线粒体DNA点突变与肥厚型心肌病的关系
作者：郝志新 张丽容 张丽珊 黄鹰 尹桂芝 乔增勇
单位：郝志新(100038北京，铁道部北京铁路总医院心内科)；张丽容(南京铁道医学院附属医院心内科)；尹桂芝(南京铁道医学院附属医院心内科)；乔增勇(南京铁道医学院附属医院心内科)；张丽珊(生物学教研室)；黄鹰(生物学教研室)
关键词：
肥厚型心肌病 肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)是以心肌肥厚、心肌纤维排列紊乱为特征的一种特发性心肌病。已证实HCM是儿童及青年人猝死最常见原因之一，发生率为1%～6%[1，2]。由于该病临床表现多样，部分患者可在无任何症状且心电图、超声心动图未出现异常的情况下因剧烈运动发生猝死，因此，从分子水平对HCM进行研究，对于阐明该病的发生机理，早期诊断、防治具有重要意义。有些学者[3-6]研究发现某些HCM与线粒体(mtDNA)的缺失和点突变有关。我们应用PCR、PCR-SSCP及PCR产物直接银染测序技术，对19例HCM患者及20名正常对照个体的外周血淋巴细胞的mtDNA进行研究，以探讨HCM与mtDNA点突变的关系。
, 百拇医药
1 对象与方法
1.1 对象 HCM患者19例，诊断标准按照超声心动图室间隔或心室肌层≥13mm，除外引起继发性心肌肥厚的疾病如原发性高血压、心瓣膜病等。正常对照20名。对1例发现有mtDNA点突变的患者进行家系调查，其母亲、姐姐、次子分别于32岁、20岁、15岁猝死，长子健在，表型正常。
1.2 DNA提取 常规苯酚/氯仿法提取患者外周血淋巴细胞的基因组DNA(内含mtDNA)。
1.3 PCR扩增 采用Perkin/Cerus公司的热循环仪进行扩增，所用的1对引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成：引物序列为：L链(11641-11660)：5′-AGCCCTCGTACTAA-CAGCCA-3′；H链：(11981-11961)5′-GGAGTATAGGGCTG-TTGACTA-3′。扩增的这段特异的mtDNA由NADH脱氢酶亚单位4(ND4)所编码。
, 百拇医药
1.4 PCR-SSCP 采用非变性聚丙烯酰胺凝胶法检测。
1.5 PCR产物纯化 采用High Pure PCR Product Purification药盒(Boehringer Mannheim)进行纯化。
1.6 序列分析 按常规双脱氧末端终止法进行测序，试剂为Silver SequenceTM DNA Sequencing System(Promege公司)。
2 结果
2.1 PCR-SSCP结果分析 在HCM患者及正常对照个体外周血mtDNA COI ND4功能区，有1例患者的电泳带异常。对患者丈夫及长子的外周血进行筛查，发现患者与其长子呈现相同异常的电泳带，而丈夫电泳带与正常对照相同。
, 百拇医药 2.2 序列分析 患者及其长子均发现有两个位点的突变，分别位于mtDNA H链第11856、11892位点，T均突变为G，相应于L链A突变为C，分别导致天冬酰胺变为苏氨酸，谷氨酸变成丙氨酸。这两个位点的突变均为杂合型，即同一标本除存在突变的mtDNA外，在相应位置同时有正常的mtDNA。
3 讨论
mtDNA在氧化磷酸化(OXPHOS)的组装过程中起重要作用，OXPHOS由5种酶复合物组成(复合物I-V)，其中13条与复合物相关的肽腱亚单位由mtDNA编码，mtDNA各基因排列紧密，几乎不含内含子序列，mtDNA上发生的任何突变都会累及到基因组中的重要功能区，从而影响OXPHOS过程，使ATP产生下降。心肌组织在能量不足的情况下，会发生退行性改变及代偿性肥厚增生等病理变化，从而导致疾病的发生。
HCM患者外周血mtDNA H链11856、11892位点T突变为G，相应于L链A突变为C，分别使ND4功能区第366位密码子AAC(天冬酰胺，Asn)变成ACC(苏氨酸，Thr)，第378位密码子GAA(谷氨酸，Glu)，变成GCA(丙氨酸，Ala)。天冬酰胺和谷氨酸在线虫→果蝇→海胆→非洲蟾蜍→鸡→鲸→牛→人基因种系进化中均为高度保守的[7]。
, http://www.100md.com
这两个位点的突变均位于mtDNA编码的复合物Ⅰ(COⅠ)，COⅠ由ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6 7个亚单位组成，它是电子传递链的起点，将线粒体外的电子传递到线粒体内，再经COⅢ、COⅣ传递给O2，通过OXPHOS机理驱动ATP的合成。因此，mtDNA ND4功能区11856、11892位点的碱基置换造成保守氨基酸的改变，必然导致COⅠ的功能缺陷，影响OXPHOS。本实验中mtDNA取自患者的外周血细胞，而研究表明，血细胞中的mtDNA突变数量低于成纤维细胞、肌肉细胞、上皮细胞等，即心肌细胞积累了更多的突变mtDNA。
mtDNA遗传学特征之一是母系遗传。对该患者进行家系探查，发现其母亲、姐姐、次子均在青壮年猝死。长子健在，经检查与患者存在相同的突变，而患者丈夫是正常的。家系分析显示，呈母系遗传倾向。我们推测患者的母亲、姐姐、次子亦为HCM患者，他们可能都存在mtDNA突变。
, 百拇医药
与核基因的传递方式不同，mtDNA除按母系遗传外，其突变与表型的关系常与mtDNA中突变型与野生型所占的比例有关，即突变型比例达到一定时发病，称为阈值效应。患者长子表型虽正常，但我们发现其mtDNA也存在上述两位点的突变，可能与突变型mtDNA比例未达到阈值有关。
本实验仅涉及COⅠ ND4功能区，mtDNA上可能还存在其他的突变位点，有待于进一步研究证实。
基金项目：江苏省卫生厅基金项目(H9512)
参考文献
[1]Mckenna WJ, Camm AJ. Sudden death in hypertrophic cardiomyopathy:assessment of patients at high risk. Circulation, 1989,80∶1489-1492., 百拇医药
单位：郝志新(100038北京，铁道部北京铁路总医院心内科)；张丽容(南京铁道医学院附属医院心内科)；尹桂芝(南京铁道医学院附属医院心内科)；乔增勇(南京铁道医学院附属医院心内科)；张丽珊(生物学教研室)；黄鹰(生物学教研室)
关键词：
肥厚型心肌病 肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)是以心肌肥厚、心肌纤维排列紊乱为特征的一种特发性心肌病。已证实HCM是儿童及青年人猝死最常见原因之一，发生率为1%～6%[1，2]。由于该病临床表现多样，部分患者可在无任何症状且心电图、超声心动图未出现异常的情况下因剧烈运动发生猝死，因此，从分子水平对HCM进行研究，对于阐明该病的发生机理，早期诊断、防治具有重要意义。有些学者[3-6]研究发现某些HCM与线粒体(mtDNA)的缺失和点突变有关。我们应用PCR、PCR-SSCP及PCR产物直接银染测序技术，对19例HCM患者及20名正常对照个体的外周血淋巴细胞的mtDNA进行研究，以探讨HCM与mtDNA点突变的关系。
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1 对象与方法
1.1 对象 HCM患者19例，诊断标准按照超声心动图室间隔或心室肌层≥13mm，除外引起继发性心肌肥厚的疾病如原发性高血压、心瓣膜病等。正常对照20名。对1例发现有mtDNA点突变的患者进行家系调查，其母亲、姐姐、次子分别于32岁、20岁、15岁猝死，长子健在，表型正常。
1.2 DNA提取 常规苯酚/氯仿法提取患者外周血淋巴细胞的基因组DNA(内含mtDNA)。
1.3 PCR扩增 采用Perkin/Cerus公司的热循环仪进行扩增，所用的1对引物由中国科学院上海细胞生物研究所合成：引物序列为：L链(11641-11660)：5′-AGCCCTCGTACTAA-CAGCCA-3′；H链：(11981-11961)5′-GGAGTATAGGGCTG-TTGACTA-3′。扩增的这段特异的mtDNA由NADH脱氢酶亚单位4(ND4)所编码。
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1.4 PCR-SSCP 采用非变性聚丙烯酰胺凝胶法检测。
1.5 PCR产物纯化 采用High Pure PCR Product Purification药盒(Boehringer Mannheim)进行纯化。
1.6 序列分析 按常规双脱氧末端终止法进行测序，试剂为Silver SequenceTM DNA Sequencing System(Promege公司)。
2 结果
2.1 PCR-SSCP结果分析 在HCM患者及正常对照个体外周血mtDNA COI ND4功能区，有1例患者的电泳带异常。对患者丈夫及长子的外周血进行筛查，发现患者与其长子呈现相同异常的电泳带，而丈夫电泳带与正常对照相同。
, 百拇医药 2.2 序列分析 患者及其长子均发现有两个位点的突变，分别位于mtDNA H链第11856、11892位点，T均突变为G，相应于L链A突变为C，分别导致天冬酰胺变为苏氨酸，谷氨酸变成丙氨酸。这两个位点的突变均为杂合型，即同一标本除存在突变的mtDNA外，在相应位置同时有正常的mtDNA。
3 讨论
mtDNA在氧化磷酸化(OXPHOS)的组装过程中起重要作用，OXPHOS由5种酶复合物组成(复合物I-V)，其中13条与复合物相关的肽腱亚单位由mtDNA编码，mtDNA各基因排列紧密，几乎不含内含子序列，mtDNA上发生的任何突变都会累及到基因组中的重要功能区，从而影响OXPHOS过程，使ATP产生下降。心肌组织在能量不足的情况下，会发生退行性改变及代偿性肥厚增生等病理变化，从而导致疾病的发生。
HCM患者外周血mtDNA H链11856、11892位点T突变为G，相应于L链A突变为C，分别使ND4功能区第366位密码子AAC(天冬酰胺，Asn)变成ACC(苏氨酸，Thr)，第378位密码子GAA(谷氨酸，Glu)，变成GCA(丙氨酸，Ala)。天冬酰胺和谷氨酸在线虫→果蝇→海胆→非洲蟾蜍→鸡→鲸→牛→人基因种系进化中均为高度保守的[7]。
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这两个位点的突变均位于mtDNA编码的复合物Ⅰ(COⅠ)，COⅠ由ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6 7个亚单位组成，它是电子传递链的起点，将线粒体外的电子传递到线粒体内，再经COⅢ、COⅣ传递给O2，通过OXPHOS机理驱动ATP的合成。因此，mtDNA ND4功能区11856、11892位点的碱基置换造成保守氨基酸的改变，必然导致COⅠ的功能缺陷，影响OXPHOS。本实验中mtDNA取自患者的外周血细胞，而研究表明，血细胞中的mtDNA突变数量低于成纤维细胞、肌肉细胞、上皮细胞等，即心肌细胞积累了更多的突变mtDNA。
mtDNA遗传学特征之一是母系遗传。对该患者进行家系探查，发现其母亲、姐姐、次子均在青壮年猝死。长子健在，经检查与患者存在相同的突变，而患者丈夫是正常的。家系分析显示，呈母系遗传倾向。我们推测患者的母亲、姐姐、次子亦为HCM患者，他们可能都存在mtDNA突变。
, 百拇医药
与核基因的传递方式不同，mtDNA除按母系遗传外，其突变与表型的关系常与mtDNA中突变型与野生型所占的比例有关，即突变型比例达到一定时发病，称为阈值效应。患者长子表型虽正常，但我们发现其mtDNA也存在上述两位点的突变，可能与突变型mtDNA比例未达到阈值有关。
本实验仅涉及COⅠ ND4功能区，mtDNA上可能还存在其他的突变位点，有待于进一步研究证实。
基金项目：江苏省卫生厅基金项目(H9512)
参考文献
[1]Mckenna WJ, Camm AJ. Sudden death in hypertrophic cardiomyopathy:assessment of patients at high risk. Circulation, 1989,80∶1489-1492., 百拇医药