性别及年龄对外周血淋巴细胞中21号染色体分离的影响
作者：张坚宣 史庆华 潘淑娟 张锡然 单祥年 余龙
单位：张坚宣 史庆华 潘淑娟 张锡然(210097 南京师范大学生物系)；单祥年(南京铁道医学院)；余龙(复旦大学遗传研究所)
关键词：21号染色体；年龄效应；性别差异；染色体不分离
性别及年龄对外周血淋巴细胞中21号 染色体分离的影响 【摘要】 目的 阐明性别与年龄对体细胞中21号染色体分离的影响。方法 用细胞松弛素B处理不同年龄及性别正常人外周血淋巴细胞获得的双核细胞，以21号染色体近着丝粒特异性探针进行荧光原位杂交，同时检测21号染色体丢失及不分离。结果 具有4个信号点的双核细胞数与年龄的相关系数为-0.35(P<0.01)，2及6个信号点的双核细胞数与年龄的相关系数分别为0.18和0.38(P<0.01)，21号染色体不分离数和微核细胞数与年龄的相关系数分别为0.56(P<0.01)和0.70(P<0.01)。结论 在不同年龄正常人外周血淋巴细胞中，微核数随年龄的增加而增加。21号染色体不分离与年龄的关系极显著，无论在体内还是体外，21号染色体不分离远远高于丢失。不同性别体细胞21号染色体不分离差异不大。
, http://www.100md.com
Influence of aging and sex on chromosome 21 segregation
in human lymphocytes
ZHANG Jianxuan*, SHI Qinghua, PAN Shujuan, ZHANG Xiran, SHAN Xiangnian, YU Long
*Department of Biology, Nanjing Normal University, Nanjing,210097 P.R. China E-mail:980265 @ fudam.edu.cn
【Abstract】 Objective To determine the influence of aging and sex on the segregation of chromosome 21. Methods Lymphocytes were obtained from healthy donors of different ages, both sexes, and were treated with cytochalasin B. Binucleated cells were hybridized with chromosome 21 specific probe, and simultaneously, chromosome 21 loss and nondisjunction were detected. Results The coefficients of correlation between age and binucleated cells containing 4,2 and 6 signals were -0.35(P<0.01), 0.18 and 0.38(P<0.01) respectively. The coefficients of correlation between age and nondisjunction of chromosome 21 and micronuclei were 0.56(P<0.01) and 0.70(P<0.01) respectively. Conclusion There is a significant increase with age in the number of micronuclei and missegregation. Nondisjunction of chromosome 21 is much more frequent than loss in vivo and in vitro. No significant difference in nondisjunction between male and female was noted. Age effect is more significant in female than in male.
, 百拇医药
【Key words】 Chromosome 21 Age effect Sex difference Chromosome nondisjunction
21三体是Down综合征(俗称先天愚型)发病的主要原因，也是人类最常见的遗传性疾病。大量资料表明，该病的发生率随母亲年龄增大而呈指数增加[1]。父亲年龄对21三体发生的影响尚无定论[2，3]。由于对生殖细胞的研究受取材的限制，因此，研究不同年龄及性别外周血淋巴细胞中21号染色体不分离的差异，将有助于阐明21三体的发生机理。
以细胞松弛素B(cytochalasin-B)处理人淋巴细胞培养物以获得双核细胞，并以染色体特异的着丝粒DNA探针进行荧光原位杂交，根据杂交信号点在子核中的分布即可同时确定一次细胞分裂过程中的染色体不分离和丢失情况[4]。我们利用这种方法对不同年龄及性别外周血淋巴细胞中21号染色体的不分离情况进行研究，以期阐明年龄及性别对体细胞中21号染色体丢失及不分离的影响。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 探针制备 定位于21q11的酵母人工染色体(YAC)克隆881D2，由上海瑞金医院陈竺院士惠赠。探针制备参照史庆华[5]报道的方法进行。
1.2 实验对象 健康人群按年龄分为：Ⅰ组：20人(女7人，男13人)，0～10岁，平均年龄5.02岁；Ⅱ组：19人(女9人，男10人)，20～30岁，平均年龄25.00岁；Ⅲ组：15人(女8人，男7人)，40～50岁，平均年龄44.53岁；Ⅳ组：14人(女7人，男7人)，60～70岁，平均年龄64.50岁。
1.3 细胞培养及处理 抽取每人外周静脉血2ml，按常规方法进行细胞培养。在培养至第44小时，加入细胞松弛素B(Sigma公司)至终浓度为6μg/ml，避光培养至72小时，收获细胞。
1.4 原位杂交
, 百拇医药
1.4.1 标本预处理 空气干燥法制片，Carnoy液固定1小时。系列乙醇脱水；42℃干燥过夜。蛋白酶K(1μg/ml，于20mol/L Tris-HCl，2mmol/L CaCl2中)消化10分钟(37℃)。PBS洗5分钟。4%甲醛固定。系列乙醇(70%，90%，100%)脱水。
1.4.2 探针变性 取标记好的探针，按200ng/μl加入杂交液(50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，50mmol/L PBS，2×SSC)。取4μl探针液，加6μl人胎盘DNA(10mg/ml溶解于杂交液中，超声打碎至<1kb)。75℃变性8分钟，37℃预杂交20分钟，然后置冰浴中待用。
1.4.3 标本变性及杂交 标本于65℃变性液(70%甲酰胺，2×SSC)中处理2分钟，系列乙醇脱水。将变性后的探针液置于标本上，加盖片，石蜡封闭边缘后，置37℃湿皿中杂交过夜。
1.4.4 检测 去盖玻片，将标本依次置预温至42℃的50%甲酰胺(4×SSC)和2×SSC中各两次，每次5分钟。依次加avidin-FITC、小鼠anti-avidin-FITC和兔抗鼠Ig-FITC20μl，37℃孵育30分钟，其间分别在Tween-20(0.05%，4×SSC)中洗两次，每次5分钟。PI/Antifade(100ng/ml)染色。
, http://www.100md.com
1.5 镜检 用Olympus BH-2荧光显微镜观察，每例分析1 000个细胞膜完整的双核细胞。记录子核及微核(如果有)中的信号点数及微核数。
1.6 统计学处理 用线性回归法分别判断微核率、染色体不分离率与年龄间的关系。用χ2检验判断微核率和染色体不分离率等在不同年龄组及性别间的差异。
2 结果
不同年龄组人的外周血淋巴细胞培养物，经细胞松驰素B处理可获得双核细胞；用21号染色体特异的近着丝粒DNA探针与之进行荧光原位杂交，可观察到细胞中21号染色体的数目及在一次细胞分裂时的分离情况。根据二倍体双核细胞中杂交信号点在子核及微核(如果有)中的分布，即可同时确定21号染色体的不分离和/或丢失，并可区分体内原有的与体外一次分裂所形成的非整倍体(图1～5)。如体内非整倍体分裂后双核细胞两个子核中信号点为3∶3或1∶1(图4，图3)，而体外一次分裂后其子核信号为3∶1或2∶1(1条21号染色体丢失)，见图2，图5。
, http://www.100md.com
图1 21号染色体正常分离的双核细胞 每个子核中有两个信号点 图2 21号染色体不分离的双核细胞 一个子核中有1个信号点，另一个有3个信号点 图3 21号染色体单体形成的双核细胞 每个子核中有1个信号点 图4 21号染色体三体形成的双核细胞 每个子核中有3个信号点 图5 21号染色体丢失 一个子核中有两个信号点，另一个有1个信号点，微核中有1个信号点
Fig 1 Normal segregation Two signals in each daughter nucleus Fig 2 Non-disjunction Three signals in one daughter nucleus and one in the other Fig 3 Normal segregation of monosomy 21 cells One signal in each daughter nucleus Fig 4 Normal segregation of trisomy 21 cells Three signals in each daughter nucleus
, 百拇医药
Fig 5 Chromosome loss Two signals in one nucleus, one in the other and one in the micronucleus
2.1 根据21号染色体(信号点)的数目对双核细胞进行分类(表1) 990.20‰以上的双核细胞具有4个信号点，具有2及6个信号点的平均分别为3.35‰和3.37‰。且随年龄增长，4个信号点细胞频率显著减少(P<0.01)，其中，40岁以上年龄组中4个信号点细胞率降低显著，6个信号点细胞率显著增加(P<0.05)，同组中不同性别间无显著差异。
表1 按照双核细胞中21号染色体信号点数分类
Tab 1 Distribution of binucleated cells according to the number of signals of chromosome 21
, http://www.100md.com
Age group
(年龄组)
Sex
(性别)
Number of signals in each binucleated cells(细胞中信号点数)
2
±s‰
3±s‰
, http://www.100md.com
4±s‰
5±s‰
6±s‰
8±s‰
, 百拇医药
Ⅰ
Female
3.29±1.60
3.00±1.83
990.30
±3.69
1.86
±0.90
1.43
±1.62
0.14
±0.38
Male
, 百拇医药
2.46±1.08
3.54±2.71
990.00
±3.37
1.08
±1.27
2.69
±1.86
0.08
±0.27
Total
2.75±1.30
, 百拇医药 3.35±2.41
990.20
±3.38
1.35
±1.19
2.25
±1.84
0.10
±0.30
Ⅱ
Female
2.78±1.56
4.22±1.20
, http://www.100md.com
988.78
±4.21
1.33
±2.24
2.33
±2.87
0.56
±1.01
Male
3.70±2.05
2.10±1.22
989.40
±3.77
, 百拇医药
1.10
±1.76
3.30
±1.62
0.40
±0.66
Total
3.26±1.89
3.11±1.59
989.10
±3.88
1.21
±1.94
, 百拇医药
2.84
±1.76
0.47
±0.82
Ⅲ
Female
3.50±1.41
4.50±2.78
985.88
±5.441
1.75
±2.12
, 百拇医药
4.25
±3.49
1.13
±2.03
Male
4.71±1.98
3.29±1.28
985.29
±3.492
1.43
±1.50
4.71
, 百拇医药
±2.60
1.00
±1.07
Total
4.07±1.77
3.93±2.17
985.07
±4.423
1.60
±1.78
4.48
±2.99
, 百拇医药
1.07
±1.57
Ⅳ
Female
4.29±1.384
3.00±1.53
986.29
±4.68
1.43
±1.81
4.29
±2.56
, 百拇医药
0.71
±0.76
Male
2.86±1.96
3.00±1.60
987.57
±3.85
1.29
±1.58
4.71
±1.95
0.42
±0.73
, 百拇医药
Total
3.57±1.80
3.00±1.51
986.96
±4.15
1.38
±1.63
4.50
±2.32
0.57
±0.73
Total(总计)
, http://www.100md.com 3.35±1.75
3.33±2.01
988.66
±4.32
1.37
±1.65
3.37
±2.43
0.51
±0.99
Correlation
coefficients
, 百拇医药
(相关系数)
Female
0.25
-0.05
-0.355
0.07
0.435
0.14
Male
0.16
-0.03
-0.345
, 百拇医药
0.07
0.365
0.29
Total
0.18
0.02
-0.356
0.04
0.386
0.24
Female(女性)，Male(男性)。1：与上一组女性相比P<0.05；2：与上一组男性相比P<0.05；3：与上一年龄组相比P<0.05；4：与上一组女性相比P<0.01；5：P<0.05；6：P<0.01 1：Compared with female of the former group,P<0.05；2：Compared with male of the former group,P<0.05；3：Compared with the former age group,P<0.05；4：Compared with female of the former group P<0.01；5：P<0.05；6：P<0.01
, 百拇医药
2.2 二倍体双核细胞中21号染色体的分离异常(不分离和丢失) 根据二倍体双核细胞中杂交信号点在子核及微核(如果有)中的分布即可同时确定21号染色体的不分离和/或丢失。如表2，随年龄增加，不同性别染色体分离和总的分离异常率均逐渐升高(P<0.01)。20岁以上年龄组21号染色体不分离率增长显著。在各组中，21号染色体的丢失随年龄增加有所上升，但平均仅为0.24‰。各组性别间差异不大。
表2 二倍体细胞中21号染色体的分离异常
Tab 2 Chromosome 21 segregation in binucleated cells contaning 4 signals
Age group
(年龄组)
Sex
, http://www.100md.com
(性别)
Chromosome
non-disjunction
(染色体不分离)±s
Chromosome
loss
(染色体丢失)
±s
Chromosome
missegregation
, 百拇医药
(染色体分离错误)±s
Age group
(年龄组)
Sex
(性别)
Chromosome
non-disjunction
(染色体不分离)±s
, 百拇医药
Chromosome
loss
(染色体丢失)±s
Chromosome
missegregation
(染色体分离错误)±s
Ⅰ
, 百拇医药 Female
2.71
±2.29
0
±0
2.71
±2.29
Ⅳ
Female
10.29
±3.68
0.43
±0.49
, http://www.100md.com
10.71
±3.59
Male
4.15
±2.47
0.15
±0.36
4.31
±2.47
Male
9.00
±3.38
1.00
, 百拇医药
±1.41
10.00
±3.854
Total
3.65
±2.50
0.10
±0.30
3.75
±2.47
Total
9.64
, 百拇医药 ±3.46
0.71
±1.10
10.36
±3.62
Ⅱ
Female
6.11
±2.671
0.22
±0.42
6.33
±2.781
, http://www.100md.com
Total(总计)
6.62
±3.75
0.24
±0.34
6.87
±3.89
Male
6.30
±2.102
0.20
±0.40
, http://www.100md.com 6.50
±2.162
Correlation
coefficients
(相关系数)
Female
0.606
0.30
0.636
, http://www.100md.com
Male
0.566
0.30
0.556
Total
0.526
0.356
0.586
Female(女性)，Male(男性)；1：与上一组女性相比P<0.01；2：与上一组男性相比P<0.05；3：与上一年龄组相比P<0.01；4：与上一组男性相比P<0.01；5：与上一年龄组相比P<0.05；6：P<0.01 1：Compared with female of the former groupo, P<0.01；2：Compared with male of the former group, P<0.05；3：Compared with the former age group, P<0.01；4：Compared with male of the former age group, P<0.01；5：Compared with the former age group, P<0.05；6：P<0.01
, http://www.100md.com
2.3 微核率与年龄的关系 不同性别中微核率与年龄均有极显著的相关性(表3)，而且20岁以上年龄组增长显著。在所分析的微核中，21号染色体阳性的约占0.38‰，且随年龄增长而增加(P<0.05)。
表3 双核细胞中微核率
Tab 3 Micronuclei in binucleated cells
Age group
(年龄组)
Sex
(性别)
Micronuclei
(微核)±s‰
, 百拇医药
Micronclei of chromosome 21
(21号染色体阳性微核)±s‰
Ⅰ
Female
2.00
±2.31
0.14
±0.38
Male
1.54
, http://www.100md.com
±1.55
0.23
±0.42
Total
1.70
±1.79
0.2
±0.40
Ⅱ
Female
4.67
±3.941
0.22
, http://www.100md.com
±0.44
Male
5.30
±1.902
0.30
±0.46
Total
5.00
±2.92
0.26
±0.44
Ⅲ
Female
, http://www.100md.com
8.38
±4.631
0.63
±0.74
Male
8.57
±4.172
0.28
±0.45
Total
8.47
±4.263
, 百拇医药
0.47
±0.62
Ⅳ
Female
13.00
±3.16
0.43
±0.53
Male
9.43
±4.34
1.00
±1.41
, 百拇医药
Total
11.00
±4.114
0.71
±0.69
Total(总计)
6.07
±4.84
0.38
±0.69
Correlation
coefficients
, 百拇医药
(相关系数)
Female
0.765
0.21
Male
0.685
0.29
Total
0.705
0.276
Female(女性)，Male(男性)；1：与上一组女性相比P<0.01；2：与上一组男性相比P<0.01；3：与上一年龄组相比P<0.01；4：与上一年龄组相比P<0.05；5：P<0.01；6：P<0.05 1：Compared with female of the former group,P<0.01；2：Compared with male of the former group, P<0.01；3：Compared with the former age group, P<0.01；4：Compared with the former age group, P<0.05；5：P<0.01；6：P<0.05
, http://www.100md.com
3 讨论
用细胞松弛素B处理健康人外周血淋巴细胞培养物，阻断胞质分裂，获得双核细胞，然后以染色体特异的着丝粒探针与之进行间期核荧光原位杂交，则可同时观察到一次有丝分裂时的染色体的不分离及丢失。此时，如果仅以二倍体双核细胞为分析对象，则可克服原来非整倍体研究方法，如计数中期染色体、间期核原位杂交、CREST染色等的种种不足，获取在正常细胞或经放射线、化学因子处理的细胞中染色体分离的准确数据。而且，利用这一方法，还可以区分体内原有的和本次分裂形成的非整倍体[1]。体内原有的非整倍体细胞，如单体和三体细胞，经一次核分裂后，其两个子核中的信号点分布分别表现为1∶1和3∶3(图3，图4)，而本次分裂产生的非整倍体则表现为1∶3或2∶1(1条染色单体丢失，见图2，图5)。另外，本实验中所用细胞核松弛素B剂量不影响染色体的正常分离[4]。如表2，4个信号点的双核细胞在所分析的双核细胞中高达988.66‰以上，一般认为它们来源于体内的二倍体细胞。2及6个信号点细胞则分别主要来源于体内的21单体和三体细胞。3及5个信号点细胞有可能是信号点重叠、着丝粒早熟分离或21号染色体在探针的靶区域断裂所致[6]。3及5个信号点细胞不象2、6及4个信号点细胞随年龄增加而增减的结果也证实了这一看法(表1)。8个信号点细胞则可能是由于其细胞核处于G2期，两条染色单体分离所致。
, http://www.100md.com
二倍体双核细胞的分析结果表明，21号染色体丢失的发生率很低，平均0.24‰，且与年龄变化关系不大(表2)。体内单体细胞来自染色体不分离和丢失。本文单体细胞率略低于三体细胞率，这可能是由于人为因素和个体差异造成的，对女性研究(另文报道)表明，体内21号染色体丢失率也很低(0.42‰)(体内21号染色体的丢失=2信号点双核细胞率-6信号点双核细胞率)。如表2，在各年龄组，21号染色体的不分离均显著高于丢失，这可能与体内系统对两种细胞系的选择能力不同有关，即对三体细胞的选择压力大于单体的。两种细胞在体内外所占的比例也恰恰证明了这一观点，如三体细胞在体内外平均分别占3.37‰和6.62‰，远高于单体细胞率(表1，2)。但无论体内还是体外的数据均表明，在外周血淋巴细胞中，21号染色体的分离异常以不分离为主。这与淋巴细胞中X染色体的分离异常(不分离和丢失的频率相当)不同，而与目前研究过的常染色体，如1、8和17号染色体的不分离远远高于其丢失的结果一致[7-9]。看来，性染色体和常染色体在细胞分裂后期的分离机理是不同的。
, 百拇医药
根据21号染色体的分离数据，我们可以推算出人类基因组中全部染色体的不分离、丢失和总的分离异常率平均为14.56%(6.62‰×22)、0.53%(0.24‰×22)和15.1%(6.87‰×22)，与Elhajouji等[8]和Kirsch-Volders等[9]根据1和17号染色体在淋巴细胞中的分离数据推算的结果极为接近。但需要指出的是，我们考虑性染色体和常染色体的分离机理不同，因此计算时未把性染色体计算在内，而以上作者未考虑这一问题。不同性别间，21号染色体分离差异不大，女性体细胞微核率较男性略高，而且随年龄增加，女性微核率增长较快，这与Scarpato等[10]的报道是一致的。在体外21号染色体不分离率也是女性略高于男性。年龄对21号染色体分离(不分离，丢失)和微核的影响在女性均较男性强(表1～3)，这可能是不同性别体内细胞微环境的差异造成的。减数分裂中，21号染色体不分离率随女性年龄增长而显著增加，而与男性年龄的关系尚无定论。而我们的结果表明，无论在体内还是体外,不同性别体细胞21号染色体不分离均有显著的年龄效应。分子生物学研究表明，随女性年龄增加,同源染色体间的交换减少可能是21号染色体不分离增加的主要原因[10]。但有关有丝分裂过程中，21号染色体不分离随年龄增长而增加的机理则尚不清楚。但我们的结果至少表明，在体细胞中，不同性别21号染色体的不分离也存在年龄效应。女性较男性的年龄效应强。
, 百拇医药
参考文献
[1] Yoon PW, Freeman SB, Sherman SL, et al. Advanced maternal age and the risk of Down syndrome characterized by the meiotic stage of chromosomal error: a population-based study. Am J Hum Genet, 1996, 58(3)∶628-633.
[2] Penrose LS. The relative effects of paternal and maternal age in mongolism. J Genet，1993，27(2)∶219-244.
[3] Hook EB, Cross PK, Regal RR. Factual, statistical and social issues in search for a paternal age effect for Down syndrome. Hum Genet, 1993, 85(3)∶387-388.
, 百拇医药
[4] Zijno A, Marcon F, Leopardi P, et al. Simultaneous detection of X-chromosome loss and non-disjunction in cytokinesis-blocked human lymphocytes by in situ hybridization with a centromeric DNA probe; implications for the human lymphocyte in vitro micronucleus assay using cytochalsin B. Mutagenesis，1994，9(3)∶225-232.
[5] 史庆华，张坚宣，潘淑娟，等.用万能引物PCR法从YAC中分离制备荧光原位杂交探针的研究.遗传学报，1998，25(5)∶403-408.
[6] Eastmond DA. Advantages and limitations of using fluorescence in situ hybridization of the detection of aneuploidy in interphase human cells. Mutat Res, 1995, 203(2)∶153-162.
, http://www.100md.com
[7] Zijno A. Analysis of chromosome segregation in cytokinesis blocked human lymphocytes: non-disjunction is the prevalent damage resolution from low dose exposure to spindle poisons. Mutagenesis, 1996, 11(4)∶335-340.
[8] Elhajouji A, Tibaldi F, Kirsch-Volders M, et al. Indication for thresholds of chromosome non-disjunction versus chromosome lagging induced by spindle inhibitors in vitro in human lymphocytes. Mutagenesis, 1997, 12(3)∶133-140.
, 百拇医药
[9] Krisch-Volders M, Tallon I, Tanzarella C, et al. Mitotic non-disjunction as a mechanism for in vitro aneuploidy induction by X-rays in primary human cells. Mutagenesis, 1996, 11(4)∶307-313.
[10] Scarpato R, Landini E, Migliore L. Acrocentric chromosome frequency in spontanuous human lymphocyte micronuclei, evaluated by dual-color hybridization, is neither sex- nor age-related. Mutat Res, 1996, 372(2)∶195-205.
[11] Sherman SL, Petersen MB, Freemen SB, et al. Non-disjunction of chromosome 21 in maternal meiosis I: evidence for a maternal-age dependent mechanism, involving reduced recombination. Hum Mol Genet, 1994, 3(9)∶1529-1535.
(收稿：1998-05-04 修回：1998-12-02), 百拇医药
单位：张坚宣 史庆华 潘淑娟 张锡然(210097 南京师范大学生物系)；单祥年(南京铁道医学院)；余龙(复旦大学遗传研究所)
关键词：21号染色体；年龄效应；性别差异；染色体不分离
性别及年龄对外周血淋巴细胞中21号 染色体分离的影响 【摘要】 目的 阐明性别与年龄对体细胞中21号染色体分离的影响。方法 用细胞松弛素B处理不同年龄及性别正常人外周血淋巴细胞获得的双核细胞，以21号染色体近着丝粒特异性探针进行荧光原位杂交，同时检测21号染色体丢失及不分离。结果 具有4个信号点的双核细胞数与年龄的相关系数为-0.35(P<0.01)，2及6个信号点的双核细胞数与年龄的相关系数分别为0.18和0.38(P<0.01)，21号染色体不分离数和微核细胞数与年龄的相关系数分别为0.56(P<0.01)和0.70(P<0.01)。结论 在不同年龄正常人外周血淋巴细胞中，微核数随年龄的增加而增加。21号染色体不分离与年龄的关系极显著，无论在体内还是体外，21号染色体不分离远远高于丢失。不同性别体细胞21号染色体不分离差异不大。
, http://www.100md.com
Influence of aging and sex on chromosome 21 segregation
in human lymphocytes
ZHANG Jianxuan*, SHI Qinghua, PAN Shujuan, ZHANG Xiran, SHAN Xiangnian, YU Long
*Department of Biology, Nanjing Normal University, Nanjing,210097 P.R. China E-mail:980265 @ fudam.edu.cn
【Abstract】 Objective To determine the influence of aging and sex on the segregation of chromosome 21. Methods Lymphocytes were obtained from healthy donors of different ages, both sexes, and were treated with cytochalasin B. Binucleated cells were hybridized with chromosome 21 specific probe, and simultaneously, chromosome 21 loss and nondisjunction were detected. Results The coefficients of correlation between age and binucleated cells containing 4,2 and 6 signals were -0.35(P<0.01), 0.18 and 0.38(P<0.01) respectively. The coefficients of correlation between age and nondisjunction of chromosome 21 and micronuclei were 0.56(P<0.01) and 0.70(P<0.01) respectively. Conclusion There is a significant increase with age in the number of micronuclei and missegregation. Nondisjunction of chromosome 21 is much more frequent than loss in vivo and in vitro. No significant difference in nondisjunction between male and female was noted. Age effect is more significant in female than in male.
, 百拇医药
【Key words】 Chromosome 21 Age effect Sex difference Chromosome nondisjunction
21三体是Down综合征(俗称先天愚型)发病的主要原因，也是人类最常见的遗传性疾病。大量资料表明，该病的发生率随母亲年龄增大而呈指数增加[1]。父亲年龄对21三体发生的影响尚无定论[2，3]。由于对生殖细胞的研究受取材的限制，因此，研究不同年龄及性别外周血淋巴细胞中21号染色体不分离的差异，将有助于阐明21三体的发生机理。
以细胞松弛素B(cytochalasin-B)处理人淋巴细胞培养物以获得双核细胞，并以染色体特异的着丝粒DNA探针进行荧光原位杂交，根据杂交信号点在子核中的分布即可同时确定一次细胞分裂过程中的染色体不分离和丢失情况[4]。我们利用这种方法对不同年龄及性别外周血淋巴细胞中21号染色体的不分离情况进行研究，以期阐明年龄及性别对体细胞中21号染色体丢失及不分离的影响。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 探针制备 定位于21q11的酵母人工染色体(YAC)克隆881D2，由上海瑞金医院陈竺院士惠赠。探针制备参照史庆华[5]报道的方法进行。
1.2 实验对象 健康人群按年龄分为：Ⅰ组：20人(女7人，男13人)，0～10岁，平均年龄5.02岁；Ⅱ组：19人(女9人，男10人)，20～30岁，平均年龄25.00岁；Ⅲ组：15人(女8人，男7人)，40～50岁，平均年龄44.53岁；Ⅳ组：14人(女7人，男7人)，60～70岁，平均年龄64.50岁。
1.3 细胞培养及处理 抽取每人外周静脉血2ml，按常规方法进行细胞培养。在培养至第44小时，加入细胞松弛素B(Sigma公司)至终浓度为6μg/ml，避光培养至72小时，收获细胞。
1.4 原位杂交
, 百拇医药
1.4.1 标本预处理 空气干燥法制片，Carnoy液固定1小时。系列乙醇脱水；42℃干燥过夜。蛋白酶K(1μg/ml，于20mol/L Tris-HCl，2mmol/L CaCl2中)消化10分钟(37℃)。PBS洗5分钟。4%甲醛固定。系列乙醇(70%，90%，100%)脱水。
1.4.2 探针变性 取标记好的探针，按200ng/μl加入杂交液(50%甲酰胺，10%硫酸葡聚糖，50mmol/L PBS，2×SSC)。取4μl探针液，加6μl人胎盘DNA(10mg/ml溶解于杂交液中，超声打碎至<1kb)。75℃变性8分钟，37℃预杂交20分钟，然后置冰浴中待用。
1.4.3 标本变性及杂交 标本于65℃变性液(70%甲酰胺，2×SSC)中处理2分钟，系列乙醇脱水。将变性后的探针液置于标本上，加盖片，石蜡封闭边缘后，置37℃湿皿中杂交过夜。
1.4.4 检测 去盖玻片，将标本依次置预温至42℃的50%甲酰胺(4×SSC)和2×SSC中各两次，每次5分钟。依次加avidin-FITC、小鼠anti-avidin-FITC和兔抗鼠Ig-FITC20μl，37℃孵育30分钟，其间分别在Tween-20(0.05%，4×SSC)中洗两次，每次5分钟。PI/Antifade(100ng/ml)染色。
, http://www.100md.com
1.5 镜检 用Olympus BH-2荧光显微镜观察，每例分析1 000个细胞膜完整的双核细胞。记录子核及微核(如果有)中的信号点数及微核数。
1.6 统计学处理 用线性回归法分别判断微核率、染色体不分离率与年龄间的关系。用χ2检验判断微核率和染色体不分离率等在不同年龄组及性别间的差异。
2 结果
不同年龄组人的外周血淋巴细胞培养物，经细胞松驰素B处理可获得双核细胞；用21号染色体特异的近着丝粒DNA探针与之进行荧光原位杂交，可观察到细胞中21号染色体的数目及在一次细胞分裂时的分离情况。根据二倍体双核细胞中杂交信号点在子核及微核(如果有)中的分布，即可同时确定21号染色体的不分离和/或丢失，并可区分体内原有的与体外一次分裂所形成的非整倍体(图1～5)。如体内非整倍体分裂后双核细胞两个子核中信号点为3∶3或1∶1(图4，图3)，而体外一次分裂后其子核信号为3∶1或2∶1(1条21号染色体丢失)，见图2，图5。
, http://www.100md.com
图1 21号染色体正常分离的双核细胞 每个子核中有两个信号点 图2 21号染色体不分离的双核细胞 一个子核中有1个信号点，另一个有3个信号点 图3 21号染色体单体形成的双核细胞 每个子核中有1个信号点 图4 21号染色体三体形成的双核细胞 每个子核中有3个信号点 图5 21号染色体丢失 一个子核中有两个信号点，另一个有1个信号点，微核中有1个信号点
Fig 1 Normal segregation Two signals in each daughter nucleus Fig 2 Non-disjunction Three signals in one daughter nucleus and one in the other Fig 3 Normal segregation of monosomy 21 cells One signal in each daughter nucleus Fig 4 Normal segregation of trisomy 21 cells Three signals in each daughter nucleus
, 百拇医药
Fig 5 Chromosome loss Two signals in one nucleus, one in the other and one in the micronucleus
2.1 根据21号染色体(信号点)的数目对双核细胞进行分类(表1) 990.20‰以上的双核细胞具有4个信号点，具有2及6个信号点的平均分别为3.35‰和3.37‰。且随年龄增长，4个信号点细胞频率显著减少(P<0.01)，其中，40岁以上年龄组中4个信号点细胞率降低显著，6个信号点细胞率显著增加(P<0.05)，同组中不同性别间无显著差异。
表1 按照双核细胞中21号染色体信号点数分类
Tab 1 Distribution of binucleated cells according to the number of signals of chromosome 21
, http://www.100md.com
Age group
(年龄组)
Sex
(性别)
Number of signals in each binucleated cells(细胞中信号点数)
2
±s‰3
±s‰, http://www.100md.com
4
±s‰5
±s‰6
±s‰8
±s‰, 百拇医药
Ⅰ
Female
3.29±1.60
3.00±1.83
990.30
±3.69
1.86
±0.90
1.43
±1.62
0.14
±0.38
Male
, 百拇医药
2.46±1.08
3.54±2.71
990.00
±3.37
1.08
±1.27
2.69
±1.86
0.08
±0.27
Total
2.75±1.30
, 百拇医药 3.35±2.41
990.20
±3.38
1.35
±1.19
2.25
±1.84
0.10
±0.30
Ⅱ
Female
2.78±1.56
4.22±1.20
, http://www.100md.com
988.78
±4.21
1.33
±2.24
2.33
±2.87
0.56
±1.01
Male
3.70±2.05
2.10±1.22
989.40
±3.77
, 百拇医药
1.10
±1.76
3.30
±1.62
0.40
±0.66
Total
3.26±1.89
3.11±1.59
989.10
±3.88
1.21
±1.94
, 百拇医药
2.84
±1.76
0.47
±0.82
Ⅲ
Female
3.50±1.41
4.50±2.78
985.88
±5.441
1.75
±2.12
, 百拇医药
4.25
±3.49
1.13
±2.03
Male
4.71±1.98
3.29±1.28
985.29
±3.492
1.43
±1.50
4.71
, 百拇医药
±2.60
1.00
±1.07
Total
4.07±1.77
3.93±2.17
985.07
±4.423
1.60
±1.78
4.48
±2.99
, 百拇医药
1.07
±1.57
Ⅳ
Female
4.29±1.384
3.00±1.53
986.29
±4.68
1.43
±1.81
4.29
±2.56
, 百拇医药
0.71
±0.76
Male
2.86±1.96
3.00±1.60
987.57
±3.85
1.29
±1.58
4.71
±1.95
0.42
±0.73
, 百拇医药
Total
3.57±1.80
3.00±1.51
986.96
±4.15
1.38
±1.63
4.50
±2.32
0.57
±0.73
Total(总计)
, http://www.100md.com 3.35±1.75
3.33±2.01
988.66
±4.32
1.37
±1.65
3.37
±2.43
0.51
±0.99
Correlation
coefficients
, 百拇医药
(相关系数)
Female
0.25
-0.05
-0.355
0.07
0.435
0.14
Male
0.16
-0.03
-0.345
, 百拇医药
0.07
0.365
0.29
Total
0.18
0.02
-0.356
0.04
0.386
0.24
Female(女性)，Male(男性)。1：与上一组女性相比P<0.05；2：与上一组男性相比P<0.05；3：与上一年龄组相比P<0.05；4：与上一组女性相比P<0.01；5：P<0.05；6：P<0.01 1：Compared with female of the former group,P<0.05；2：Compared with male of the former group,P<0.05；3：Compared with the former age group,P<0.05；4：Compared with female of the former group P<0.01；5：P<0.05；6：P<0.01
, 百拇医药
2.2 二倍体双核细胞中21号染色体的分离异常(不分离和丢失) 根据二倍体双核细胞中杂交信号点在子核及微核(如果有)中的分布即可同时确定21号染色体的不分离和/或丢失。如表2，随年龄增加，不同性别染色体分离和总的分离异常率均逐渐升高(P<0.01)。20岁以上年龄组21号染色体不分离率增长显著。在各组中，21号染色体的丢失随年龄增加有所上升，但平均仅为0.24‰。各组性别间差异不大。
表2 二倍体细胞中21号染色体的分离异常
Tab 2 Chromosome 21 segregation in binucleated cells contaning 4 signals
Age group
(年龄组)
Sex
, http://www.100md.com
(性别)
Chromosome
non-disjunction
(染色体不分离)
±sChromosome
loss
(染色体丢失)
±s
Chromosome
missegregation
, 百拇医药
(染色体分离错误)
±sAge group
(年龄组)
Sex
(性别)
Chromosome
non-disjunction
(染色体不分离)
±s, 百拇医药
Chromosome
loss
(染色体丢失)
±sChromosome
missegregation
(染色体分离错误)
±sⅠ
, 百拇医药 Female
2.71
±2.29
0
±0
2.71
±2.29
Ⅳ
Female
10.29
±3.68
0.43
±0.49
, http://www.100md.com
10.71
±3.59
Male
4.15
±2.47
0.15
±0.36
4.31
±2.47
Male
9.00
±3.38
1.00
, 百拇医药
±1.41
10.00
±3.854
Total
3.65
±2.50
0.10
±0.30
3.75
±2.47
Total
9.64
, 百拇医药 ±3.46
0.71
±1.10
10.36
±3.62
Ⅱ
Female
6.11
±2.671
0.22
±0.42
6.33
±2.781
, http://www.100md.com
Total(总计)
6.62
±3.75
0.24
±0.34
6.87
±3.89
Male
6.30
±2.102
0.20
±0.40
, http://www.100md.com 6.50
±2.162
Correlation
coefficie
nts(相关系数)
Female
0.606
0.30
0.636
, http://www.100md.com
Male
0.566
0.30
0.556
Total
0.526
0.356
0.586
Female(女性)，Male(男性)；1：与上一组女性相比P<0.01；2：与上一组男性相比P<0.05；3：与上一年龄组相比P<0.01；4：与上一组男性相比P<0.01；5：与上一年龄组相比P<0.05；6：P<0.01 1：Compared with female of the former groupo, P<0.01；2：Compared with male of the former group, P<0.05；3：Compared with the former age group, P<0.01；4：Compared with male of the former age group, P<0.01；5：Compared with the former age group, P<0.05；6：P<0.01
, http://www.100md.com
2.3 微核率与年龄的关系 不同性别中微核率与年龄均有极显著的相关性(表3)，而且20岁以上年龄组增长显著。在所分析的微核中，21号染色体阳性的约占0.38‰，且随年龄增长而增加(P<0.05)。
表3 双核细胞中微核率
Tab 3 Micronuclei in binucleated cells
Age group
(年龄组)
Sex
(性别)
Micronuclei
(微核)
±s‰, 百拇医药
Micronclei of chromosome 21
(21号染色体阳性微核)
±s‰Ⅰ
Female
2.00
±2.31
0.14
±0.38
Male
1.54
, http://www.100md.com
±1.55
0.23
±0.42
Total
1.70
±1.79
0.2
±0.40
Ⅱ
Female
4.67
±3.941
0.22
, http://www.100md.com
±0.44
Male
5.30
±1.902
0.30
±0.46
Total
5.00
±2.92
0.26
±0.44
Ⅲ
Female
, http://www.100md.com
8.38
±4.631
0.63
±0.74
Male
8.57
±4.172
0.28
±0.45
Total
8.47
±4.263
, 百拇医药
0.47
±0.62
Ⅳ
Female
13.00
±3.16
0.43
±0.53
Male
9.43
±4.34
1.00
±1.41
, 百拇医药
Total
11.00
±4.114
0.71
±0.69
Total(总计)
6.07
±4.84
0.38
±0.69
Correlation
coefficients
, 百拇医药
(相关系数)
Female
0.765
0.21
Male
0.685
0.29
Total
0.705
0.276
Female(女性)，Male(男性)；1：与上一组女性相比P<0.01；2：与上一组男性相比P<0.01；3：与上一年龄组相比P<0.01；4：与上一年龄组相比P<0.05；5：P<0.01；6：P<0.05 1：Compared with female of the former group,P<0.01；2：Compared with male of the former group, P<0.01；3：Compared with the former age group, P<0.01；4：Compared with the former age group, P<0.05；5：P<0.01；6：P<0.05
, http://www.100md.com
3 讨论
用细胞松弛素B处理健康人外周血淋巴细胞培养物，阻断胞质分裂，获得双核细胞，然后以染色体特异的着丝粒探针与之进行间期核荧光原位杂交，则可同时观察到一次有丝分裂时的染色体的不分离及丢失。此时，如果仅以二倍体双核细胞为分析对象，则可克服原来非整倍体研究方法，如计数中期染色体、间期核原位杂交、CREST染色等的种种不足，获取在正常细胞或经放射线、化学因子处理的细胞中染色体分离的准确数据。而且，利用这一方法，还可以区分体内原有的和本次分裂形成的非整倍体[1]。体内原有的非整倍体细胞，如单体和三体细胞，经一次核分裂后，其两个子核中的信号点分布分别表现为1∶1和3∶3(图3，图4)，而本次分裂产生的非整倍体则表现为1∶3或2∶1(1条染色单体丢失，见图2，图5)。另外，本实验中所用细胞核松弛素B剂量不影响染色体的正常分离[4]。如表2，4个信号点的双核细胞在所分析的双核细胞中高达988.66‰以上，一般认为它们来源于体内的二倍体细胞。2及6个信号点细胞则分别主要来源于体内的21单体和三体细胞。3及5个信号点细胞有可能是信号点重叠、着丝粒早熟分离或21号染色体在探针的靶区域断裂所致[6]。3及5个信号点细胞不象2、6及4个信号点细胞随年龄增加而增减的结果也证实了这一看法(表1)。8个信号点细胞则可能是由于其细胞核处于G2期，两条染色单体分离所致。
, http://www.100md.com
二倍体双核细胞的分析结果表明，21号染色体丢失的发生率很低，平均0.24‰，且与年龄变化关系不大(表2)。体内单体细胞来自染色体不分离和丢失。本文单体细胞率略低于三体细胞率，这可能是由于人为因素和个体差异造成的，对女性研究(另文报道)表明，体内21号染色体丢失率也很低(0.42‰)(体内21号染色体的丢失=2信号点双核细胞率-6信号点双核细胞率)。如表2，在各年龄组，21号染色体的不分离均显著高于丢失，这可能与体内系统对两种细胞系的选择能力不同有关，即对三体细胞的选择压力大于单体的。两种细胞在体内外所占的比例也恰恰证明了这一观点，如三体细胞在体内外平均分别占3.37‰和6.62‰，远高于单体细胞率(表1，2)。但无论体内还是体外的数据均表明，在外周血淋巴细胞中，21号染色体的分离异常以不分离为主。这与淋巴细胞中X染色体的分离异常(不分离和丢失的频率相当)不同，而与目前研究过的常染色体，如1、8和17号染色体的不分离远远高于其丢失的结果一致[7-9]。看来，性染色体和常染色体在细胞分裂后期的分离机理是不同的。
, 百拇医药
根据21号染色体的分离数据，我们可以推算出人类基因组中全部染色体的不分离、丢失和总的分离异常率平均为14.56%(6.62‰×22)、0.53%(0.24‰×22)和15.1%(6.87‰×22)，与Elhajouji等[8]和Kirsch-Volders等[9]根据1和17号染色体在淋巴细胞中的分离数据推算的结果极为接近。但需要指出的是，我们考虑性染色体和常染色体的分离机理不同，因此计算时未把性染色体计算在内，而以上作者未考虑这一问题。不同性别间，21号染色体分离差异不大，女性体细胞微核率较男性略高，而且随年龄增加，女性微核率增长较快，这与Scarpato等[10]的报道是一致的。在体外21号染色体不分离率也是女性略高于男性。年龄对21号染色体分离(不分离，丢失)和微核的影响在女性均较男性强(表1～3)，这可能是不同性别体内细胞微环境的差异造成的。减数分裂中，21号染色体不分离率随女性年龄增长而显著增加，而与男性年龄的关系尚无定论。而我们的结果表明，无论在体内还是体外,不同性别体细胞21号染色体不分离均有显著的年龄效应。分子生物学研究表明，随女性年龄增加,同源染色体间的交换减少可能是21号染色体不分离增加的主要原因[10]。但有关有丝分裂过程中，21号染色体不分离随年龄增长而增加的机理则尚不清楚。但我们的结果至少表明，在体细胞中，不同性别21号染色体的不分离也存在年龄效应。女性较男性的年龄效应强。
, 百拇医药
参考文献
[1] Yoon PW, Freeman SB, Sherman SL, et al. Advanced maternal age and the risk of Down syndrome characterized by the meiotic stage of chromosomal error: a population-based study. Am J Hum Genet, 1996, 58(3)∶628-633.
[2] Penrose LS. The relative effects of paternal and maternal age in mongolism. J Genet，1993，27(2)∶219-244.
[3] Hook EB, Cross PK, Regal RR. Factual, statistical and social issues in search for a paternal age effect for Down syndrome. Hum Genet, 1993, 85(3)∶387-388.
, 百拇医药
[4] Zijno A, Marcon F, Leopardi P, et al. Simultaneous detection of X-chromosome loss and non-disjunction in cytokinesis-blocked human lymphocytes by in situ hybridization with a centromeric DNA probe; implications for the human lymphocyte in vitro micronucleus assay using cytochalsin B. Mutagenesis，1994，9(3)∶225-232.
[5] 史庆华，张坚宣，潘淑娟，等.用万能引物PCR法从YAC中分离制备荧光原位杂交探针的研究.遗传学报，1998，25(5)∶403-408.
[6] Eastmond DA. Advantages and limitations of using fluorescence in situ hybridization of the detection of aneuploidy in interphase human cells. Mutat Res, 1995, 203(2)∶153-162.
, http://www.100md.com
[7] Zijno A. Analysis of chromosome segregation in cytokinesis blocked human lymphocytes: non-disjunction is the prevalent damage resolution from low dose exposure to spindle poisons. Mutagenesis, 1996, 11(4)∶335-340.
[8] Elhajouji A, Tibaldi F, Kirsch-Volders M, et al. Indication for thresholds of chromosome non-disjunction versus chromosome lagging induced by spindle inhibitors in vitro in human lymphocytes. Mutagenesis, 1997, 12(3)∶133-140.
, 百拇医药
[9] Krisch-Volders M, Tallon I, Tanzarella C, et al. Mitotic non-disjunction as a mechanism for in vitro aneuploidy induction by X-rays in primary human cells. Mutagenesis, 1996, 11(4)∶307-313.
[10] Scarpato R, Landini E, Migliore L. Acrocentric chromosome frequency in spontanuous human lymphocyte micronuclei, evaluated by dual-color hybridization, is neither sex- nor age-related. Mutat Res, 1996, 372(2)∶195-205.
[11] Sherman SL, Petersen MB, Freemen SB, et al. Non-disjunction of chromosome 21 in maternal meiosis I: evidence for a maternal-age dependent mechanism, involving reduced recombination. Hum Mol Genet, 1994, 3(9)∶1529-1535.
(收稿：1998-05-04 修回：1998-12-02), 百拇医药