运用荧光定量多重PCR技术检测RB1基因突变
作者：杜琴 Brenda L Gallie
单位：杜琴 510010广州，广州军区广州总医院遗传中心；Brenda L Gallie Department of Cancer & Blood Research,Hospital for Sick Children,Toronto,Canada
关键词：视网膜母细胞瘤；RB1基因；突变筛查；定量荧光多重聚合酶链反应
运用荧光定量多重PCR技术检测 RB1基因突变 【摘要】 目的 建立一种半自动、简易、快速和不需放射性同位素技术，用以检测RB1基因突变的方法。方法 应用包括扩增RB1基因27个外显子和启动区在内的荧光定量多重PCR技术。将全基因分成若干组，每组3～7对引物，同时含对照C4引物并使用4对外对照，分别为RB的缺体、单体、双倍体及三体。在测试标本中，一个片段的拷贝数根据比较对照与标本的荧光强度而获得。利用自动片段处理软件2.1处理结果。结果 观察到小片段缺失、插入及外显子拷贝数缺失等突变。测序结果和RB瘤细胞杂合性丢失进一步证实荧光定量多重PCR的筛查结果。结论 此法是筛查患者基因缺失、插入的一种快速、简易的方法。应用此法可查出约50%的阳性病例。查出的突变不仅有小缺失、插入，也可发现用以往的方法所不能见到的外显子杂合性缺失病例。对临床基因缺陷的诊断有重要意义。
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Detection of RB1 mutations by using quantitative fluorescent multiplex PCR
DU Chin*，Brenda L Gallie.*Genetics Service Center,Guangzhou General Hospital of P.L.A.,Guangzhou,510010 P.R.China.E-mail:wadewm@public.guangzhou.gd.cn
【Abstract】 Objective To develop a half-automatic,simple,non-radioactive technique for rapid detection of mutation in the RB gene.Methods Quantitative fluorescent multiplex PCR(QFM-PCR) involves amplification of the promoter region and all 27 exons of the RB1 gene with fluorescein labeled primers in multiplex sets.Primers were divided into multiplex sets of three to seven pairs of primers,also contained were internal control primers C4.Four external controls were also tested by using nullisomic,monosomic,diploid,and trisomic for RB1.The number of copies of a fragment in a test sample was calculated by comparing fluorescence intensity of the fragment with these standards.Fragment value detection and subsequent calculations were performed automatically by Fragment Manager 2.1 software.Results Small deletions,insertions and whole exon deletion in the RB1 gene were detected from genomic DNA.Sequencing analysis and RB tumor homozygous mutation(LOH) confirmed the defects detected by QFM-PCR.Conclusion The approach is a rapid,cost-effective initial method for screening patient samples.It has been used to identify approximately 50% positives of tested samples.The mutations shown were not only small deletion and insertion,but also the single copy exons heterozygous mutations in the RB1 gene which the previously used methods were unable to detect. These features make the technique an attractive approach to clinical diagnosis of gene defects.
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【Key words】 Retinoblastoma RB1 gene Mutation screening Quantitative multiplex fluorescent polymerase chain reaction
视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)在最早期发现时可以治疗并存活。因此，在西方国家，RB瘤无症状的风险一级亲属的下一代，在出生3年内要求每半年在全麻下作常规眼底检查。虽然RB1基因已经克隆测序，但由于该基因较大，长200kb，包括27个外显子和启动区，加上未发现突变热点[1]，临床筛查RB基因缺陷仍然困难。使用核型分析、DNA和RNA印迹杂交或脉冲电场电泳(PFGE)只能发现大片段缺失[2-4]，而此类缺失只占RB的10%～15%病例。有些技术也曾用于检测点突变和几个碱基的缺失或插入。诸如核酸酶保护法、RT-PCR、DNA直接测序、SSCP、DGGE、高分辨凝胶电泳和异源双链分析等[5-10]。但是，上述方法均较繁琐而限制其在临床诊断实践中的应用。鉴于分析DNA较分析RNA为好，因为大多数RB的突变转录本都难以在体细胞中查出[5，6]。为此，我们建立了一种半自动定量荧光多重PCR技术。此法包括使用荧光标记引物，同时进行几组RB基因外显子的PCR，然后用自动激光荧光分析仪(automatic laser fluorescence analyser,ALF)进行扩增片段的自动检测和分析。定量包括内对照检查的标准化，然后与4种不同的标准作比较。每种标准有一定的RB等位基因数量。本法可检测单个碱基缺失或插入、部分或全外显子缺失以及外显子拷贝数变化等杂合性突变(heterozygous mutation)。为一种快速、首选筛查患者标本的方法。在测试的标本中，此法可检出大约50%阳性。现报告如下。
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1 材料和方法
1.1 定量荧光多重PCR
1.1.1 引物及组合 每对引物之一在5′端作荧光标记。将包括启动区和27个外显子在内的荧光标记引物组合成6组，分别进行多重PCR反应。按扩增片段长度和Tm值分组如下：第1组外显子6、7、9、10、11、12、27和C4；第2组外显子15、23、24、25和C4；第3组外显子1、16、19、21、22和C4；第4组外显子2、3、5、13和C4；第5组外显子4、14、20、22、26和C4；第6组外显子17、18、启动区和C4。每组中均有15号染色体上扩增视网膜甲醛结合蛋白基因(retinaldehyde-binding protein gene)第4外显子的C4内对照引物。也加入已知RB基因为缺体(nullisomic)(WERI-RB1细胞株，Mcfall实验室提供)、单体(monosomy)(EL株，Nedict实验室提供)、二倍体(正常)、三体(triosmy)(ALI株)作为外对照。
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1.1.2 PCR反应 反应体积50μl，含0.5μg基因组DNA，每种引物各150ng,3.6mmol/L dNTP,10% DMSO,16mmol/L(NH4)2SO4,67mmol/L Tris-HCl(pH8.8),6.7mmol/L MgCl2, 42.5μg BSA,1mmol/L疏基乙醇，6.8μmol/L EDTA(pH8.0),5U Taq DNA聚合酶。94℃变性3分钟后进入循环：94℃50秒，52℃50秒，72℃2分钟，共18个循环。70℃延伸10分钟。
1.1.3 结果观察 7μ1 PCR产物与7μ1 加样缓冲液混合，100℃变性2分钟，置冰上骤冷，用6%聚丙酰胺凝胶在ALF测序仪(Pharmacia)上电泳。
1.1.4 结果分析 用测试标本中各对引物的荧光强度与对照作比较，来反映拷贝的数量。各片段荧光强度值的检测和计算使用片段处理软件2.1(Pharmacia)自动处理。
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2 结果
2.1 我们实验使用的检测RB基因突变的方法分两步。第1步：用QFM-PCR法分析27个外显子及启动子有无缺失或插入。第2步：对测出可疑有突变的标本进行测序和RB瘤细胞检测证实。QFM-PCR结果阴性而疑有点突变的标本，则系统地、逐个外显子测序分析，检出了1例点突变标本。QFM-PCR的阳性率约为50%。用此法可检出外显子拷贝数变化突变。需要进一步强调的是(1)每个多重PCR反应中均加入了C4内对照。不同PCR反应中，RB片段所产生的峰区面积，在用C4校正后，可以直接进行比较；(2)每次反应中均有4种外对照，即RB1缺体、单体、二倍体和三倍体，这样可以将患者基因组DNA中RB基因的每个外显子和启动子的拷贝数，通过荧光强度与以上4种对照比较，则可计算出相对拷贝的数量。
我们用QFM-PCR在体细胞中检出了第9外显子单碱基杂合性缺失、第11外显子2个碱基杂合性缺失、第10外显子55个碱基插入的部分杂合性突变(partial heterozygous mutation)以及第10、24外显子单拷贝杂合性突变(complete heterozygous muta-tion)。RB肿瘤LOH和测序分析证实了这些突变。
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2.2 1例患有视网膜瘤的孕妇外周血RB基因第24外显子、C4和其它几个同时测试的外显子的检测结果(图1)。峰区值用内引物C4校正后，每个外显子的拷贝数由各外对照对比中计算出。先证者外显子24为正常(0.95)的半量(0.45)。此外，单体(EL)为0.44、三体(ALI)为1.45(其1/3为0.48)与第24外显子峰区值(0.45)相同。表明先证者为一例RB基因全24外显子的杂合性缺失。先证者的突变性质确认有助于提供产前诊断和其家庭成员患视网膜母细胞瘤风险的咨询。进一步用此法检测孕妇羊水细胞和其家属外周血后，发现胎儿无此缺失，她的一个表姊妹、一个侄儿和一个外甥女均有第24外显子单体杂合性缺失。
图1 QFM-PCR法检测出RB家系中RB1基因第24外显子缺失 先证者第24外显子单体缺失，呈杂合性；羊水细胞DNA分析患者胎儿正常。但患者的表姊妹、侄儿和外甥女均有24外显子单体杂合性缺失；C4是正常内对照，RB1缺体WERI、单体EL、二倍体N和三体ALI均为外对照
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Fig 1 QFM-PCR analysis of the exon 24 single copy herterozygous deletion of RB1 in the RB family The exon 24 single copy deletion was found from the proband genomic DNA；Prenatal diagnosis of DNA from amniotic fluid revealed that the fetus was unaffected,but the same mutation was found in RB affected individuals of the family；C4 as a normal standard of internal control and WERI(nullisomic),EL(monosomic),Normal(diploid)and ALI(trisomic)are external controls for gene copy variation
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2.3 一个PCR反应中同时扩增外显子9、11、10、12、6、27、7和C4的结果(图2) 患者的外周血、RB瘤细和外对照同时测定了峰区值。用同样方法进行比较后发现，除第10外显子外，其他外显子峰区值所代表的荧光强度与正常相同。而第10外显子只有正常的半量。而且在RB瘤细胞中第10外显子的峰区缺失。表明患者为RB基因第10外显子单体缺失的杂合子，而他的RB瘤细胞中有该外显子的杂合性丢失(LOH)，证实了这一突变。
图2 RB1基因第10外显子单体杂合性缺失 第9、11、10、12、6、27、7外显子和C4同时扩增，显示患者基因组DNA第10外显子单拷贝杂合性缺失，其RB瘤细胞第10外显子呈纯合性缺失(LOH)
Fig 2 Single copy heterozygous deletion in exon 10 of RB1 Exon 9,11,10,12,6,27,7and C4 were analysed in a single reaction Exon 10 showed single copy heterozygous deletion in blood DNA,and homozygous exon 10 deletion(loss of heterozygosity) in RB tumor DNA
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2.4 第9外显子单个碱基缺失病例(图3) 图中可见在第9外显子峰旁有一小峰。在外周血和瘤细胞中均能见到。经测序证实为碱基G缺失。患者为外显子9一个G杂合性缺失，RB瘤细胞判断为G纯合性缺失。患者的父母和同胞均正常。提示该病例属非遗传性体细胞突变新发生病例。
图3 RB1第9外显子单碱基杂合性缺失 RB瘤细胞显示纯合性缺失
Fig 3 Single base pair heterozygous deletion in exon 9 of RB1 From patient genomic DNA analysis and LOH in RB tumor cells
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2.5 第10外显子的2bp杂合性缺失(图4) 此缺失经测序证实。
图4 RB1第10外显子片段插入突变 第10外显子有一单拷贝峰区和一额外峰区的杂合性突变，且RB瘤细胞第10外显子完全消失而额外峰区呈纯合性突变。测序证实额外峰区由55bp片段插入第10外显子所致
Fig 4 An insertion mutation in exon 10 of RB1 A single copy deletion of exon 10 and an extra fragment peak heterozyous mutations were found from patient genomic DNA.The RB tumor DNA analysis showed loss of exon 10 and the extra peak homozygous mutation.Sequence results revealed that the extra peak results from a 55bp insertion of exon 10
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2.6 第10外显子55bp插入杂合性突变 在扩增外周血DNA后发现有一额外峰区出现。此外，还见RB瘤细胞的正常第10外显子峰区完全消失。ALF片段分析患者仅有一份拷贝(正常为两份拷贝)。而RB瘤细胞中额外峰区值2倍于体细胞，证实这是突变杂合性丢失所致。测序发现额外峰为55bp插入第10外显子所致。患者携带有第10外显子55bp杂合性插入而RB瘤细胞中判断为杂合性丢失。
3 讨论
QFM-PCR是一种半自动、简易、无放射性和快速检测RB1基因突变的技术。这些特点使其在临床诊断基因缺陷中特别有用。从经济效益来看，第2代一级亲属筛查的费用，用传统的方法要比我们使用的分子生物学方法贵12倍。传统的方法需要在3岁前每半年全麻下多次进行眼底检查。而且RB基因诊断的结果将使昂贵的眼底肿瘤监测术局限于携带了病变基因的患儿。
QFM-PCR法还可以检测等位基因拷贝数的改变，而其他方法诸如SSCP、DGGE，甚至测序也难以做到。目前，我们已经测试了50个病例以上的RB1基因的突变，其中50%左右的病例发现有不同类型的缺失和插入。这一结果有力的证明本法是一种诊断RB突变的好方法。它不仅能精确阐明突变的位置和性质，能早期发现风险儿的基因病变，而且可以有效对罹患者的家属检测后进行风险估计，以代替过去使用的经验风险率。推而广之，它可以应用于其他遗传病缺失和插入的检测和遗传咨询，大大地丰富了遗传咨询的内容和可信度。
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本课题受加拿大Medical Research Council基金资助
参考文献
1 McGee TL,Yandell DW,Dryja TP.Structure and partial genomic sequence of the human retinoblastoma susceptibility gene.Gene， 1989,(80)∶119-128.
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3 Fung YK,Murphree AL,T Ang A, et al.Structual evidence for the authenticity of the human retinoblastoma gene.Science, 1987,(235)∶1394-1399.
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5 Dunn M,Philips PA,Zhu X,et al. Mutations in the RB1 gene and their effects on transcription.Mol Cell Biol,1989,(9)∶4596-4604.
6 Kato MV,Ishizaki K,Toguchida J,et al.Mutations in the retinoblastoma gene and their expression in somatic and tumor cells of patients with hereditary retinoblastoma. Hum Genet, 1994,(3)∶44-51.
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7 Shimizu T,Toguchida J,Kato MV,et al. Detection of mutation of the RB1 gene in retinoblastoma patients by using exon by exon PCR-SSCP analysis. Am J Hum Genet,1994,(54)∶793-800.
8 Blanquet V,Turieac C,Gross MS,et al.Identification of germline mutations in the RB1 gene by denaturant gradient gel electrophoresis and polymerase chain reaction direct sequencing.Hum Mol Genet,1993,(2)∶975-979.
9 Lohmann DR,Horsthemke B,Gillessen KG,et al.Detection of small RB1 gene deletions in retinoblastoma by multiplex PCR and high-resolution gel electrophoresis.Hum Genet, 1992,(89)∶49-53.
10 Lohmnn DR,Brandt B,Hopping W,et al. Distinct RB1 gene mutations with low penetrance in hereditary retinoblastoma.Hum Genet, 1994,(94)∶349-354.
(收稿：1998-12-22 修回：1999-04-07), 百拇医药
单位：杜琴 510010广州，广州军区广州总医院遗传中心；Brenda L Gallie Department of Cancer & Blood Research,Hospital for Sick Children,Toronto,Canada
关键词：视网膜母细胞瘤；RB1基因；突变筛查；定量荧光多重聚合酶链反应
运用荧光定量多重PCR技术检测 RB1基因突变 【摘要】 目的 建立一种半自动、简易、快速和不需放射性同位素技术，用以检测RB1基因突变的方法。方法 应用包括扩增RB1基因27个外显子和启动区在内的荧光定量多重PCR技术。将全基因分成若干组，每组3～7对引物，同时含对照C4引物并使用4对外对照，分别为RB的缺体、单体、双倍体及三体。在测试标本中，一个片段的拷贝数根据比较对照与标本的荧光强度而获得。利用自动片段处理软件2.1处理结果。结果 观察到小片段缺失、插入及外显子拷贝数缺失等突变。测序结果和RB瘤细胞杂合性丢失进一步证实荧光定量多重PCR的筛查结果。结论 此法是筛查患者基因缺失、插入的一种快速、简易的方法。应用此法可查出约50%的阳性病例。查出的突变不仅有小缺失、插入，也可发现用以往的方法所不能见到的外显子杂合性缺失病例。对临床基因缺陷的诊断有重要意义。
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Detection of RB1 mutations by using quantitative fluorescent multiplex PCR
DU Chin*，Brenda L Gallie.*Genetics Service Center,Guangzhou General Hospital of P.L.A.,Guangzhou,510010 P.R.China.E-mail:wadewm@public.guangzhou.gd.cn
【Abstract】 Objective To develop a half-automatic,simple,non-radioactive technique for rapid detection of mutation in the RB gene.Methods Quantitative fluorescent multiplex PCR(QFM-PCR) involves amplification of the promoter region and all 27 exons of the RB1 gene with fluorescein labeled primers in multiplex sets.Primers were divided into multiplex sets of three to seven pairs of primers,also contained were internal control primers C4.Four external controls were also tested by using nullisomic,monosomic,diploid,and trisomic for RB1.The number of copies of a fragment in a test sample was calculated by comparing fluorescence intensity of the fragment with these standards.Fragment value detection and subsequent calculations were performed automatically by Fragment Manager 2.1 software.Results Small deletions,insertions and whole exon deletion in the RB1 gene were detected from genomic DNA.Sequencing analysis and RB tumor homozygous mutation(LOH) confirmed the defects detected by QFM-PCR.Conclusion The approach is a rapid,cost-effective initial method for screening patient samples.It has been used to identify approximately 50% positives of tested samples.The mutations shown were not only small deletion and insertion,but also the single copy exons heterozygous mutations in the RB1 gene which the previously used methods were unable to detect. These features make the technique an attractive approach to clinical diagnosis of gene defects.
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【Key words】 Retinoblastoma RB1 gene Mutation screening Quantitative multiplex fluorescent polymerase chain reaction
视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)在最早期发现时可以治疗并存活。因此，在西方国家，RB瘤无症状的风险一级亲属的下一代，在出生3年内要求每半年在全麻下作常规眼底检查。虽然RB1基因已经克隆测序，但由于该基因较大，长200kb，包括27个外显子和启动区，加上未发现突变热点[1]，临床筛查RB基因缺陷仍然困难。使用核型分析、DNA和RNA印迹杂交或脉冲电场电泳(PFGE)只能发现大片段缺失[2-4]，而此类缺失只占RB的10%～15%病例。有些技术也曾用于检测点突变和几个碱基的缺失或插入。诸如核酸酶保护法、RT-PCR、DNA直接测序、SSCP、DGGE、高分辨凝胶电泳和异源双链分析等[5-10]。但是，上述方法均较繁琐而限制其在临床诊断实践中的应用。鉴于分析DNA较分析RNA为好，因为大多数RB的突变转录本都难以在体细胞中查出[5，6]。为此，我们建立了一种半自动定量荧光多重PCR技术。此法包括使用荧光标记引物，同时进行几组RB基因外显子的PCR，然后用自动激光荧光分析仪(automatic laser fluorescence analyser,ALF)进行扩增片段的自动检测和分析。定量包括内对照检查的标准化，然后与4种不同的标准作比较。每种标准有一定的RB等位基因数量。本法可检测单个碱基缺失或插入、部分或全外显子缺失以及外显子拷贝数变化等杂合性突变(heterozygous mutation)。为一种快速、首选筛查患者标本的方法。在测试的标本中，此法可检出大约50%阳性。现报告如下。
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1 材料和方法
1.1 定量荧光多重PCR
1.1.1 引物及组合 每对引物之一在5′端作荧光标记。将包括启动区和27个外显子在内的荧光标记引物组合成6组，分别进行多重PCR反应。按扩增片段长度和Tm值分组如下：第1组外显子6、7、9、10、11、12、27和C4；第2组外显子15、23、24、25和C4；第3组外显子1、16、19、21、22和C4；第4组外显子2、3、5、13和C4；第5组外显子4、14、20、22、26和C4；第6组外显子17、18、启动区和C4。每组中均有15号染色体上扩增视网膜甲醛结合蛋白基因(retinaldehyde-binding protein gene)第4外显子的C4内对照引物。也加入已知RB基因为缺体(nullisomic)(WERI-RB1细胞株，Mcfall实验室提供)、单体(monosomy)(EL株，Nedict实验室提供)、二倍体(正常)、三体(triosmy)(ALI株)作为外对照。
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1.1.2 PCR反应 反应体积50μl，含0.5μg基因组DNA，每种引物各150ng,3.6mmol/L dNTP,10% DMSO,16mmol/L(NH4)2SO4,67mmol/L Tris-HCl(pH8.8),6.7mmol/L MgCl2, 42.5μg BSA,1mmol/L疏基乙醇，6.8μmol/L EDTA(pH8.0),5U Taq DNA聚合酶。94℃变性3分钟后进入循环：94℃50秒，52℃50秒，72℃2分钟，共18个循环。70℃延伸10分钟。
1.1.3 结果观察 7μ1 PCR产物与7μ1 加样缓冲液混合，100℃变性2分钟，置冰上骤冷，用6%聚丙酰胺凝胶在ALF测序仪(Pharmacia)上电泳。
1.1.4 结果分析 用测试标本中各对引物的荧光强度与对照作比较，来反映拷贝的数量。各片段荧光强度值的检测和计算使用片段处理软件2.1(Pharmacia)自动处理。
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2 结果
2.1 我们实验使用的检测RB基因突变的方法分两步。第1步：用QFM-PCR法分析27个外显子及启动子有无缺失或插入。第2步：对测出可疑有突变的标本进行测序和RB瘤细胞检测证实。QFM-PCR结果阴性而疑有点突变的标本，则系统地、逐个外显子测序分析，检出了1例点突变标本。QFM-PCR的阳性率约为50%。用此法可检出外显子拷贝数变化突变。需要进一步强调的是(1)每个多重PCR反应中均加入了C4内对照。不同PCR反应中，RB片段所产生的峰区面积，在用C4校正后，可以直接进行比较；(2)每次反应中均有4种外对照，即RB1缺体、单体、二倍体和三倍体，这样可以将患者基因组DNA中RB基因的每个外显子和启动子的拷贝数，通过荧光强度与以上4种对照比较，则可计算出相对拷贝的数量。
我们用QFM-PCR在体细胞中检出了第9外显子单碱基杂合性缺失、第11外显子2个碱基杂合性缺失、第10外显子55个碱基插入的部分杂合性突变(partial heterozygous mutation)以及第10、24外显子单拷贝杂合性突变(complete heterozygous muta-tion)。RB肿瘤LOH和测序分析证实了这些突变。
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2.2 1例患有视网膜瘤的孕妇外周血RB基因第24外显子、C4和其它几个同时测试的外显子的检测结果(图1)。峰区值用内引物C4校正后，每个外显子的拷贝数由各外对照对比中计算出。先证者外显子24为正常(0.95)的半量(0.45)。此外，单体(EL)为0.44、三体(ALI)为1.45(其1/3为0.48)与第24外显子峰区值(0.45)相同。表明先证者为一例RB基因全24外显子的杂合性缺失。先证者的突变性质确认有助于提供产前诊断和其家庭成员患视网膜母细胞瘤风险的咨询。进一步用此法检测孕妇羊水细胞和其家属外周血后，发现胎儿无此缺失，她的一个表姊妹、一个侄儿和一个外甥女均有第24外显子单体杂合性缺失。
图1 QFM-PCR法检测出RB家系中RB1基因第24外显子缺失 先证者第24外显子单体缺失，呈杂合性；羊水细胞DNA分析患者胎儿正常。但患者的表姊妹、侄儿和外甥女均有24外显子单体杂合性缺失；C4是正常内对照，RB1缺体WERI、单体EL、二倍体N和三体ALI均为外对照
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Fig 1 QFM-PCR analysis of the exon 24 single copy herterozygous deletion of RB1 in the RB family The exon 24 single copy deletion was found from the proband genomic DNA；Prenatal diagnosis of DNA from amniotic fluid revealed that the fetus was unaffected,but the same mutation was found in RB affected individuals of the family；C4 as a normal standard of internal control and WERI(nullisomic),EL(monosomic),Normal(diploid)and ALI(trisomic)are external controls for gene copy variation
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2.3 一个PCR反应中同时扩增外显子9、11、10、12、6、27、7和C4的结果(图2) 患者的外周血、RB瘤细和外对照同时测定了峰区值。用同样方法进行比较后发现，除第10外显子外，其他外显子峰区值所代表的荧光强度与正常相同。而第10外显子只有正常的半量。而且在RB瘤细胞中第10外显子的峰区缺失。表明患者为RB基因第10外显子单体缺失的杂合子，而他的RB瘤细胞中有该外显子的杂合性丢失(LOH)，证实了这一突变。
图2 RB1基因第10外显子单体杂合性缺失 第9、11、10、12、6、27、7外显子和C4同时扩增，显示患者基因组DNA第10外显子单拷贝杂合性缺失，其RB瘤细胞第10外显子呈纯合性缺失(LOH)
Fig 2 Single copy heterozygous deletion in exon 10 of RB1 Exon 9,11,10,12,6,27,7and C4 were analysed in a single reaction Exon 10 showed single copy heterozygous deletion in blood DNA,and homozygous exon 10 deletion(loss of heterozygosity) in RB tumor DNA
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2.4 第9外显子单个碱基缺失病例(图3) 图中可见在第9外显子峰旁有一小峰。在外周血和瘤细胞中均能见到。经测序证实为碱基G缺失。患者为外显子9一个G杂合性缺失，RB瘤细胞判断为G纯合性缺失。患者的父母和同胞均正常。提示该病例属非遗传性体细胞突变新发生病例。
图3 RB1第9外显子单碱基杂合性缺失 RB瘤细胞显示纯合性缺失
Fig 3 Single base pair heterozygous deletion in exon 9 of RB1 From patient genomic DNA analysis and LOH in RB tumor cells
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2.5 第10外显子的2bp杂合性缺失(图4) 此缺失经测序证实。
图4 RB1第10外显子片段插入突变 第10外显子有一单拷贝峰区和一额外峰区的杂合性突变，且RB瘤细胞第10外显子完全消失而额外峰区呈纯合性突变。测序证实额外峰区由55bp片段插入第10外显子所致
Fig 4 An insertion mutation in exon 10 of RB1 A single copy deletion of exon 10 and an extra fragment peak heterozyous mutations were found from patient genomic DNA.The RB tumor DNA analysis showed loss of exon 10 and the extra peak homozygous mutation.Sequence results revealed that the extra peak results from a 55bp insertion of exon 10
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2.6 第10外显子55bp插入杂合性突变 在扩增外周血DNA后发现有一额外峰区出现。此外，还见RB瘤细胞的正常第10外显子峰区完全消失。ALF片段分析患者仅有一份拷贝(正常为两份拷贝)。而RB瘤细胞中额外峰区值2倍于体细胞，证实这是突变杂合性丢失所致。测序发现额外峰为55bp插入第10外显子所致。患者携带有第10外显子55bp杂合性插入而RB瘤细胞中判断为杂合性丢失。
3 讨论
QFM-PCR是一种半自动、简易、无放射性和快速检测RB1基因突变的技术。这些特点使其在临床诊断基因缺陷中特别有用。从经济效益来看，第2代一级亲属筛查的费用，用传统的方法要比我们使用的分子生物学方法贵12倍。传统的方法需要在3岁前每半年全麻下多次进行眼底检查。而且RB基因诊断的结果将使昂贵的眼底肿瘤监测术局限于携带了病变基因的患儿。
QFM-PCR法还可以检测等位基因拷贝数的改变，而其他方法诸如SSCP、DGGE，甚至测序也难以做到。目前，我们已经测试了50个病例以上的RB1基因的突变，其中50%左右的病例发现有不同类型的缺失和插入。这一结果有力的证明本法是一种诊断RB突变的好方法。它不仅能精确阐明突变的位置和性质，能早期发现风险儿的基因病变，而且可以有效对罹患者的家属检测后进行风险估计，以代替过去使用的经验风险率。推而广之，它可以应用于其他遗传病缺失和插入的检测和遗传咨询，大大地丰富了遗传咨询的内容和可信度。
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本课题受加拿大Medical Research Council基金资助
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(收稿：1998-12-22 修回：1999-04-07), 百拇医药