小鼠遗传型多囊肾病1基因组片段的克隆
作者：郁胜强 梅长林 胡以平
单位：郁胜强 梅长林 200003 上海长征医院肾内科；胡以平 上海第二军医大学细胞生物学教研室
关键词：小鼠多囊肾病1基因；克隆；文库筛选
小鼠遗传型多囊肾病1基因组片段的克隆 【摘要】 目的 克隆小鼠的遗传型多囊肾病1基因(polycystic kidney disease 1,PKD1)，为产生PKD1基因缺陷小鼠品系准备条件。方法 以正常小鼠基因组DNA为模板、扩增小鼠PKD1基因部分序列为探针，应用噬斑原位杂交技术筛选129SvTer小鼠基因组DNA文库，并用Southern杂交、亚克隆及测序等方法鉴定所得克隆。结果 筛选得到1个阳性克隆，并证实了所得序列与基因库收录的序列一致。结论 已克隆到含有PKD1基因目的区域的基因组DNA片段，其结构符合构建目标载体的要求，为建立小鼠PKD1胚胎干细胞基因打靶动物模型奠定了基础。
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Cloning of mouse polycystic kidney disease 1 gene
YU Shengqiang, MEI Changlin, HU Yiping.*Department of Nephrology, Changzheng Hospital, Shanghai, 200003 P.R.China.E-mail:chlmei @ public 1.sta.net.cn
【Abstract】 Objective To obtain mouse polycystic kidney disease 1(PKD1) gene by plagues in situ hybridization from a genomic library.Methods With the use of partial mouse PKD1 genomic DNA fragments amplified by PCR as probes, a genomic library of 129SvTer muose in bacteriophage vector was screened by plagues in situ hybridization. The inserts of genomic DNA fragments were analyzed by Southern blot, subclone and verified by sequencing.Results A positive phage clone was obtained after four-round screening. The sequence of the genomic DNA fragments inserted in the positive clone was in accordance with that of the Genebank.Conclusion The authors found that the length and structure of mouse PKD1 genomic DNA fragments obtained from a genomic library were available to construct a replacement targeting vector.
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【Key words】 Mouse polycystic kidney disease 1 gene Cloning Library screening
常染色体显性遗传型多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是一种常见的单基因遗传性疾病，其发病率为1/400～1/1 000，50%的患者最终发展至肾功能衰竭(肾衰)，占肾衰患者的8%[1]。至今确定发生ADPKD的基因有3个，其中遗传型多囊肾病1基因(polycystic kidney disease 1,PKD1)基因位于16p13.3，大约85%的ADPKD患者由此基因突变引起[2，3]。人的整个PKD1基因组序列及大约14kb的转录子于1995年确定，其外显子共有46个，结构已明确[4，5]。小鼠PKD1基因位于17号染色体，为单拷贝，全长cDNA序列于1997年确定，但基因组序列及结构目前尚不清楚，推测与人相似[6，7]。我们利用已知的小鼠PKD1基因cDNA序列，参考人PKD1基因结构，自行设计引物，制备探针，筛选、克隆出含有小鼠PKD1基因目的区域的基因组片段，现将结果报告如下。
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1 材料和方法
1.1 试剂及主要仪器 所用酶类：如EcoRⅠ，HindⅢ，Bam HⅠ，T4DNA连接酶等分别购自Promega、Gibco、Biolab等公司。胶回收试剂盒、探针标记试剂盒购自Clontech公司。质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物制品公司。尼龙膜购自Amershan公司。α-32P-dCTP从北京亚辉生物技术公司订购。PCR仪购自Perkin-Elmer公司；杂交仪购自Techne公司；测序设备为ABI PRISM373A型DNA自动测序仪。
1.2 PCR引物 引物用PCGENE软件包根据小鼠PKD1基因cDNA序列资料，参考人PKD1基因结构自行设计，正向引物位于小鼠PKD1基因cDNA序列的5795～5815bp，反向引物位于6333～6353bp，扩增片段产物长度为559bp，由上海生工生物工程有限公司协助合成。PCR-5′：5′-TCTCCCACAGCTTCTT-TCGGG-3′；PCR-3′：5′-ACATGGTAGTCCCCAGG-ACGC-3′。
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1.3 基因组文库、菌株及质粒 129SvTer小鼠基因组DNA文库由第二军医大学细胞生物学教研室胡以平构建[8]。TG1，DH5α，pBluescript质粒由第二军医大学细胞生物学教研室保存；pGEM-T载体购自Promega。
1.4 文库筛选探针DNA的制备 抽提正常小鼠基因组DNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增[9]，对PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，回收DNA片段，与pGEM-T载体以3∶1(mol)混合，4℃过夜，挑选白色菌落作酶切鉴定。以Eco RⅠ酶切片段为探针。
1.5 噬菌体原种的滴度测定 用系列稀释法对噬菌体文库的原始原种进行滴度测定。
1.6 原位杂交筛选文库[9] 初始噬菌体原种按每块150mm平板，铺3.0×104个噬斑数铺12块平板(约3.6×105个噬斑)，用pGEM-PKD1质粒的EcoRⅠ酶切片段为探针进行杂交筛选129SvTer小鼠基因组DNA文库，获得阳性噬斑后，挑取噬斑制成原种，进行第2轮筛选。自第2轮起，每块平板所铺的噬菌体数大约为数十个或数百个，阳性噬斑经过4轮筛选，证实一块板中的每个噬斑均为阳性后，用来自单斑的原种制备裂解原种，用以保存阳性克隆和制备噬菌体DNA。
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1.7 阳性克隆噬菌体DNA的制备 用阳性噬菌体克隆的裂解原种铺平板，得到彻底裂解的平板，用PEG沉淀法制备噬菌体DNA。
1.8 Southern杂交[9] 予噬菌体DNA适当酶切、琼脂糖凝胶电泳分离后，用毛细管转移法将琼脂糖凝胶中的DNA转移至尼龙膜，以放射性同位素标记的pGEM-PKD1质粒Eco RⅠ酶切片段为探针，进行杂交。
1.9 亚克隆和测序 获得阳性噬菌体DNA后，予适当酶切，回收相应片段后，与相同酶切的pBluescript质粒DNA以3∶1(mol)比混合，加入T4DNA连接酶1U，18℃温浴8小时，常规转化大肠杆菌DH5α感受态细菌。对重组白色菌落用限制性内切酶酶切鉴定，获得正确克隆后用 ABI PRISM373A型DNA自动测序仪作序列分析。
2 结果
2.1 小鼠基因组DNA文库的筛选
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2.1.1 文库筛选探针DNA的制备 以正常小鼠基因组DNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增，获得长度大约为559bp的DNA片段，与设计长度符合。回收DNA片段，构建pGEM-PKD1质粒，重组质粒经PCR扩增、限制性内切酶酶切图谱鉴定出插入正确的克隆后，对插入片段进行DNA测序分析，所得核苷酸序列与GENEBANK收录的序列一致。以重组质粒的Eco RⅠ酶切片段为探针。正常小鼠基因组DNA及pGEM-PKD1质粒PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1。
图1 正常小鼠基因组DNA及pGEM-PKD1质粒PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图 1：pGEM-PKD1质粒的PCR产物；2：正常小鼠基因组DNA的PCR产物；3：λ/Hind Ⅲ
Fig 1 Agarose gel electrophoresis pattern of the PCR products of normal mouse genomic DNA and pGEM-PKD1 Lane 1:PCR products of pGEM-PKD1;lane 2:PCR products of normal mouse genomic DNA;lane 3:λ/Hind Ⅲ
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2.1.2 噬菌体原种的滴度测定 用系列稀释法对噬菌体文库的原始原种进行滴度测定。结果为1.92×109pfu/ml。原始原种滴度达到文库构建所要求的滴度，满足基因筛选对文库的要求。
2.1.3 原位杂交文库筛选结果 以pGEM-PKD1质粒的Eco RⅠ酶切片段为探针对129SvTer小鼠基因组DNA文库进行杂交筛选，得到1个阳性克隆(C9)。挑取阳性噬斑制成原种，进行其余3轮筛选，第4轮每一块板中的所有噬斑均为阳性。图2显示各轮的杂交结果。
图2 4轮噬斑原位杂交筛选基因组文库结果 A：第1轮筛选结果；B：第2轮筛选结果；C：第3轮筛选结果；D：第4轮筛选结果
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Fig 2 The results of four-round screening by plagues in situ hybridization from a genomic DNA library A：the first round screening;B:the second round screening;C:the third round screening;D:the forth round screening
2.1.4 阳性克隆噬菌体DNA的制备 用阳性噬菌体克隆的裂解原种铺平板，得到彻底裂解的平板，用PEG沉淀法制备噬菌体DNA，其质和量都能满足后续操作的要求。
2.2 小鼠PKD1基因组DNA的鉴定 获得阳性噬菌体DNA后，予Southern blot、亚克隆及部分序列测序等分析，证实所得阳性克隆插入片段为含有小鼠PKD1基因目的区域的基因组DNA片段。
2.2.1 Southern杂交结果 对获得的噬菌体DNA，用Eco RⅠ、Eco RⅠ+Bam HⅠ、Eco RⅠ+Eco RⅤ及Eco RⅠ+Hind Ⅲ进行酶切，并以pGEM-PKD1质粒的Eco RⅠ酶切片段为探针进行Southern杂交，杂交阳性片段与预期的片段长度一致，证实所得阳性克隆插入片段为含有小鼠PKD1基因目的区域的基因组DNA片段。结果见图3。
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图3 噬菌体DNA的Southern杂交结果 1：Eco RⅠ+Hind Ⅲ；2：Eco RⅠ+Eco RⅤ；3：Eco RⅠ+Bam HⅠ；4：Eco RⅠ
Fig 3 The results of bacteriophage DNA Southern blot Lane 1:Eco RⅠ+Hind Ⅲ;lane 2:Eco RⅠ+Eco RⅤ;lane 3:Eco RⅠ+Bam HⅠ;lane 4:Eco RⅠ
2.2.2 Eco RⅠ、Hind Ⅲ双酶切亚克隆的制备 阳性克隆噬菌体DNA经过Eco RⅠ单酶切、Eco RⅠ和Hind Ⅲ双酶切及琼脂糖凝胶电泳，结果出现7条带，其中20kb左右和9kb左右条带分别是噬菌体载体的长臂和短臂。插入片段得到5个DNA片段，经分析，长度大约在3.5kb、1.8kb左右的为Eco RⅠ单酶切片段，在1.4kb左右的为Hind Ⅲ单酶切片段，在2.3kb、5.0kb左右的为Eco RⅠ和Hind Ⅲ双酶切片段，结果见图4。由此得到5个亚克隆质粒。
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图4 噬菌体DNA的酶切结果 1：λ/Hind Ⅲ；2：Eco RⅠ；3：Eco RⅠ+Bam HⅠ；4：Eco RⅠ+Eco R Ⅴ;5:Eco RⅠ+Hind Ⅲ
Fig 4 The digestion results of bacteriophage DNA Lane 1：λ/Hind Ⅲ；lane 2：Eco RⅠ；lane 3：Eco RⅠ+Bam HⅠ；lane 4：Eco RⅠ+Eco R Ⅴ;lane 5:Eco RⅠ+Hind Ⅲ
2.2.3 亚克隆质粒的部分序列分析 为了证实所得噬菌体克隆中插入片段含有小鼠PKD1基因的目的区域，以所有亚克隆质粒DNA为模板，通用引物T7、T3为引物，进行测序。所得结果1.4kb片段的序列位于小鼠PKD1基因的9～11外显子，5.0kb片段的一侧序列位于15外显子，1.8kb片段的一侧序列位于15～16外显子，所得序列与基因库收录的小鼠PKD1基因cDNA序列一致。其余所得到的序列和小鼠PKD1基因的cDNA序列不同，可能位于小鼠PKD1基因的内含子中。因此，克隆到的含有小鼠PKD1基因目的区域基因组DNA片段至少包含有9～16外显子。
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3 讨论
常染色体显性遗传型多囊肾病是一种常见的单基因遗传病。其发病率高，发病机理还不很清楚、也没有很好的治疗方法。要探索其发病机理、了解疾病干预因素，必须具有良好的动物模型。目前，动物模型的获得主要是化学物质诱导、自身突变筛选和受精卵的癌基因微注射等，由于存在各种缺点，尚不能满足需要[10]。通过筛选小鼠基因组DNA文库，得到目的区域DNA片段，进行胚胎干细胞基因打靶，获得转基因动物模型，可人为地改造修饰动物基因结构组成，以得到相应的表型，从而模拟人类遗传病，是最为理想的遗传病动物模型。
目前，人PKD1基因组序列及结构已明确，小鼠PKD1基因cDNA序列也已确定，但其基因组序列及结构尚不清楚，推测与人相似。通过PCGENE软件包对人鼠PKD1基因cDNA序列作同源性比较，具有84%的同源性。参考已知人PKD1基因结构，推算出小鼠PKD1基因第15外显子DNA片段较长，约3.5kb，并确定了在cDNA中的相应位置，由此设计引物。通过PCR扩增，所得产物长度与设计相符合，进一步验证了人、鼠PKD1基因结构的相似性。筛选得到的阳性噬菌体克隆，其插入片段的一部分，根据限制性内切酶酶切图谱及亚克隆质粒的测序结果，参考人PKD1基因的外显子和内含子位置，确定克隆到的含有小鼠PKD1基因目的区域基因组DNA片段至少包含有9～16外显子，长度约为10kb，其结构及长度符合构建目标载体的要求。其余插入片段基因结构尚未分析，有待进一步研究。综上所述，已克隆到的基因组DNA片段，为产生PKD1基因缺陷小鼠品系准备了有利条件。
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本课题受国家863计划(102-10-04-03)部分资助
参考文献
1 Gabow PA. Autosomal dominant polycystic kidney disease.N Engl J Med, 1993, 329∶332-342.
2 Reeders ST, Breuning MH, Davis KE, et al. A highly polymorphic DNA marker linked to adult polycystic kidney disease on chromosome 16. Nature, 1985, 317∶542-544.
3 Peters DJM, Sandkuijl LA. Genetic heterogeneity of polycystic kidney disease in Europe. Contrib Nephrol, 1992, 97∶128-139.
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4 European Polycystic Kidney Disease Consortium.The polycystic kidney disease 1 gene encodes a 14 kb transcript and lies within a duplicated region on chromosome 16. Cell, 1994, 77∶881-894.
5 Hughes J, Ward CJ, Peral B, et al. The polycystic kidney disease 1 (PKD1) gene encodes a novel protein with multiple cell recognition domains. Nature Genet, 1995, 10∶151-159.
6 Olssson PG, Lohning C, Horsley S,et al. The mouse homologue of the polycysitc kidney disease gene 1(PKD1) is a single-copy gene. Genomics, 1996, 34∶233-235.
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7 Lohning C, Nowicka U, Frischauf AM. The mouse homolog of PKD1:sequence analysis and alternative splicing. Mamm Genome, 1997, 8(5)∶307-311.
8 Yiping Hu, Martin D, Joseph TYL. Murine hepatic β-galactoside α2,6-sialyltransferase gene expression involves usage of a novel upstream exon region. Glycoconjugate J,1997,14∶407-411.
9 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. 2nd ed. 1989.14.14-14.19,2.108-2.114,9.31-9.52.
10 郁胜强，梅长林.多囊肾病动物模型的研究进展.国外医学泌尿系统分册，1998，18(增刊)∶75-77.
(收稿：1998-12-28 修回：1999-08-25), http://www.100md.com
单位：郁胜强 梅长林 200003 上海长征医院肾内科；胡以平 上海第二军医大学细胞生物学教研室
关键词：小鼠多囊肾病1基因；克隆；文库筛选
小鼠遗传型多囊肾病1基因组片段的克隆 【摘要】 目的 克隆小鼠的遗传型多囊肾病1基因(polycystic kidney disease 1,PKD1)，为产生PKD1基因缺陷小鼠品系准备条件。方法 以正常小鼠基因组DNA为模板、扩增小鼠PKD1基因部分序列为探针，应用噬斑原位杂交技术筛选129SvTer小鼠基因组DNA文库，并用Southern杂交、亚克隆及测序等方法鉴定所得克隆。结果 筛选得到1个阳性克隆，并证实了所得序列与基因库收录的序列一致。结论 已克隆到含有PKD1基因目的区域的基因组DNA片段，其结构符合构建目标载体的要求，为建立小鼠PKD1胚胎干细胞基因打靶动物模型奠定了基础。
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【Abstract】 Objective To obtain mouse polycystic kidney disease 1(PKD1) gene by plagues in situ hybridization from a genomic library.Methods With the use of partial mouse PKD1 genomic DNA fragments amplified by PCR as probes, a genomic library of 129SvTer muose in bacteriophage vector was screened by plagues in situ hybridization. The inserts of genomic DNA fragments were analyzed by Southern blot, subclone and verified by sequencing.Results A positive phage clone was obtained after four-round screening. The sequence of the genomic DNA fragments inserted in the positive clone was in accordance with that of the Genebank.Conclusion The authors found that the length and structure of mouse PKD1 genomic DNA fragments obtained from a genomic library were available to construct a replacement targeting vector.
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【Key words】 Mouse polycystic kidney disease 1 gene Cloning Library screening
常染色体显性遗传型多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)是一种常见的单基因遗传性疾病，其发病率为1/400～1/1 000，50%的患者最终发展至肾功能衰竭(肾衰)，占肾衰患者的8%[1]。至今确定发生ADPKD的基因有3个，其中遗传型多囊肾病1基因(polycystic kidney disease 1,PKD1)基因位于16p13.3，大约85%的ADPKD患者由此基因突变引起[2，3]。人的整个PKD1基因组序列及大约14kb的转录子于1995年确定，其外显子共有46个，结构已明确[4，5]。小鼠PKD1基因位于17号染色体，为单拷贝，全长cDNA序列于1997年确定，但基因组序列及结构目前尚不清楚，推测与人相似[6，7]。我们利用已知的小鼠PKD1基因cDNA序列，参考人PKD1基因结构，自行设计引物，制备探针，筛选、克隆出含有小鼠PKD1基因目的区域的基因组片段，现将结果报告如下。
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1 材料和方法
1.1 试剂及主要仪器 所用酶类：如EcoRⅠ，HindⅢ，Bam HⅠ，T4DNA连接酶等分别购自Promega、Gibco、Biolab等公司。胶回收试剂盒、探针标记试剂盒购自Clontech公司。质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物制品公司。尼龙膜购自Amershan公司。α-32P-dCTP从北京亚辉生物技术公司订购。PCR仪购自Perkin-Elmer公司；杂交仪购自Techne公司；测序设备为ABI PRISM373A型DNA自动测序仪。
1.2 PCR引物 引物用PCGENE软件包根据小鼠PKD1基因cDNA序列资料，参考人PKD1基因结构自行设计，正向引物位于小鼠PKD1基因cDNA序列的5795～5815bp，反向引物位于6333～6353bp，扩增片段产物长度为559bp，由上海生工生物工程有限公司协助合成。PCR-5′：5′-TCTCCCACAGCTTCTT-TCGGG-3′；PCR-3′：5′-ACATGGTAGTCCCCAGG-ACGC-3′。
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1.3 基因组文库、菌株及质粒 129SvTer小鼠基因组DNA文库由第二军医大学细胞生物学教研室胡以平构建[8]。TG1，DH5α，pBluescript质粒由第二军医大学细胞生物学教研室保存；pGEM-T载体购自Promega。
1.4 文库筛选探针DNA的制备 抽提正常小鼠基因组DNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增[9]，对PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，回收DNA片段，与pGEM-T载体以3∶1(mol)混合，4℃过夜，挑选白色菌落作酶切鉴定。以Eco RⅠ酶切片段为探针。
1.5 噬菌体原种的滴度测定 用系列稀释法对噬菌体文库的原始原种进行滴度测定。
1.6 原位杂交筛选文库[9] 初始噬菌体原种按每块150mm平板，铺3.0×104个噬斑数铺12块平板(约3.6×105个噬斑)，用pGEM-PKD1质粒的EcoRⅠ酶切片段为探针进行杂交筛选129SvTer小鼠基因组DNA文库，获得阳性噬斑后，挑取噬斑制成原种，进行第2轮筛选。自第2轮起，每块平板所铺的噬菌体数大约为数十个或数百个，阳性噬斑经过4轮筛选，证实一块板中的每个噬斑均为阳性后，用来自单斑的原种制备裂解原种，用以保存阳性克隆和制备噬菌体DNA。
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1.7 阳性克隆噬菌体DNA的制备 用阳性噬菌体克隆的裂解原种铺平板，得到彻底裂解的平板，用PEG沉淀法制备噬菌体DNA。
1.8 Southern杂交[9] 予噬菌体DNA适当酶切、琼脂糖凝胶电泳分离后，用毛细管转移法将琼脂糖凝胶中的DNA转移至尼龙膜，以放射性同位素标记的pGEM-PKD1质粒Eco RⅠ酶切片段为探针，进行杂交。
1.9 亚克隆和测序 获得阳性噬菌体DNA后，予适当酶切，回收相应片段后，与相同酶切的pBluescript质粒DNA以3∶1(mol)比混合，加入T4DNA连接酶1U，18℃温浴8小时，常规转化大肠杆菌DH5α感受态细菌。对重组白色菌落用限制性内切酶酶切鉴定，获得正确克隆后用 ABI PRISM373A型DNA自动测序仪作序列分析。
2 结果
2.1 小鼠基因组DNA文库的筛选
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2.1.1 文库筛选探针DNA的制备 以正常小鼠基因组DNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增，获得长度大约为559bp的DNA片段，与设计长度符合。回收DNA片段，构建pGEM-PKD1质粒，重组质粒经PCR扩增、限制性内切酶酶切图谱鉴定出插入正确的克隆后，对插入片段进行DNA测序分析，所得核苷酸序列与GENEBANK收录的序列一致。以重组质粒的Eco RⅠ酶切片段为探针。正常小鼠基因组DNA及pGEM-PKD1质粒PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图1。
图1 正常小鼠基因组DNA及pGEM-PKD1质粒PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图 1：pGEM-PKD1质粒的PCR产物；2：正常小鼠基因组DNA的PCR产物；3：λ/Hind Ⅲ
Fig 1 Agarose gel electrophoresis pattern of the PCR products of normal mouse genomic DNA and pGEM-PKD1 Lane 1:PCR products of pGEM-PKD1;lane 2:PCR products of normal mouse genomic DNA;lane 3:λ/Hind Ⅲ
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2.1.2 噬菌体原种的滴度测定 用系列稀释法对噬菌体文库的原始原种进行滴度测定。结果为1.92×109pfu/ml。原始原种滴度达到文库构建所要求的滴度，满足基因筛选对文库的要求。
2.1.3 原位杂交文库筛选结果 以pGEM-PKD1质粒的Eco RⅠ酶切片段为探针对129SvTer小鼠基因组DNA文库进行杂交筛选，得到1个阳性克隆(C9)。挑取阳性噬斑制成原种，进行其余3轮筛选，第4轮每一块板中的所有噬斑均为阳性。图2显示各轮的杂交结果。
图2 4轮噬斑原位杂交筛选基因组文库结果 A：第1轮筛选结果；B：第2轮筛选结果；C：第3轮筛选结果；D：第4轮筛选结果
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Fig 2 The results of four-round screening by plagues in situ hybridization from a genomic DNA library A：the first round screening;B:the second round screening;C:the third round screening;D:the forth round screening
2.1.4 阳性克隆噬菌体DNA的制备 用阳性噬菌体克隆的裂解原种铺平板，得到彻底裂解的平板，用PEG沉淀法制备噬菌体DNA，其质和量都能满足后续操作的要求。
2.2 小鼠PKD1基因组DNA的鉴定 获得阳性噬菌体DNA后，予Southern blot、亚克隆及部分序列测序等分析，证实所得阳性克隆插入片段为含有小鼠PKD1基因目的区域的基因组DNA片段。
2.2.1 Southern杂交结果 对获得的噬菌体DNA，用Eco RⅠ、Eco RⅠ+Bam HⅠ、Eco RⅠ+Eco RⅤ及Eco RⅠ+Hind Ⅲ进行酶切，并以pGEM-PKD1质粒的Eco RⅠ酶切片段为探针进行Southern杂交，杂交阳性片段与预期的片段长度一致，证实所得阳性克隆插入片段为含有小鼠PKD1基因目的区域的基因组DNA片段。结果见图3。
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图3 噬菌体DNA的Southern杂交结果 1：Eco RⅠ+Hind Ⅲ；2：Eco RⅠ+Eco RⅤ；3：Eco RⅠ+Bam HⅠ；4：Eco RⅠ
Fig 3 The results of bacteriophage DNA Southern blot Lane 1:Eco RⅠ+Hind Ⅲ;lane 2:Eco RⅠ+Eco RⅤ;lane 3:Eco RⅠ+Bam HⅠ;lane 4:Eco RⅠ
2.2.2 Eco RⅠ、Hind Ⅲ双酶切亚克隆的制备 阳性克隆噬菌体DNA经过Eco RⅠ单酶切、Eco RⅠ和Hind Ⅲ双酶切及琼脂糖凝胶电泳，结果出现7条带，其中20kb左右和9kb左右条带分别是噬菌体载体的长臂和短臂。插入片段得到5个DNA片段，经分析，长度大约在3.5kb、1.8kb左右的为Eco RⅠ单酶切片段，在1.4kb左右的为Hind Ⅲ单酶切片段，在2.3kb、5.0kb左右的为Eco RⅠ和Hind Ⅲ双酶切片段，结果见图4。由此得到5个亚克隆质粒。
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图4 噬菌体DNA的酶切结果 1：λ/Hind Ⅲ；2：Eco RⅠ；3：Eco RⅠ+Bam HⅠ；4：Eco RⅠ+Eco R Ⅴ;5:Eco RⅠ+Hind Ⅲ
Fig 4 The digestion results of bacteriophage DNA Lane 1：λ/Hind Ⅲ；lane 2：Eco RⅠ；lane 3：Eco RⅠ+Bam HⅠ；lane 4：Eco RⅠ+Eco R Ⅴ;lane 5:Eco RⅠ+Hind Ⅲ
2.2.3 亚克隆质粒的部分序列分析 为了证实所得噬菌体克隆中插入片段含有小鼠PKD1基因的目的区域，以所有亚克隆质粒DNA为模板，通用引物T7、T3为引物，进行测序。所得结果1.4kb片段的序列位于小鼠PKD1基因的9～11外显子，5.0kb片段的一侧序列位于15外显子，1.8kb片段的一侧序列位于15～16外显子，所得序列与基因库收录的小鼠PKD1基因cDNA序列一致。其余所得到的序列和小鼠PKD1基因的cDNA序列不同，可能位于小鼠PKD1基因的内含子中。因此，克隆到的含有小鼠PKD1基因目的区域基因组DNA片段至少包含有9～16外显子。
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3 讨论
常染色体显性遗传型多囊肾病是一种常见的单基因遗传病。其发病率高，发病机理还不很清楚、也没有很好的治疗方法。要探索其发病机理、了解疾病干预因素，必须具有良好的动物模型。目前，动物模型的获得主要是化学物质诱导、自身突变筛选和受精卵的癌基因微注射等，由于存在各种缺点，尚不能满足需要[10]。通过筛选小鼠基因组DNA文库，得到目的区域DNA片段，进行胚胎干细胞基因打靶，获得转基因动物模型，可人为地改造修饰动物基因结构组成，以得到相应的表型，从而模拟人类遗传病，是最为理想的遗传病动物模型。
目前，人PKD1基因组序列及结构已明确，小鼠PKD1基因cDNA序列也已确定，但其基因组序列及结构尚不清楚，推测与人相似。通过PCGENE软件包对人鼠PKD1基因cDNA序列作同源性比较，具有84%的同源性。参考已知人PKD1基因结构，推算出小鼠PKD1基因第15外显子DNA片段较长，约3.5kb，并确定了在cDNA中的相应位置，由此设计引物。通过PCR扩增，所得产物长度与设计相符合，进一步验证了人、鼠PKD1基因结构的相似性。筛选得到的阳性噬菌体克隆，其插入片段的一部分，根据限制性内切酶酶切图谱及亚克隆质粒的测序结果，参考人PKD1基因的外显子和内含子位置，确定克隆到的含有小鼠PKD1基因目的区域基因组DNA片段至少包含有9～16外显子，长度约为10kb，其结构及长度符合构建目标载体的要求。其余插入片段基因结构尚未分析，有待进一步研究。综上所述，已克隆到的基因组DNA片段，为产生PKD1基因缺陷小鼠品系准备了有利条件。
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本课题受国家863计划(102-10-04-03)部分资助
参考文献
1 Gabow PA. Autosomal dominant polycystic kidney disease.N Engl J Med, 1993, 329∶332-342.
2 Reeders ST, Breuning MH, Davis KE, et al. A highly polymorphic DNA marker linked to adult polycystic kidney disease on chromosome 16. Nature, 1985, 317∶542-544.
3 Peters DJM, Sandkuijl LA. Genetic heterogeneity of polycystic kidney disease in Europe. Contrib Nephrol, 1992, 97∶128-139.
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4 European Polycystic Kidney Disease Consortium.The polycystic kidney disease 1 gene encodes a 14 kb transcript and lies within a duplicated region on chromosome 16. Cell, 1994, 77∶881-894.
5 Hughes J, Ward CJ, Peral B, et al. The polycystic kidney disease 1 (PKD1) gene encodes a novel protein with multiple cell recognition domains. Nature Genet, 1995, 10∶151-159.
6 Olssson PG, Lohning C, Horsley S,et al. The mouse homologue of the polycysitc kidney disease gene 1(PKD1) is a single-copy gene. Genomics, 1996, 34∶233-235.
, 百拇医药
7 Lohning C, Nowicka U, Frischauf AM. The mouse homolog of PKD1:sequence analysis and alternative splicing. Mamm Genome, 1997, 8(5)∶307-311.
8 Yiping Hu, Martin D, Joseph TYL. Murine hepatic β-galactoside α2,6-sialyltransferase gene expression involves usage of a novel upstream exon region. Glycoconjugate J,1997,14∶407-411.
9 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. 2nd ed. 1989.14.14-14.19,2.108-2.114,9.31-9.52.
10 郁胜强，梅长林.多囊肾病动物模型的研究进展.国外医学泌尿系统分册，1998，18(增刊)∶75-77.
(收稿：1998-12-28 修回：1999-08-25), http://www.100md.com