。
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1 材料和方法
1.1 样品来源及DNA提取 13个经典型PKU家系的外周血及胎儿羊水(妊娠16～20周)标本由中国医科大学第二临床医院提供。63例遗传上无相关的北方正常汉族个体由中国医科大学第一临床医院提供。按本室常规方法提取基因组DNA。
1.2 方法
1.2.1 PCR-STR连锁分析 根据文献[2]报道合成PCR引物。按前文报道方法PCR扩增后[3]，在含7mol尿素的6%聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离。电泳条件为50℃、40W、1小时30分钟，凝胶经Green-1荧光染料染色30分钟，于自动凝胶成像仪上观察、贮存。
1.2.2 PCR-DGGE突变检测分析 根据文献[4]分别合成用于DGGE的特殊引物E6、E7和E12。方法同前。扩增产物采用DGGE分析，制备6%聚丙烯酰胺/TAE凝胶，变性梯度范围为20%～80%，电泳条件为60℃、150V、6小时。泳毕，凝胶经溴化乙锭染色，于自动凝胶成像仪上观察、贮存。
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2 结果
2.1 STR等位片段长度的多态性分布 应用F-dUTP标记PCR产物经毛细管高压电泳，GeneScan分析随机鉴定5例PKU家系成员STR等位片段长度，再依其为参考分子量标准，检测来自北方地区遗传上无相关的正常汉族个体63人，总计126条染色体，共检测出7种等位片段(表1)，依次为232bp(A)、236bp(B)、240bp(C)、244bp(D)、248bp(E)、252bp(F)和256bp(G)，其等位基因频率分别为0.056、0.103、0.048、0.206、0.444、0.111和0.032。根据如上检测结果计算其PIC为0.731。
表1 北方汉族人群PAH基因STR等位片段的分布
等位片段长度
染色体数
等位片段频率
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多态信息量
232(A)
7
0.056
236(B)
13
0.103
240(C)
6
0.048
244(D)
26
0.206
, 百拇医药
0.731
248(E)
56
0.444
252(F)
14
0.111
256(G)
4
0.032
合计
126
1.000
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2.2 产前基因诊断结果 13个PKU家系的产前基因诊断结果如表2所示。表型正常的11例，其中8例已出生，于生后1～2周取血查血苯丙氨酸浓度均属正常，2例尚未出生，另1例因家庭问题于7个半月终止妊娠，取脐带血验证与羊水结果相同；PKU患儿2例，于5个月引产。产前诊断的代表性结果见图1，2。 表2 PKU家系的产前基因诊断结果及生后验证
家系
STR等位片段
产前诊断结论
综合判断
出生后验证
先证者
父亲
母亲
, http://www.100md.com
胎儿
STR分析
DGGE分析
1
C/E
D/E
C/F
C/D
携带者
出生，正常
2
A/D
A/E
, 百拇医药
D/F
D/E
携带者
出生，正常
3
E/E
D/E
B/E
B/D
正常
出生，正常
4
E/F
, 百拇医药
D/E
E/F
E/F
患儿
5个月引产
5
E/F
E/F
D/E
D/F
携带者
7个半月引产
6
, 百拇医药
F/F
C/F
E/F
C/E
正常
出生，正常
7
D/D
D/E
D/F
D/F
携带者
出生，正常
, 百拇医药
8
E/E
E/F
E/F
E/E
患儿
5个月引产
9
D/E
D/E
D/E
D/E
不提供信息
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E7正常
出生，正常
10
D/E
E/E
A/D
A/E
正常或携带者
出生，正常
11
F/F
E/F
F/F
, 百拇医药
E/F
正常或携带者
出生，正常
12
D/D
D/E
D/D
D/D
携带者或患儿
E7正常
携带者
尚未出生
13
, 百拇医药
B/E
B/F
E/E
E/F
正常或携带者
尚未出生
图1 家系1、2、3的PAH基因PCR-STR连锁分析
图2 家系9的产前基因诊断结果
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3 讨论
3.1 北方汉族人群PAH基因STR多态性 已有的研究表明PAH基因内含子3中存在的STR是迄今为止发现的多态信息量最高的PAH基因内多态标记。1993年，胡流清等报道在白种人检测到9种等位片段，国内宋日 方等[5]在中国正常人和PKU家系中分别检测出7种和9种等位片段，均以240bp和244bp的等位频率最高。我们在63例正常人中检测出7种等位片段，均在已报道的长度范围之内，但等位频率最高的片段为248bp，达44.4%(56/126)，明显高于白种人16%和亚洲日本人12.9%。我们的研究表明248bp可能是中国北方汉族人群中最常见的等位片段，这可能与不同人群、不同地域存在差异有关，对STR连锁分析有意义。我们对PAH基因STR分析得到的多态信息量(polymorphism information contents, PIC)为0.731；实际检测到的杂合子频率为78%(49/63)，明显高于已有报道的64%，可见该STR多态是PKU基因诊断非常有意义的遗传标记。
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3.2 13例PKU产前基因诊断研究 我们在临床开展13例PKU产前基因诊断结果，其中，应用STR连锁分析准确进行产前基因诊断的有8例，占62%(8/13)，能进行50%排除诊断的有4例，占31%(4/13)，不提供信息的有1例，实际上能提供临床表型诊断的高达11例，占85%(11/13)，与国内文献报道相近[6]。由于STR多态可提供信息量有限，为此，我们采用PCR-DGGE直接检测突变方法，对2例PKU高危胎儿进行了产前基因诊断。以家系9(STR不提供信息)为例，经DGGE检测PAH E7结果，先证者及母亲均为含有正常带型d的4条带型(a、b、c、d)，父亲及胎儿均为d的纯合子(图2)，这一结果提示，先证者从携带者母亲获得突变的PAH基因，胎儿获得了母亲正常的PAH基因，因而排除胎儿为PKU患者，其表型正常。我们联合应用PCR-STR连锁分析及PCR-DGGE突变检测技术完成了13例PKU产前基因诊断，其中绝大部分已产后验证。鉴于此，我们提出如下方案：对于完整的PKU家系，首先选用PCR-STR连锁分析；对于STR多态不提供或不全提供信息时，第2步选用PCR-DGGE突变检测技术，然后二者综合分析。结合STR多态信息量和DGGE的高突变检出率，加上二者的非同位素性使其具有广泛的应用前景。应提及的是当这种联合方式也不能提供诊断时，应进一步检测其他外显子的点突变或用PCR-RFLP连锁分析提高其诊断率。
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本课题由国家“八五”攻关项目(859180603)资助
参考文献
[1] Nowacki P, Byck S, Prevost L, et al. The PAH mutation analysis consortium database:update 1996. Nucleic Acids Res, 1997, 25(1)∶139-142.
[2] Alexei AG, Randy CE, Eileem RN, et al. A single polymorphic STR system in the human phenylalanine hydroxylase gene permits rapid prenatal diagnosis and carrier screenng for phenylketonuria. Hum Mol Genet, 1993,2(5)∶577-581.
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[3] 李红杰，张学，金春元，等.PCR-DGGE法筛查PAH基因第6外显子突变——一种新的多态.中华医学遗传学杂志，1997，14(5)∶278-280.
[4] Per G, Valentino R, Nadia C, et al. Mutational spectrum of phenylalanine hydroxylase deficiency in sicily:implications for diagnosis of hyperphenylalaninemia in southern Europe. Hun Mol Genet，1993，2(10)∶1703-1707.
[5] 宋昉，吴冠芸，徐光芝，等.联合应用STR连锁分析与多重等位基因特异PCR进行PKU基因诊断.中华医学遗传学杂志，1997，14(1)∶9.
[6] 郑梅玲，丁琰.用PCR-STR、ASPCR、PCR-SSCP技术对PKU患者进行产前基因诊断.中华医学遗传学杂志，1997，14(6)∶354-367.
(收稿：1998-04-06 修回：1998-09-19), 百拇医药