Alzheimer病患者早老素-1基因第5外显子突变特征分析
作者：马秋兰 钱采韵 刘焯霖 卢锡林 林宏川
单位：510080 广州，中山医科大学附属一院神经科(马秋兰、钱采韵、刘焯霖、卢锡林)；广州市老人院(林宏川)
关键词：Alzheimer病；早老素-1；突变；遗传学
Alzheimer病患者早老素 【摘要】 目的 探讨早老素-1基因突变在散发性Alzheimer病(sporadic Alzheimer's disease, SAD)患者发病机理中的作用。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphsim,PCR-SSCP)及DNA直接测序技术检测68例SAD患者和65名正常老年人的早老素-1基因第5外显子。结果 发现68例SAD患者中有4例患者的SSCP发生泳动异常，DNA序列分析发现：这4例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG错义突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu 130 Met)；157号密码子发生了GTG→CTG错义突变(469位点发生G→C突变)，使氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸(Val 157 Leu)；有11例患者的SSCP表现为一条单链电泳迁移率明显增快，DNA序列分析发现：这11例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG错义突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu 130 Met)；154号密码子发生了TGC→TGT同义突变(462位点发生C→T)突变。结论 我们发现在SAD患者中存在早老素-1基因第5外显子突变，该突变点可能为中国人SAD患者早老素基因突变点之一。
, 百拇医药
A study on mutation of exon 5 of presenilin-1 in Alzheimer's disease
MA Qiulan, QIAN Caiyun, LIU Zhuolin, LU Xilin, LIN Hongchuan. Department of Neurology, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Scinece, Guangzhou 510080 P.R.China.
【Abstract】 Objective To explore the role of the mutation of presenilin-1 in pathogenesis of sporadic Alzheimer's disease.Methods The exon 5 of presenilin-1 was analysed by using ploymerase chain-reaction single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) and ABI 310 genetic analyzer technique in 68 patients with Alzheimer's disease and 65 normal controls.Results A mobility shift of SSCP in exon 5 of presenilin-1 was detected in 4 patients with Alzheimer's disease;two missense mutations were found. One mutation was at Leu 130 Met and the other at Val157 Leu.Another mobility shift of SSCP in exon 5 of presenilin-1 was detected in 11 patients with Alzheimer's disease. One missense mutation was at Leu 130Met and one same sense mutation C462→T. But no mobility shift of SSCP was found in patients with vascular dementia and in normal controls.Conclusion The authors found that mutations in exon 5 of presenilin-1 also existed in patients with sporadic Alzheimer's disease, which might be one of the points of mutations in sporadic Alzheimer's disease in Chinese.
, 百拇医药
【Key words】 Alzheimer's disease Presenilin-1 Mutation Genetics
最近研究发现，多数早发性家族性阿尔茨海默氏病(familial Alzheimer's disease,FAD)与14号染色体上的早老素-1(presenilin-1,PS-1)基因突变有关[1]，少数早发性FAD与PS-2基因突变有关。早老素基因与散发性Alzheimer病(sporadic Alzheimer's disease,SAD)的关系，目前国内外研究较少，为探讨PS-1基因突变在SAD发病机理中的作用，我们用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)、DNA直接测序技术检测了68例SAD患者及65名正常老年人PS-1基因第5外显子，发现在SAD患者中也存在PS-1基因第5外显子突。
, 百拇医药
1 对象和方法
1.1 研究对象
1.1.1 AD组68例，男22例，女46例，平均年龄79±8岁。全部病例从广州市老人院中筛选，应用简易精神状态量表(mini mental state examination,MMSE)、长谷川痴呆量表(Hasegawa dementia scale, HDS)进行痴呆筛选调查，采用美国国立神经病、语言机能紊乱和卒中研究所及阿尔茨海默氏病和相关疾病协会(the National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association, ADRDA-NINCDS)临床诊断标准，把诊断为‘可能性AD’的患者列为研究对象，全部患者无血缘关系。MMSE痴呆判断标准为：文盲组<17分，小学组<20分，中学以上组<24分，哈金斯基缺血量表(the Hachinski ischemic scale, HIS)缺血指数<4分。
, 百拇医药
1.1.2 正常对照组65人，男30人，女35人，平均年龄76±6岁。全部为正常健康老年人。
1.2 实验方法
1.2.1 常规酚提取法提取外周血DNA。
1.2.2 PS-1基因第5外显子体外扩增 见参考文献[2]。合成引物序列：上游为5′-GTGGTAATGT-GGTTGGTGAT-3′，下游为5-CCCAACCATAAG-AAGAACAG-3′。反应体积：25 μl，含有模板DNA50～100 ng、0.2 mmol/L dNTP、上下游引物各0.2 μmol/L、50 mmol KCl、1.5 mmol MgCl2、10 mmol Tris-HCl，pH8.3、1U Taq DNA聚合酶。PCR反应条件：95℃预变性5 分钟，然后按94℃30秒、58℃45秒、72℃30秒，35个循环，最后72℃10分钟。反应结束后，取PCR产物5μl，加1μl上样缓冲液，于质量浓度为0.012的琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外分析仪上检测PCR扩增产物的特异性。用100 bpDNA Ladder作marker测PCR产物片段大小，外显子5扩增长度为260bp(图1)。
, 百拇医药
图1 PS-1第5外显子PCR产物电泳图 M：分子量标准;a、b、c:PCR产物
Fig 1 PCR products of Exon 5 of presenilin-1 M：marker; a,b and c:PCR products
1.2.3 SSCP分析 取PCR产物8μl加上样缓冲液(体积分数为0.9的去离子甲酰胺、质量浓度为0.0005的溴酚蓝、质量浓度为0.0005的二甲苯睛蓝)等量，97℃变性10分钟，骤冷，10分钟后上样于质量浓度为0.1聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺为29∶1)电泳，200V恒压，20mA电流条件下电泳24小时。银染。观察变性后的二条单链电泳迁移率，比较AD患者和正常对照者有无不同。
1.2.4 DNA序列分析 采用ABI PRISM 310全自动基因分析仪分别对正常对照者、SSCP泳动异常及无SSCP泳动变位的AD患者的PCR产物直接进行DNA序列分析。
, 百拇医药
2 结果
SSCP结果分析发现，68例SAD患者中，有4例患者SSCP显示一条单链，另有11例患者表现为一条单链增快，提示在这些患者的PS-1基因第5外显子上可能存在某一共同的突变点(图2)。
图2 PCR-SSCP结果 M：分子量标准;a：正常人；b、d、e、f、g、h：发生突变的AD患者；c：未发生突变的AD患者
Fig 2 The result of PCR-SSCP M:marker; a:normal;b,d,e,f,g and h:mutations in patients with AD; c:no mutations in patients with AD
, 百拇医药
用基因分析仪分别对SSCP泳动异常、无SSCP泳动变位的SAD患者及正常人的PCR产物进行DNA序列分析发现：4例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu130Met)；157号密码子发生了GTG→CTG错义突变(469位点发生G→C突变)，使氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸(Val157 Leu)。另11例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu 130Met)；154号密码子发生了TGC-TGT突变(462位点发生C→T突变)，但未改变氨基酸的序列，为同义突变。在其他SAD患者和正常对照者中SSCP电泳均显示二条单链，无泳动异常。DNA序列分析结果见图3～6。
图3 正常人a PS-1第5外显子DNA测序结果(从正向测序)
, 百拇医药
Fig 3 Sequencing results of exon 5 of presenilin-1 in normal a
图4 发生突变的AD患者b PS-1第5外显子DNA测序结果(从反向测序)
Fig 4 Sequencing results of exon 5 of presenilin-1 in mutational patient b with AD
图5发生突变的AD患者g PS-1第5外显子DNA测序结果(从反向测序)
, 百拇医药
Fig 5 Sequencing results of exon 5 of presenilin-1 in mutational patient g with AD
图6 未发生突变的AD患者c S-1第5外显子DNA测序结果(从正向测序)
Fig 6 Sequencing results of exon 5 of presenilin-1 in non-mutational patient c with AD
3 讨论
我们用PCR-SSCP、DNA直接测序技术检测了68例SAD患者和65名正常老年人的早老素-1(PS-1)基因第5外显子，结果发现68例SAD患者中有15例发生PS-1基因第5外显子突变，即4例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG突变，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸；157号密码子发生了GTG-CTG错义突变，使氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸；另外11例SAD患者的130号密码子发生了CTG-ATG突变，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸；154号密码子发生了TGC-TGT同义突变，未改变氨基酸的序列。由于130号密码子编码早老素蛋白的第2个疏水跨膜区，此处为早老素蛋白的重要功能区，故发生在此处的突变考虑为病理突变。
, http://www.100md.com
早老素的发现，是近年来AD分子遗传学研究领域取得的一个新的进展，许多研究资料表明，早老素基因突变是AD发病的致病基因。目前，在不同种族的40多个家系中已发现PS-1基因的20多个不同突变[3]，多数发生在PS-1基因的第5、第8号外显子。目前发现的PS-1基因第5号外显子突变有：139密码子处Met→Val、Met→Thr、Met→Ile；146密码子处Met→Val；115密码子处Tyr→His；143密码子处Ile→Phe、Ile→Thr；120密码子处Glu→Lys突变[4，5]。这些研究是在FAD家系中进行的，对SAD基因突变的研究罕见报道。我们用PCR-SSCP、DNA直接测序技术发现在SAD患者中存在早老素-1基因突变，并测序明确了突变性质为错义突变和同义突变，突变部位为130、154、157密码子，此研究为进一步探讨SAD的病因学和发病机理提供了新的途径。
PS-1基因突变在AD中的致病机理尚不清楚，可能与PS-1基因突变导致APP的异常加工和转运、Tau蛋白等细胞骨架蛋白之间的相互作用异常、破坏离子通道，影响细胞内外Ca2+的交换等，进一步引起AD的病理改变有关。我们的发现对SAD的病因学和发病机理研究具有重要应用价值，并由此推测在SAD中可能存在其它尚未发现的基因突变，值得进一步深入研究。
, 百拇医药
志谢：本实验得到中山医科大学遗传教研室曾瑞萍教授、生化教研室罗超权教授、杨英洁教授的大力支持，特致谢意
本课题受“九五”国家医学科技攻关项目(96-906-05-07)、国家自然科学基金(39370269)资助
参考文献
1 Van Broeckhoven C. Presenilins and Alzheimer's disease. Nature Genet, 1995, 11(3)∶230-232.
2 Hayashi K. PCR-SSCP: a simple and sensitive method for detection of mutation in genomic DNA. PCR Methods Appl, 1991, 1(1)∶33-38.
, 百拇医药
3 Hutton M, Busfield F, Wragg M, et al. Complete analysis of the presenilin 1 gene in Alzheimer's disease. Neuroreport, 1996, 7(3)∶801-805.
4 Sherrington R, Rogaev EI, Liang Y,et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature, 1995, 375(6534)∶754-760.
5 Reznik-Wolf H, Treves TA, Davidson M, et al. A novel mutation of presenilin 1 in familial Alzheimer's disease in Israel detected by denaturing gradient gel electrophoresis. Hum Genet, 1996, 98(6)∶700-702.
(收稿：1999-03-19 修回：1999-05-10), 百拇医药
单位：510080 广州，中山医科大学附属一院神经科(马秋兰、钱采韵、刘焯霖、卢锡林)；广州市老人院(林宏川)
关键词：Alzheimer病；早老素-1；突变；遗传学
Alzheimer病患者早老素 【摘要】 目的 探讨早老素-1基因突变在散发性Alzheimer病(sporadic Alzheimer's disease, SAD)患者发病机理中的作用。方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphsim,PCR-SSCP)及DNA直接测序技术检测68例SAD患者和65名正常老年人的早老素-1基因第5外显子。结果 发现68例SAD患者中有4例患者的SSCP发生泳动异常，DNA序列分析发现：这4例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG错义突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu 130 Met)；157号密码子发生了GTG→CTG错义突变(469位点发生G→C突变)，使氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸(Val 157 Leu)；有11例患者的SSCP表现为一条单链电泳迁移率明显增快，DNA序列分析发现：这11例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG错义突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu 130 Met)；154号密码子发生了TGC→TGT同义突变(462位点发生C→T)突变。结论 我们发现在SAD患者中存在早老素-1基因第5外显子突变，该突变点可能为中国人SAD患者早老素基因突变点之一。
, 百拇医药
A study on mutation of exon 5 of presenilin-1 in Alzheimer's disease
MA Qiulan, QIAN Caiyun, LIU Zhuolin, LU Xilin, LIN Hongchuan. Department of Neurology, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Scinece, Guangzhou 510080 P.R.China.
【Abstract】 Objective To explore the role of the mutation of presenilin-1 in pathogenesis of sporadic Alzheimer's disease.Methods The exon 5 of presenilin-1 was analysed by using ploymerase chain-reaction single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) and ABI 310 genetic analyzer technique in 68 patients with Alzheimer's disease and 65 normal controls.Results A mobility shift of SSCP in exon 5 of presenilin-1 was detected in 4 patients with Alzheimer's disease;two missense mutations were found. One mutation was at Leu 130 Met and the other at Val157 Leu.Another mobility shift of SSCP in exon 5 of presenilin-1 was detected in 11 patients with Alzheimer's disease. One missense mutation was at Leu 130Met and one same sense mutation C462→T. But no mobility shift of SSCP was found in patients with vascular dementia and in normal controls.Conclusion The authors found that mutations in exon 5 of presenilin-1 also existed in patients with sporadic Alzheimer's disease, which might be one of the points of mutations in sporadic Alzheimer's disease in Chinese.
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【Key words】 Alzheimer's disease Presenilin-1 Mutation Genetics
最近研究发现，多数早发性家族性阿尔茨海默氏病(familial Alzheimer's disease,FAD)与14号染色体上的早老素-1(presenilin-1,PS-1)基因突变有关[1]，少数早发性FAD与PS-2基因突变有关。早老素基因与散发性Alzheimer病(sporadic Alzheimer's disease,SAD)的关系，目前国内外研究较少，为探讨PS-1基因突变在SAD发病机理中的作用，我们用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP)、DNA直接测序技术检测了68例SAD患者及65名正常老年人PS-1基因第5外显子，发现在SAD患者中也存在PS-1基因第5外显子突。
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1 对象和方法
1.1 研究对象
1.1.1 AD组68例，男22例，女46例，平均年龄79±8岁。全部病例从广州市老人院中筛选，应用简易精神状态量表(mini mental state examination,MMSE)、长谷川痴呆量表(Hasegawa dementia scale, HDS)进行痴呆筛选调查，采用美国国立神经病、语言机能紊乱和卒中研究所及阿尔茨海默氏病和相关疾病协会(the National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer's Disease and Related Disorders Association, ADRDA-NINCDS)临床诊断标准，把诊断为‘可能性AD’的患者列为研究对象，全部患者无血缘关系。MMSE痴呆判断标准为：文盲组<17分，小学组<20分，中学以上组<24分，哈金斯基缺血量表(the Hachinski ischemic scale, HIS)缺血指数<4分。
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1.1.2 正常对照组65人，男30人，女35人，平均年龄76±6岁。全部为正常健康老年人。
1.2 实验方法
1.2.1 常规酚提取法提取外周血DNA。
1.2.2 PS-1基因第5外显子体外扩增 见参考文献[2]。合成引物序列：上游为5′-GTGGTAATGT-GGTTGGTGAT-3′，下游为5-CCCAACCATAAG-AAGAACAG-3′。反应体积：25 μl，含有模板DNA50～100 ng、0.2 mmol/L dNTP、上下游引物各0.2 μmol/L、50 mmol KCl、1.5 mmol MgCl2、10 mmol Tris-HCl，pH8.3、1U Taq DNA聚合酶。PCR反应条件：95℃预变性5 分钟，然后按94℃30秒、58℃45秒、72℃30秒，35个循环，最后72℃10分钟。反应结束后，取PCR产物5μl，加1μl上样缓冲液，于质量浓度为0.012的琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外分析仪上检测PCR扩增产物的特异性。用100 bpDNA Ladder作marker测PCR产物片段大小，外显子5扩增长度为260bp(图1)。
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图1 PS-1第5外显子PCR产物电泳图 M：分子量标准;a、b、c:PCR产物
Fig 1 PCR products of Exon 5 of presenilin-1 M：marker; a,b and c:PCR products
1.2.3 SSCP分析 取PCR产物8μl加上样缓冲液(体积分数为0.9的去离子甲酰胺、质量浓度为0.0005的溴酚蓝、质量浓度为0.0005的二甲苯睛蓝)等量，97℃变性10分钟，骤冷，10分钟后上样于质量浓度为0.1聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺为29∶1)电泳，200V恒压，20mA电流条件下电泳24小时。银染。观察变性后的二条单链电泳迁移率，比较AD患者和正常对照者有无不同。
1.2.4 DNA序列分析 采用ABI PRISM 310全自动基因分析仪分别对正常对照者、SSCP泳动异常及无SSCP泳动变位的AD患者的PCR产物直接进行DNA序列分析。
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2 结果
SSCP结果分析发现，68例SAD患者中，有4例患者SSCP显示一条单链，另有11例患者表现为一条单链增快，提示在这些患者的PS-1基因第5外显子上可能存在某一共同的突变点(图2)。
图2 PCR-SSCP结果 M：分子量标准;a：正常人；b、d、e、f、g、h：发生突变的AD患者；c：未发生突变的AD患者
Fig 2 The result of PCR-SSCP M:marker; a:normal;b,d,e,f,g and h:mutations in patients with AD; c:no mutations in patients with AD
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用基因分析仪分别对SSCP泳动异常、无SSCP泳动变位的SAD患者及正常人的PCR产物进行DNA序列分析发现：4例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu130Met)；157号密码子发生了GTG→CTG错义突变(469位点发生G→C突变)，使氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸(Val157 Leu)。另11例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG突变(388位点发生C→A突变)，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸(Leu 130Met)；154号密码子发生了TGC-TGT突变(462位点发生C→T突变)，但未改变氨基酸的序列，为同义突变。在其他SAD患者和正常对照者中SSCP电泳均显示二条单链，无泳动异常。DNA序列分析结果见图3～6。
图3 正常人a PS-1第5外显子DNA测序结果(从正向测序)
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Fig 3 Sequencing results of exon 5 of presenilin-1 in normal a
图4 发生突变的AD患者b PS-1第5外显子DNA测序结果(从反向测序)
Fig 4 Sequencing results of exon 5 of presenilin-1 in mutational patient b with AD
图5发生突变的AD患者g PS-1第5外显子DNA测序结果(从反向测序)
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Fig 5 Sequencing results of exon 5 of presenilin-1 in mutational patient g with AD
图6 未发生突变的AD患者c S-1第5外显子DNA测序结果(从正向测序)
Fig 6 Sequencing results of exon 5 of presenilin-1 in non-mutational patient c with AD
3 讨论
我们用PCR-SSCP、DNA直接测序技术检测了68例SAD患者和65名正常老年人的早老素-1(PS-1)基因第5外显子，结果发现68例SAD患者中有15例发生PS-1基因第5外显子突变，即4例SAD患者的130号密码子发生了CTG→ATG突变，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸；157号密码子发生了GTG-CTG错义突变，使氨基酸由缬氨酸变为亮氨酸；另外11例SAD患者的130号密码子发生了CTG-ATG突变，使氨基酸由亮氨酸变为蛋氨酸；154号密码子发生了TGC-TGT同义突变，未改变氨基酸的序列。由于130号密码子编码早老素蛋白的第2个疏水跨膜区，此处为早老素蛋白的重要功能区，故发生在此处的突变考虑为病理突变。
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早老素的发现，是近年来AD分子遗传学研究领域取得的一个新的进展，许多研究资料表明，早老素基因突变是AD发病的致病基因。目前，在不同种族的40多个家系中已发现PS-1基因的20多个不同突变[3]，多数发生在PS-1基因的第5、第8号外显子。目前发现的PS-1基因第5号外显子突变有：139密码子处Met→Val、Met→Thr、Met→Ile；146密码子处Met→Val；115密码子处Tyr→His；143密码子处Ile→Phe、Ile→Thr；120密码子处Glu→Lys突变[4，5]。这些研究是在FAD家系中进行的，对SAD基因突变的研究罕见报道。我们用PCR-SSCP、DNA直接测序技术发现在SAD患者中存在早老素-1基因突变，并测序明确了突变性质为错义突变和同义突变，突变部位为130、154、157密码子，此研究为进一步探讨SAD的病因学和发病机理提供了新的途径。
PS-1基因突变在AD中的致病机理尚不清楚，可能与PS-1基因突变导致APP的异常加工和转运、Tau蛋白等细胞骨架蛋白之间的相互作用异常、破坏离子通道，影响细胞内外Ca2+的交换等，进一步引起AD的病理改变有关。我们的发现对SAD的病因学和发病机理研究具有重要应用价值，并由此推测在SAD中可能存在其它尚未发现的基因突变，值得进一步深入研究。
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志谢：本实验得到中山医科大学遗传教研室曾瑞萍教授、生化教研室罗超权教授、杨英洁教授的大力支持，特致谢意
本课题受“九五”国家医学科技攻关项目(96-906-05-07)、国家自然科学基金(39370269)资助
参考文献
1 Van Broeckhoven C. Presenilins and Alzheimer's disease. Nature Genet, 1995, 11(3)∶230-232.
2 Hayashi K. PCR-SSCP: a simple and sensitive method for detection of mutation in genomic DNA. PCR Methods Appl, 1991, 1(1)∶33-38.
, 百拇医药
3 Hutton M, Busfield F, Wragg M, et al. Complete analysis of the presenilin 1 gene in Alzheimer's disease. Neuroreport, 1996, 7(3)∶801-805.
4 Sherrington R, Rogaev EI, Liang Y,et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature, 1995, 375(6534)∶754-760.
5 Reznik-Wolf H, Treves TA, Davidson M, et al. A novel mutation of presenilin 1 in familial Alzheimer's disease in Israel detected by denaturing gradient gel electrophoresis. Hum Genet, 1996, 98(6)∶700-702.
(收稿：1999-03-19 修回：1999-05-10), 百拇医药