喉癌p16区域的杂合性丢失和微卫星序列不稳定性分析
作者：吴东宁 富伟能 姜莉 张学 李福才 郭星 孙开来
单位：吴东宁 富伟能 姜莉 张学 李福才 孙开来(110001 沈阳，中国医科大学医学遗传学教研室)；郭星(附属第一医院耳鼻喉科)
关键词：喉癌；杂合性丢失；微卫星序列不稳定性
中华医学遗传学杂志990211 【摘要】 目的 缩小喉癌抑癌基因的寻找范围，探讨p16基因在喉癌发生中的作用。方法 选择p16基因附近5个微卫星多态标记对60例喉癌进行杂合性丢失和微卫星序列不稳定性分析。结果 5个标记在喉癌中杂合性丢失频率均不高，最高仅达23.1%，但2个标记的微卫星序列不稳定性的频率较高，其中一个标记微卫星序列不稳定性频率高达46.1%。结论 提示p16基因在喉癌的发生中不以缺失为主，在D9S1752附近可能存在参与喉癌演进的基因。
Loss of heterozygosity and microsatellite instability
, 百拇医药
in laryngeal carcinoma near p16 gene
WU Dongning*, FU Weineng, JIANG Li, ZHANG Xue, LI Fucai, GUO Xing, SUN Kailai
*Department of Medical Genetics, China Medical University, Shenyang,110001 P.R. China E-mail:fuweineng@hotmail.com
【Abstract】 Objectvie To search for the minimal overlap region of tumor suppressor gene in laryngeal carcinoma and discuss the correlation of p16 gene with laryngeal carcinogenesis.Methods Five microsatellite polymorphism markers near p16 gene were selected to detect loss of heterozygosity (LOH) and microsatellite instability (MI) in 60 cases of laryngeal squamous cell carcinoma.Results The frequencies of LOH in 5 markers were less than 23.1%, while the frequencies of MI in 2 markers were higher, with the highest frequency (46.1%) in D9S1752. Conclusion The results suggest that the deletion of p16 gene does not play an important role in the laryngeal carcinogenesis and there may exist a gene around D9S1752 participating in the development of laryngeal carcinoma, which correlates with the mutation of repair gene.
, 百拇医药
【Key words】 Laryngeal carcinoma Loss of heterozygosity Microsatellite instability
喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)是一种常见的上呼吸道恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的1%～8.4%[1]，我国以东北地区高发,其在世界上的发病率呈逐年上升趋势。目前,虽然喉癌患者可以接受手术治疗，但复发率较高，若伴淋巴结转移，5年生存率往往低于50%[2]，而且术后多伴有局部畸形，严重危害健康。与其它恶性肿瘤一样，喉癌的发生也是一个多因素参与的、多阶段的复杂过程。细胞遗传学和分子遗传学已证明染色体部分和节段性缺失与喉癌的发生密切相关，而9号染色体是最常发生缺失的染色体之一[3，4]。
白素娟等[3]对喉癌的杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)检测结果，提示在9p21可能存在与喉癌发生发展密切相关的抑癌基因。而p16基因位于此区域，在许多恶性肿瘤中都发现该基因异常，但其与喉癌发生相关的报道甚少。因此，为了寻找喉癌抑癌基因在此染色体区段的范围，探讨p16基因在喉癌演进中的作用，根据我们以往的研究结果和细胞遗传学资料，选取p16基因附近的5个微卫星多态标记，对60例喉癌组织进行了杂合性丢失和微卫星序列不稳定性(microsatellite instability，MI)的检测和分析。
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1 材料和方法
1.1 喉癌标本 60例喉癌组织标本均经病理确诊为鳞状细胞癌，由中国医科大学附属第一医院耳鼻喉科提供，其中35例喉癌组织与白素娟所用相同。取癌组织及距癌组织1cm以上的癌旁组织0.1cm×0.1cm×0.1cm～0.5cm×0.5cm×0.5cm，立即放于-70℃保存。
1.2 微切割 取喉癌组织制冰冻切片，按切片所示对喉癌标本做微切割，以保证肿瘤细胞比例大于80%[5，6]。
1.3 DNA提取 置微切割后的标本于液氮中10分钟，将标本砸碎匀浆，常规蛋白酶K消化，用饱和NaCl法抽提，紫外分光光度计定量后备用。
1.4 PCR扩增 5对微卫星多态标记(表1)均由中科院上海细胞生物学研究所合成。其在9号染色体上的位置及距离见图1[7]。在10μl PCR反应体系中加入基因组DNA 100ng，1μl 10×PCR缓冲液，dNTP200μmol/L，1对引物各2μmol/L,TaqDNA聚合酶0.25U，α-32P-dCTP 37kBq(1μCi)，加20μl矿物油覆盖反应液，95℃变性2分钟，循环条件为95℃50秒，58～60℃40秒，70℃1分钟，30个循环后72℃延伸5分钟。
, 百拇医药
表1 引物的位置和距离
Tab 1 The position and distance of primers Name
(名称)
Tandem repeat sequence
(串联重复顺序)
Primer sequence
(引物顺序)
Size (bp)
(产物片段长度)*
Heterozygosity
, 百拇医药
(杂合度%)*
D9S1751
CA
5′-TTGTTGATTCTGCCTTCAAAGTCTTTTAAC-3′
150～170
65
5′-CGTTAAGTCCTCTATTACACAGAG-3′
D9S1747
CA
5′-GGCTTTCTCTCTTTTTTGTCTC-3′
120～140
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65
5′-GGAATAAATCAGGCTACCAGG-3′
D9S1748
CA
5′-CACCTCAGAAGTCAGTGAGT-3′
130～150
87
5′-GTGCTTGAAATACACCTTTCCC-3′
D9S1752
CA
5′-AGACTACACAGGATGAGGTG-3′
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150～160
50
5′-GCAAGTCATAAGGGGATTTC-3′
D9S171
CA
5′-AGCTAAGTGAACCTCATCTCTGTCT-3′
160～180
80
5′-ACCCTAGCACTGATGGTATAGTCT-3′
* 数据来自Gene data bank
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图1 5对微卫星多态标记在9p21的位置
Fig 1 Map location of 9p21 markers
1.5 凝胶电泳和LOH、MI判定 PCR产物用甲酰胺变性示踪液稀释2倍，95℃变性10分钟后加样于含7mol/L脲素的6%变性丙烯酰胺凝胶，50℃、80W电泳1～2小时，将凝胶转移至滤纸上，真空干胶，与X光片-70℃放射自显影24小时后观察结果。基因组DNA等位片段表现为杂合子者可作为LOH分析信息，与癌旁组织对比，癌组织DNA PCR扩增产物带消失或相对密度减少50%以上时判为LOH[8]。若肿瘤组织的条带与正常相比出现等位基因条带的增多和大小的改变等记为MI。
2 结果
应用5个微卫星多态标记检测60例喉癌标本染色体9p21的LOH和MI。其中，1例在2个位点和1例在3个位点同时表现LOH，6例在2个位点同时出现MI，4例在1个位点表现LOH，在另一位点表现为MI，各位点的LOH和MI值见表2。图2、3分别示各标记的LOH和MI。
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表2 不同位点的LOH和MI
Tab 2 The value of LOH and MI at different loci Polymor-
phism
(多态位点)
Informative
cases
(信息
个体数)
LOH
(杂合性
丢失)
, 百拇医药
LOH
frequency
(LOH
频率%)
MI
(微卫星序列
不稳定性)
MI
frequency
(MI频率%)
D9S1751
31
7
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22.6
7
25
D9S1747
13
3
2.1
0
0
D9S1748
25
4
16.0
, 百拇医药 0
0
D9S1752
39
5
12.8
18
46.1
D9S171
34
7
20.6
2
5.9
, 百拇医药
图2 各位点的杂合性丢失 箭头示LOH；N：正常组织；T：喉癌组织
图3 各位点的微卫星序列不稳定性 箭头示MI；N：正常组织；T：喉癌组织
Fig 2 LOH in laryngeal carcinoma at different loci Arrows indicate LOH; N:normal tissue; T:tumor tissue Fig 3 MI in laryngeal carcinoma at different loci Arrows indicate MI; N:normal tissue; T:tumor tissue
3 讨论
抑癌基因等位片段的丢失往往伴随该基因附近区域DNA多态标记的丢失，因此通过分析该多态标记的LOH可以探测抑癌基因的存在。微卫星序列不稳定性在脆性综合征，重症肌无力等遗传病中是一种特征性体细胞遗传学变异。自从在遗传性非息肉性结肠癌中发现高频的MI[4]后，许多学者又将注意力放在肿瘤的MI的筛查上[9，10]，经国际互联网查询，两年内有关肿瘤MI的报道文献已逾百篇，但是，涉及喉癌MI的研究尚未见报道。已有证据表明错配修复(mismatch repair, MMR)基因的失活与遗传性肿瘤的MI[11]有关，而散发性肿瘤MI的机理尚不清楚，肿瘤抑癌基因缺失与MMR基因的相关性有待进一步研究。
, 百拇医药
染色体9p缺失是人类肿瘤细胞最常见的缺失之一。白素娟等[3]应用PCR检测59例LSCC中染色体9p21区段2个座位DNA微卫星多态标记的杂合性频率都在70%以上。其中位于染色体9p21的D9S319的LOH频率高达72%。p16基因是染色体9p21区段内一重要抑癌基因，它参与正常细胞周期的调控，在人体许多恶性肿瘤中，如黑色素瘤、胰腺癌、食管癌及肺癌中，都发现该基因存在广泛而高频的失活[12]，表明肿瘤的发生和演进与它的改变有密切关系。目前，p16基因主要的失活机理有纯合性缺失、杂合性缺失、插入、点突变和移码突变等。在白素娟等[3]研究工作的基础上，我们拟在染色体9p21区段D9S319和D9S324两个标记之间选择多个标记集中2～3个染色体区段，以缩小喉癌抑癌基因可能存在的范围，另外，除p16基因外，在其附近可能还存在另一抑癌基因[7]。因此，我们首先选择了染色体9p21的热点区段p16基因附近的5个微卫星多态标记，寻找喉癌的抑癌基因，阐明p16基因与喉癌发生的相关性。
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从我们的研究结果可以看出，5个微卫星多态标记的杂合性丢失最高频率仅达23.1%，尤其是D9S1747与D9S1748距p16只有150kb和15kb，LOH频率只有23.1%和16%，说明p16基因在喉癌的发生中不以缺失为主，可能存在其它的失活机理。
Andre等[13]用包括D9S1749、D9S1747、D9S1748和D9S171在内的9个位于p16位点附近的微卫星多态标记检测头颈部肿瘤(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)，纯合性缺失频率达67%。Sek等[14]用 IFN-α与D9S171之间的标记检测小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，LOH频率达86%，其中距p16 150kb的D9S1747的杂合性丢失频率最高，这与我们的结果相反；而李卫东[8]等检测食管癌D9S171位点的LOH只有17.1%，与我们结果相似。出现上述不同结果的原因可能是Andre在头颈部肿瘤中选择喉癌的例数较少，并不能说明喉癌与头颈部肿癌存在本质差别，因为HNSCC主要指颅内以外的头颈部肿瘤，包括喉癌、口腔癌、甲状腺癌，而喉癌作为其中之一，既有HNSCC的共性，又有自己的特点。同是鳞癌，我们的结论与李卫东的结论一致，而与Andre和Sek的结论不同，可能是由于存在不同的致癌机理，这也符合p16基因失活机理的多样性。
, 百拇医药
我们的实验还显示在D9S1752处，MI频率高达46.1%，而在D9S1747和D9S1748处无MI发生，在其它两个位点的MI频率也不高，呈现明显的位点特异性、李卫东等[8]在研究食管癌时也发现MI是较为常见的改变，且存在位点特异性。我们的研究结果说明在D9S1752附近可能存在与喉癌发生相关的基因。
本课题由国家自然科学基金(39470387)资助
参考文献
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, 百拇医药
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(收稿：1998-04-15 修回：1998-05-25), 百拇医药
单位：吴东宁 富伟能 姜莉 张学 李福才 孙开来(110001 沈阳，中国医科大学医学遗传学教研室)；郭星(附属第一医院耳鼻喉科)
关键词：喉癌；杂合性丢失；微卫星序列不稳定性
中华医学遗传学杂志990211 【摘要】 目的 缩小喉癌抑癌基因的寻找范围，探讨p16基因在喉癌发生中的作用。方法 选择p16基因附近5个微卫星多态标记对60例喉癌进行杂合性丢失和微卫星序列不稳定性分析。结果 5个标记在喉癌中杂合性丢失频率均不高，最高仅达23.1%，但2个标记的微卫星序列不稳定性的频率较高，其中一个标记微卫星序列不稳定性频率高达46.1%。结论 提示p16基因在喉癌的发生中不以缺失为主，在D9S1752附近可能存在参与喉癌演进的基因。
Loss of heterozygosity and microsatellite instability
, 百拇医药
in laryngeal carcinoma near p16 gene
WU Dongning*, FU Weineng, JIANG Li, ZHANG Xue, LI Fucai, GUO Xing, SUN Kailai
*Department of Medical Genetics, China Medical University, Shenyang,110001 P.R. China E-mail:fuweineng@hotmail.com
【Abstract】 Objectvie To search for the minimal overlap region of tumor suppressor gene in laryngeal carcinoma and discuss the correlation of p16 gene with laryngeal carcinogenesis.Methods Five microsatellite polymorphism markers near p16 gene were selected to detect loss of heterozygosity (LOH) and microsatellite instability (MI) in 60 cases of laryngeal squamous cell carcinoma.Results The frequencies of LOH in 5 markers were less than 23.1%, while the frequencies of MI in 2 markers were higher, with the highest frequency (46.1%) in D9S1752. Conclusion The results suggest that the deletion of p16 gene does not play an important role in the laryngeal carcinogenesis and there may exist a gene around D9S1752 participating in the development of laryngeal carcinoma, which correlates with the mutation of repair gene.
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【Key words】 Laryngeal carcinoma Loss of heterozygosity Microsatellite instability
喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)是一种常见的上呼吸道恶性肿瘤，占全身恶性肿瘤的1%～8.4%[1]，我国以东北地区高发,其在世界上的发病率呈逐年上升趋势。目前,虽然喉癌患者可以接受手术治疗，但复发率较高，若伴淋巴结转移，5年生存率往往低于50%[2]，而且术后多伴有局部畸形，严重危害健康。与其它恶性肿瘤一样，喉癌的发生也是一个多因素参与的、多阶段的复杂过程。细胞遗传学和分子遗传学已证明染色体部分和节段性缺失与喉癌的发生密切相关，而9号染色体是最常发生缺失的染色体之一[3，4]。
白素娟等[3]对喉癌的杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)检测结果，提示在9p21可能存在与喉癌发生发展密切相关的抑癌基因。而p16基因位于此区域，在许多恶性肿瘤中都发现该基因异常，但其与喉癌发生相关的报道甚少。因此，为了寻找喉癌抑癌基因在此染色体区段的范围，探讨p16基因在喉癌演进中的作用，根据我们以往的研究结果和细胞遗传学资料，选取p16基因附近的5个微卫星多态标记，对60例喉癌组织进行了杂合性丢失和微卫星序列不稳定性(microsatellite instability，MI)的检测和分析。
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1 材料和方法
1.1 喉癌标本 60例喉癌组织标本均经病理确诊为鳞状细胞癌，由中国医科大学附属第一医院耳鼻喉科提供，其中35例喉癌组织与白素娟所用相同。取癌组织及距癌组织1cm以上的癌旁组织0.1cm×0.1cm×0.1cm～0.5cm×0.5cm×0.5cm，立即放于-70℃保存。
1.2 微切割 取喉癌组织制冰冻切片，按切片所示对喉癌标本做微切割，以保证肿瘤细胞比例大于80%[5，6]。
1.3 DNA提取 置微切割后的标本于液氮中10分钟，将标本砸碎匀浆，常规蛋白酶K消化，用饱和NaCl法抽提，紫外分光光度计定量后备用。
1.4 PCR扩增 5对微卫星多态标记(表1)均由中科院上海细胞生物学研究所合成。其在9号染色体上的位置及距离见图1[7]。在10μl PCR反应体系中加入基因组DNA 100ng，1μl 10×PCR缓冲液，dNTP200μmol/L，1对引物各2μmol/L,TaqDNA聚合酶0.25U，α-32P-dCTP 37kBq(1μCi)，加20μl矿物油覆盖反应液，95℃变性2分钟，循环条件为95℃50秒，58～60℃40秒，70℃1分钟，30个循环后72℃延伸5分钟。
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表1 引物的位置和距离
Tab 1 The position and distance of primers Name
(名称)
Tandem repeat sequence
(串联重复顺序)
Primer sequence
(引物顺序)
Size (bp)
(产物片段长度)*
Heterozygosity
, 百拇医药
(杂合度%)*
D9S1751
CA
5′-TTGTTGATTCTGCCTTCAAAGTCTTTTAAC-3′
150～170
65
5′-CGTTAAGTCCTCTATTACACAGAG-3′
D9S1747
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5′-GGCTTTCTCTCTTTTTTGTCTC-3′
120～140
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65
5′-GGAATAAATCAGGCTACCAGG-3′
D9S1748
CA
5′-CACCTCAGAAGTCAGTGAGT-3′
130～150
87
5′-GTGCTTGAAATACACCTTTCCC-3′
D9S1752
CA
5′-AGACTACACAGGATGAGGTG-3′
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150～160
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5′-GCAAGTCATAAGGGGATTTC-3′
D9S171
CA
5′-AGCTAAGTGAACCTCATCTCTGTCT-3′
160～180
80
5′-ACCCTAGCACTGATGGTATAGTCT-3′
* 数据来自Gene data bank
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图1 5对微卫星多态标记在9p21的位置
Fig 1 Map location of 9p21 markers
1.5 凝胶电泳和LOH、MI判定 PCR产物用甲酰胺变性示踪液稀释2倍，95℃变性10分钟后加样于含7mol/L脲素的6%变性丙烯酰胺凝胶，50℃、80W电泳1～2小时，将凝胶转移至滤纸上，真空干胶，与X光片-70℃放射自显影24小时后观察结果。基因组DNA等位片段表现为杂合子者可作为LOH分析信息，与癌旁组织对比，癌组织DNA PCR扩增产物带消失或相对密度减少50%以上时判为LOH[8]。若肿瘤组织的条带与正常相比出现等位基因条带的增多和大小的改变等记为MI。
2 结果
应用5个微卫星多态标记检测60例喉癌标本染色体9p21的LOH和MI。其中，1例在2个位点和1例在3个位点同时表现LOH，6例在2个位点同时出现MI，4例在1个位点表现LOH，在另一位点表现为MI，各位点的LOH和MI值见表2。图2、3分别示各标记的LOH和MI。
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表2 不同位点的LOH和MI
Tab 2 The value of LOH and MI at different loci Polymor-
phism
(多态位点)
Informative
cases
(信息
个体数)
LOH
(杂合性
丢失)
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LOH
frequency
(LOH
频率%)
MI
(微卫星序列
不稳定性)
MI
frequency
(MI频率%)
D9S1751
31
7
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22.6
7
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13
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25
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39
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12.8
18
46.1
D9S171
34
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20.6
2
5.9
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图2 各位点的杂合性丢失 箭头示LOH；N：正常组织；T：喉癌组织
图3 各位点的微卫星序列不稳定性 箭头示MI；N：正常组织；T：喉癌组织
Fig 2 LOH in laryngeal carcinoma at different loci Arrows indicate LOH; N:normal tissue; T:tumor tissue Fig 3 MI in laryngeal carcinoma at different loci Arrows indicate MI; N:normal tissue; T:tumor tissue
3 讨论
抑癌基因等位片段的丢失往往伴随该基因附近区域DNA多态标记的丢失，因此通过分析该多态标记的LOH可以探测抑癌基因的存在。微卫星序列不稳定性在脆性综合征，重症肌无力等遗传病中是一种特征性体细胞遗传学变异。自从在遗传性非息肉性结肠癌中发现高频的MI[4]后，许多学者又将注意力放在肿瘤的MI的筛查上[9，10]，经国际互联网查询，两年内有关肿瘤MI的报道文献已逾百篇，但是，涉及喉癌MI的研究尚未见报道。已有证据表明错配修复(mismatch repair, MMR)基因的失活与遗传性肿瘤的MI[11]有关，而散发性肿瘤MI的机理尚不清楚，肿瘤抑癌基因缺失与MMR基因的相关性有待进一步研究。
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染色体9p缺失是人类肿瘤细胞最常见的缺失之一。白素娟等[3]应用PCR检测59例LSCC中染色体9p21区段2个座位DNA微卫星多态标记的杂合性频率都在70%以上。其中位于染色体9p21的D9S319的LOH频率高达72%。p16基因是染色体9p21区段内一重要抑癌基因，它参与正常细胞周期的调控，在人体许多恶性肿瘤中，如黑色素瘤、胰腺癌、食管癌及肺癌中，都发现该基因存在广泛而高频的失活[12]，表明肿瘤的发生和演进与它的改变有密切关系。目前，p16基因主要的失活机理有纯合性缺失、杂合性缺失、插入、点突变和移码突变等。在白素娟等[3]研究工作的基础上，我们拟在染色体9p21区段D9S319和D9S324两个标记之间选择多个标记集中2～3个染色体区段，以缩小喉癌抑癌基因可能存在的范围，另外，除p16基因外，在其附近可能还存在另一抑癌基因[7]。因此，我们首先选择了染色体9p21的热点区段p16基因附近的5个微卫星多态标记，寻找喉癌的抑癌基因，阐明p16基因与喉癌发生的相关性。
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从我们的研究结果可以看出，5个微卫星多态标记的杂合性丢失最高频率仅达23.1%，尤其是D9S1747与D9S1748距p16只有150kb和15kb，LOH频率只有23.1%和16%，说明p16基因在喉癌的发生中不以缺失为主，可能存在其它的失活机理。
Andre等[13]用包括D9S1749、D9S1747、D9S1748和D9S171在内的9个位于p16位点附近的微卫星多态标记检测头颈部肿瘤(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)，纯合性缺失频率达67%。Sek等[14]用 IFN-α与D9S171之间的标记检测小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，LOH频率达86%，其中距p16 150kb的D9S1747的杂合性丢失频率最高，这与我们的结果相反；而李卫东[8]等检测食管癌D9S171位点的LOH只有17.1%，与我们结果相似。出现上述不同结果的原因可能是Andre在头颈部肿瘤中选择喉癌的例数较少，并不能说明喉癌与头颈部肿癌存在本质差别，因为HNSCC主要指颅内以外的头颈部肿瘤，包括喉癌、口腔癌、甲状腺癌，而喉癌作为其中之一，既有HNSCC的共性，又有自己的特点。同是鳞癌，我们的结论与李卫东的结论一致，而与Andre和Sek的结论不同，可能是由于存在不同的致癌机理，这也符合p16基因失活机理的多样性。
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我们的实验还显示在D9S1752处，MI频率高达46.1%，而在D9S1747和D9S1748处无MI发生，在其它两个位点的MI频率也不高，呈现明显的位点特异性、李卫东等[8]在研究食管癌时也发现MI是较为常见的改变，且存在位点特异性。我们的研究结果说明在D9S1752附近可能存在与喉癌发生相关的基因。
本课题由国家自然科学基金(39470387)资助
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(收稿：1998-04-15 修回：1998-05-25), 百拇医药