脊肌萎缩症的产前基因诊断
作者：袁丽芳 刘天慈 马素参 周文敏 杨涛 吴沪生 孙念怙 赵时敏
单位：袁丽芳 马素参 杨涛 100005北京，中国医学科学院基础医学研究所 中国协和科大学基础医学院医学遗传室；刘天慈 周文敏 吴沪生 首都医科大学附属儿童医院；孙念怙 赵时敏 北京协和医院
关键词：
脊肌萎缩症的产前基因诊断 脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是较常见的常染色体隐性遗传病。在白种人中发生率为1/6000[1]，我国尚无统计，但不少见。根据病情轻重及病程，本病可分3型[2]：Ⅰ型又称重型，急性型、婴儿型，或Werdnig-Hoffman disease;Ⅱ型又称中间型；Ⅲ型又称Kuglberg-Walender disease。由于本病目前尚无治疗方法，再现率高，许多家庭要求产前诊断。为建立产前诊断方法，我们对46个SMA患儿作运动神经原存活基因(survival motor neuron,SMN)基因缺失的检测，对36个SMA家系应用3个与SMA基因紧密连锁的CA重复序列位点JK53CAl/2、5DS637及CATT1进行家系连锁分析。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 检测对象 46例患儿均符合SMA诊断标准[2]：(1)临床表现符合脊髓前角运动神经原病变：肌力、肌张力减弱，腱反射减弱或消失，肌萎缩，纤颤；(2)血清CPK正常或稍高；(3)肌电图：前角运动神经原损害；(4)肌活检符合SMA病变；(5)家族史符合常染色体隐性遗传，有家族史者免活检。Ⅰ型于6个月内发病，不能独坐，2岁前死亡；Ⅱ型于1岁内发病，能独坐，但不能行走；Ⅲ型于3岁后发病，能行走，但肌无力。
1.1.2 DNA来源 46例患儿来自北京市儿童医院及北京协和医院儿科遗传门诊。Ⅰ型18例，Ⅱ型28例。10名正常人作为对照。取患儿及其父母(家系核心成员)以及正常人血用盐析法提取DNA，产前诊断取绒毛或羊水细胞DNA用苯酚、氯仿法提取。
1.2 方法
, http://www.100md.com
1.2.1 SMA基因缺失的检测 对46例SMA患儿用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)分析作端粒侧(Tel)外显子7的检测。引物序列、SSCP分析方法见文献[3]。
1.2.2 PCR扩增SMA基因旁侧CA重复序列作家系连锁分析 (1)36个SMA家系成员的基因组DNA用3对SMA旁侧CA重复序列位点：JK53CA1/2,5DS637,CATT1进行PCR扩增，这三个位点均位于5q13，其特性、序列及扩增条件见文献[4]。(2)PCR产物分别行6%～8%变性聚丙烯酰胺电泳。电泳条件：1×TBE，电压580V，电流30mA,2～4小时。(3)银染 连锁分析方法见文献[4]。
1.3 7例SMA产前基因诊断 有两对夫妇生过1个SMA Ⅰ型患儿，已病故。于孕期9～10周取绒毛、或16周后取羊水提取DNA作PCR-SSCP分析，无先证者样品的家系仅测胎儿是否有SMA基因缺失，其他5个核心家系均作基因缺失检测及家系连锁分析。5例于孕早期9～10周取绒毛，1例取羊水细胞分析，另1例同时作绒毛及羊水细胞分析。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 基因缺失检测 40例有SMN基因端粒侧外显子7的纯合性缺失，其中一例的母亲、另一例的父亲也有同样的纯缺失。6例未见基因缺失，缺失率为87%。
2.2 核心家系作连锁分析结果 JK53CA1/2位点的可诊断率为25/36(70%)，5DS637的可诊断率为30/36(84%)，CATTⅠ为15/16(94%)。
2.3 7例产前诊断结果 3例胎儿PCR-SSCP分析结果为父母正常，胎儿有SMN Tel外显子7的纯合性缺失(图1)，其中1例同时以5DS637作家系连锁分析，证明胎儿患病(图2)，终止妊娠。其他4例PCR-SSCP分析未见SMN Tel外显子7基因纯合性缺失，这四个家系都作了家系连锁分析，3例于5DS637位点获得信息，1例根据5DS637及JK53CA1/2两个位点作出判断。连锁分析结果说明胎儿为杂合子或正常纯合子。产前诊断结果判断为正常的胎儿均已出生，年龄分别为2个月、8个月、1岁2个月及1岁5个月，精神运动发育正常。
, http://www.100md.com
图1 应用PCR-SSCP检测SMATel外显子7 进行SMA产前诊断(例7) 箭头显示胎儿SMN外显子7缺失.N：正常对照；A：患儿；T：SMN Tel外显子7标准；F：父亲；M：母亲；P：先证者；Fe:胎儿
图2 PCR及8%变性胶电泳 用5DS637位点作家系7连锁分析，进行SMA产前基因诊断。结果显示：羊水细胞的带型与患儿相同，与母亲不同，说明胎儿患病；F：父亲；M：母亲；P：先证者；Fe：胎儿(羊水细胞DNA)
3 讨论
1990年Brzustowicz[5]及Melki[6]等将三型SMA定位于5qll-5q13。此后不少学者在此区域找到许多与SMA基因紧密连锁的多态位点，为家系连锁分析提供了良好条件。1995年Lefebvre[7]及Roy[8]两组实验室分别克隆分离出2个SMA候选基因，各自命名为运动神经原存活基因及神经原凋亡抑制蛋白基因(neuronal-apoptosis inhibitory protein,NAIP)，二者都能满足基因条件，均位于5q13。并各有2个拷贝，一个位于着丝粒侧，另一个位于端粒侧，认为端粒侧具有功能。Lefebvre等[7]对229例SMA患者作PCR-SSCP分析，发现其中98%有SMN Tel外显子7的纯合性缺失。其他学者报道的缺失率为84%～100%。我们应用PCR-SSCP对46例SMA患儿检测SMN Tel外显子7是否缺失，并用与SMA基因紧密连锁的3个CA重复序列位点：JK53CA1/2、5DS637及CATT1，对36个SMA家系进行家系连锁分析，在此基础上作了7例SMA的产前基因诊断。结果说明，应用SMA基因旁侧CA重复序列作家系连锁分析联合SMN外显子7缺失检测，可有效地进行SMA的基因诊断及产前诊断。方法简便，可靠，快速，适用于临床。此外，由于SMA患儿的SMN Tel外显子7纯合性缺失率高达87%以上，因此可用于临床诊断SMA，取代肌活检，且特异性更高。至于1个SMA患儿的母亲也发现有SMN Tel外显子7的纯合缺失，经一些作者分析认为，他们虽有SMN Tel外显子7的缺失，但SMN着丝粒侧(Cen)外显子7的拷贝数增加，SMN Cen外显子7作用虽弱，但拷贝数增加后可以完全代偿SMN Tel外显子7的功能[9]，因而不出现症状。产前诊断必须严格、谨慎，尽可能于孕早期取绒毛，细心挑取绒毛至关重要。如果胎儿的基因型与母亲相同，必须选作另一条染色体上的多态位点进行分析，以排除样品为母体细胞污染的可能。
, 百拇医药
志谢 本课题承北京市协和医院郭玉璞教授、任海涛同志协助作病理学检查，Dr.Lefebvre惠赠SMNexon7标准，特致谢意
本项目受卫生部科学研究基金(94-1-012)资助
参考文献
1 Lewin B.Genes for SMA:Multum in parvo.Cell,1995,80(1)∶1-5.
2 Cobben JM,Visser M de,Scheffer H,et al.Confirmation of clinical diagnosis on requests for prenatal prediction of SMA type Ⅰ. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1993,56(3)∶319-321.
, 百拇医药
3 杨涛，袁丽芳，刘天慈，等.脊肌萎缩症基因缺失的初步研究.中华医学遗传学杂志，1998，15(2)∶95-97.
4 袁丽芳，刘天慈，杨涛，等.儿童期脊肌萎缩症的基因诊断及产前基因诊断.中华儿科杂志，1997，35(12)∶631-634.
5 Burzustowicz LM,Lehner T,Castilla LH,et al.Genetic mapping of chronic childhood-onset spinal muscular atrophy to chromosome 5q11.2-q13.Nature,1990,344(6266)∶540-541.
6 Melki J,Sheth P,Abdelhak S,et al.Mapping of acute (type Ⅰ) spinal muscular atrophy to chromosome 5q12-q14.Lancet,1990,336(8710)∶171-173.
, 百拇医药
7 Lefebvre S,Burgten L,Reboullet S,et al.Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene.Cell,1995,80(1)∶155-165.
8 Roy N,Mahadevan MS,McLean M,et al.The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is partially deleted in individuals with spinal muscular atrophy.Cell,1995,80(1)∶167-168.
9 Campbell L,Potter A,Ignatius J,et al.Genomic variation and gene onversion in spinal muscular atrophy:implication for disease processs and clinical phenotype.Am J Hum Genet,1997,61(4)∶40-50.
(收稿：1999-02-25 修回：1999-04-15), http://www.100md.com
单位：袁丽芳 马素参 杨涛 100005北京，中国医学科学院基础医学研究所 中国协和科大学基础医学院医学遗传室；刘天慈 周文敏 吴沪生 首都医科大学附属儿童医院；孙念怙 赵时敏 北京协和医院
关键词：
脊肌萎缩症的产前基因诊断 脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是较常见的常染色体隐性遗传病。在白种人中发生率为1/6000[1]，我国尚无统计，但不少见。根据病情轻重及病程，本病可分3型[2]：Ⅰ型又称重型，急性型、婴儿型，或Werdnig-Hoffman disease;Ⅱ型又称中间型；Ⅲ型又称Kuglberg-Walender disease。由于本病目前尚无治疗方法，再现率高，许多家庭要求产前诊断。为建立产前诊断方法，我们对46个SMA患儿作运动神经原存活基因(survival motor neuron,SMN)基因缺失的检测，对36个SMA家系应用3个与SMA基因紧密连锁的CA重复序列位点JK53CAl/2、5DS637及CATT1进行家系连锁分析。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 检测对象 46例患儿均符合SMA诊断标准[2]：(1)临床表现符合脊髓前角运动神经原病变：肌力、肌张力减弱，腱反射减弱或消失，肌萎缩，纤颤；(2)血清CPK正常或稍高；(3)肌电图：前角运动神经原损害；(4)肌活检符合SMA病变；(5)家族史符合常染色体隐性遗传，有家族史者免活检。Ⅰ型于6个月内发病，不能独坐，2岁前死亡；Ⅱ型于1岁内发病，能独坐，但不能行走；Ⅲ型于3岁后发病，能行走，但肌无力。
1.1.2 DNA来源 46例患儿来自北京市儿童医院及北京协和医院儿科遗传门诊。Ⅰ型18例，Ⅱ型28例。10名正常人作为对照。取患儿及其父母(家系核心成员)以及正常人血用盐析法提取DNA，产前诊断取绒毛或羊水细胞DNA用苯酚、氯仿法提取。
1.2 方法
, http://www.100md.com
1.2.1 SMA基因缺失的检测 对46例SMA患儿用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)分析作端粒侧(Tel)外显子7的检测。引物序列、SSCP分析方法见文献[3]。
1.2.2 PCR扩增SMA基因旁侧CA重复序列作家系连锁分析 (1)36个SMA家系成员的基因组DNA用3对SMA旁侧CA重复序列位点：JK53CA1/2,5DS637,CATT1进行PCR扩增，这三个位点均位于5q13，其特性、序列及扩增条件见文献[4]。(2)PCR产物分别行6%～8%变性聚丙烯酰胺电泳。电泳条件：1×TBE，电压580V，电流30mA,2～4小时。(3)银染 连锁分析方法见文献[4]。
1.3 7例SMA产前基因诊断 有两对夫妇生过1个SMA Ⅰ型患儿，已病故。于孕期9～10周取绒毛、或16周后取羊水提取DNA作PCR-SSCP分析，无先证者样品的家系仅测胎儿是否有SMA基因缺失，其他5个核心家系均作基因缺失检测及家系连锁分析。5例于孕早期9～10周取绒毛，1例取羊水细胞分析，另1例同时作绒毛及羊水细胞分析。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 基因缺失检测 40例有SMN基因端粒侧外显子7的纯合性缺失，其中一例的母亲、另一例的父亲也有同样的纯缺失。6例未见基因缺失，缺失率为87%。
2.2 核心家系作连锁分析结果 JK53CA1/2位点的可诊断率为25/36(70%)，5DS637的可诊断率为30/36(84%)，CATTⅠ为15/16(94%)。
2.3 7例产前诊断结果 3例胎儿PCR-SSCP分析结果为父母正常，胎儿有SMN Tel外显子7的纯合性缺失(图1)，其中1例同时以5DS637作家系连锁分析，证明胎儿患病(图2)，终止妊娠。其他4例PCR-SSCP分析未见SMN Tel外显子7基因纯合性缺失，这四个家系都作了家系连锁分析，3例于5DS637位点获得信息，1例根据5DS637及JK53CA1/2两个位点作出判断。连锁分析结果说明胎儿为杂合子或正常纯合子。产前诊断结果判断为正常的胎儿均已出生，年龄分别为2个月、8个月、1岁2个月及1岁5个月，精神运动发育正常。
, http://www.100md.com
图1 应用PCR-SSCP检测SMATel外显子7 进行SMA产前诊断(例7) 箭头显示胎儿SMN外显子7缺失.N：正常对照；A：患儿；T：SMN Tel外显子7标准；F：父亲；M：母亲；P：先证者；Fe:胎儿
图2 PCR及8%变性胶电泳 用5DS637位点作家系7连锁分析，进行SMA产前基因诊断。结果显示：羊水细胞的带型与患儿相同，与母亲不同，说明胎儿患病；F：父亲；M：母亲；P：先证者；Fe：胎儿(羊水细胞DNA)
3 讨论
1990年Brzustowicz[5]及Melki[6]等将三型SMA定位于5qll-5q13。此后不少学者在此区域找到许多与SMA基因紧密连锁的多态位点，为家系连锁分析提供了良好条件。1995年Lefebvre[7]及Roy[8]两组实验室分别克隆分离出2个SMA候选基因，各自命名为运动神经原存活基因及神经原凋亡抑制蛋白基因(neuronal-apoptosis inhibitory protein,NAIP)，二者都能满足基因条件，均位于5q13。并各有2个拷贝，一个位于着丝粒侧，另一个位于端粒侧，认为端粒侧具有功能。Lefebvre等[7]对229例SMA患者作PCR-SSCP分析，发现其中98%有SMN Tel外显子7的纯合性缺失。其他学者报道的缺失率为84%～100%。我们应用PCR-SSCP对46例SMA患儿检测SMN Tel外显子7是否缺失，并用与SMA基因紧密连锁的3个CA重复序列位点：JK53CA1/2、5DS637及CATT1，对36个SMA家系进行家系连锁分析，在此基础上作了7例SMA的产前基因诊断。结果说明，应用SMA基因旁侧CA重复序列作家系连锁分析联合SMN外显子7缺失检测，可有效地进行SMA的基因诊断及产前诊断。方法简便，可靠，快速，适用于临床。此外，由于SMA患儿的SMN Tel外显子7纯合性缺失率高达87%以上，因此可用于临床诊断SMA，取代肌活检，且特异性更高。至于1个SMA患儿的母亲也发现有SMN Tel外显子7的纯合缺失，经一些作者分析认为，他们虽有SMN Tel外显子7的缺失，但SMN着丝粒侧(Cen)外显子7的拷贝数增加，SMN Cen外显子7作用虽弱，但拷贝数增加后可以完全代偿SMN Tel外显子7的功能[9]，因而不出现症状。产前诊断必须严格、谨慎，尽可能于孕早期取绒毛，细心挑取绒毛至关重要。如果胎儿的基因型与母亲相同，必须选作另一条染色体上的多态位点进行分析，以排除样品为母体细胞污染的可能。
, 百拇医药
志谢 本课题承北京市协和医院郭玉璞教授、任海涛同志协助作病理学检查，Dr.Lefebvre惠赠SMNexon7标准，特致谢意
本项目受卫生部科学研究基金(94-1-012)资助
参考文献
1 Lewin B.Genes for SMA:Multum in parvo.Cell,1995,80(1)∶1-5.
2 Cobben JM,Visser M de,Scheffer H,et al.Confirmation of clinical diagnosis on requests for prenatal prediction of SMA type Ⅰ. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 1993,56(3)∶319-321.
, 百拇医药
3 杨涛，袁丽芳，刘天慈，等.脊肌萎缩症基因缺失的初步研究.中华医学遗传学杂志，1998，15(2)∶95-97.
4 袁丽芳，刘天慈，杨涛，等.儿童期脊肌萎缩症的基因诊断及产前基因诊断.中华儿科杂志，1997，35(12)∶631-634.
5 Burzustowicz LM,Lehner T,Castilla LH,et al.Genetic mapping of chronic childhood-onset spinal muscular atrophy to chromosome 5q11.2-q13.Nature,1990,344(6266)∶540-541.
6 Melki J,Sheth P,Abdelhak S,et al.Mapping of acute (type Ⅰ) spinal muscular atrophy to chromosome 5q12-q14.Lancet,1990,336(8710)∶171-173.
, 百拇医药
7 Lefebvre S,Burgten L,Reboullet S,et al.Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene.Cell,1995,80(1)∶155-165.
8 Roy N,Mahadevan MS,McLean M,et al.The gene for neuronal apoptosis inhibitory protein is partially deleted in individuals with spinal muscular atrophy.Cell,1995,80(1)∶167-168.
9 Campbell L,Potter A,Ignatius J,et al.Genomic variation and gene onversion in spinal muscular atrophy:implication for disease processs and clinical phenotype.Am J Hum Genet,1997,61(4)∶40-50.
(收稿：1999-02-25 修回：1999-04-15), http://www.100md.com