一个耐热碱性磷酸酯酶突变型的研究
作者：袁有忠 赵思汇 周宗祥 季朝能 盛小禹 毛裕民
单位：复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室，上海 200433
关键词：耐热碱性磷酸酯酶；随机诱变；氨基酸置换
遗传学报000412
摘要：为了进一步揭示蛋白质的耐热机制，对含有耐热碱性磷酸酯酶(FD-TAP)的表达质粒pTAP503F进行了随机诱变，用菌落原位显色法从约5000个转化子中筛选到4个耐热性下降的突变型克隆，并对其中1个克隆(TAPM3)进行了部分酶学性质、DNA和氨基酸序列的研究。酶学性质研究表明，与野生型相比，该突变型酶的耐热性有较大幅度的下降，而热激活性无明显改变。DNA序列分析表明在1 239位TAPM3发生GA转换，导致427位的甘氨酸变为丝氨酸(G427S)，这种突变对酶的耐热性、米氏常数、活化能影响较为明显。这说明只须1个氨基酸置换就会对蛋白质耐热性变化起巨大作用，并且氨基酸残基侧链的大小、电荷等能使蛋白质结构松散的性质，会导致蛋白质耐热性下降。
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中图分类号：Q319 文献标识码：A 文章编号：0379-172(2000)04-361-368
A Study of a Mutant of Thermostable Alkaline Phosphatase
YUAN You-Zhong, ZHAO Si-Hui, ZHOU Zong-Xiang,JI Chao-Neng, SHENG Xiao-Yu, MAO Yu-Min
(Institute of Genetics, State Key Laboratory of Genetic Engineering, Fudan University, Shanghai 200433, China)
Abstract: To reveal the mechanism of protein thermostability, we used in vivo random mutagenesis to generate variants of pTAP503F which contained thermostable alkaline phosphatase (FD-TAP). After screening about 5 000 clones, we obtained 4 temperature-sensitive mutants. The study of enzymatic properties of one mutant (TAPM3) showed that the thermostability of the mutant enzyme descended a lot, compared to the wild type, while the thermoactivity remained stable. DNA sequencing showed that the G-A transition in position 1239 resulted in the substitution from glysine to serine in position 427. This mutation conspicuously affected thermostability, Michaelis constant and energy of activation. This suggests that only one substitution of amino acid will make great changes in thermostability and other properties, meanwhile, side-chain size, charge of residues and so on, which loosen the structure of protein, will result in the descent of thermostability.
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Key words: thermostable alkaline phosphatase; random mutagenesis; substitution of amino acid
近几年，来自嗜热细菌的耐热蛋白酶的研究吸引了众多研究者，这主要基于以下两个原因：一是这些工作将有助于人们对蛋白质耐热机制的了解，从而为蛋白质的改造奠定良好基础；二是耐热蛋白酶的许多理化性质，尤其是在极端条件下所具有的生物活性，在各种生物技术过程中有着广泛的应用前景。
目前蛋白质耐热性的研究方法主要有两种，一是对来源于嗜温和嗜热细菌同源蛋白进行一级和高级结构的比较，如Merkler提出蛋白质疏水性指数，Ikai提出脂肪族氨基酸指数[1]等。但由于没有考虑二、三级结构因素，这些分析结果的意义比较局限；二是应用蛋白质工程如氨基酸定点或随机突变及基因拼接技术探讨哪些氨基酸的置换或亚结构的相互作用与蛋白质耐热性有关，从而找出一些基本规律。当前国际上主要采用的突变方法是定点突变，其缺点是一方面该法对具有三维结构数据的酶更有用，另一方面由于酶分子可改变的位置很多，限于力量一般只能在少数位置进行研究。 而随机诱变一次可产生大量不同的突变体，在筛选到足够多突变体的情况下可能提供更多信息。更重要的是随机诱变的不确定性使突变的种类很多，这就有可能不局限于前人的经验而发现一些新规律。目前对耐热蛋白随机诱变后进行大规模研究的报道还较少见。
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本室已从1株栖热菌(Thermus sp. FD3041)中克隆了其耐热碱性磷酸酯酶(Thermo-stable alkaline phosphatase，简称FD-TAP)基因，测定了该基因的序列并构建了能在E. coli中表达的质粒[2～5]。它产生的FD-TAP在95℃保温60min后仍保留75%的活力，同时由于检测碱性磷酸酯酶活性方法简便，因此是研究蛋白质耐热性的极好材料。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 E. coli TG1 {supE hsd5 thi D(lac杙roAB) F [traD36 proAB+ lacIq lacZDM15]}, E.coli Mph44{F′[araD139 Τ(ara杔eu)7697 Τlac-4 galU galK rpsL Τ(phoA杙roC) phoR tsxTn5]}为本室保存。克隆有FD-TAP基因的表达质粒pTAP503F为本室构建。
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1.1.2 培养基 LB固、液体培养基，2×YT液体培养基：1.6%蛋白胨，1%酵母粉，0.5%氯化钠，pH7.0。
1.1.3 试剂 聚乙烯亚胺(PEI)，核酸结合剂，用于沉淀核酸和蛋白。CM-Sepharose FastFlow及Wizard plus mini preparation Kit购自Pharmacia Biotech公司，对硝基苯磷酸盐(pNPP)购自Merck公司，亚硝基胍(MNNG)购自Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA样品制备 质粒双链DNA小批量快速制备按文献[6]进行，大量制备时在此基础上以13%(W/V)PEG-000，1.6mol/L NaCl沉淀。
1.2.2 随机诱变方法 按Kironde的方法[7]略加改进。表达质粒pTAP503F转化E.coliITG后，30℃培养过夜。过夜菌按1100接种至200ml含Amp的LB中30℃培养至OD＝0.6，收集菌体悬浮于6ml磷酸缓冲液(100mmol/L，pH6.0)中。1ml菌液作对照，另5ml加入MNNG(先用甲酰胺溶解)至终浓度为100g/ml，30℃轻摇温育，于7.5、15、30、60和120min各取出1ml，分别用10ml磷酸缓冲液洗3次，加入到200ml LB中培养2.5h，离心收集菌体，抽提质粒备用。
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1.2.3 突变型的筛选 用菌落原位显色法筛选，参见文献[2]。
1.2.4 FD-TAP蛋白的分离纯化 (1)细胞破碎及酶的初步处理：将10g湿菌体悬浮于100ml 50mmol/L Tris-HCl、 pH8.8、5%甘油缓冲液中，冰浴中超声破碎，离心后加入PEI去除核酸， 再经离心后上清中逐步加入固体硫酸铵达60%饱和度， 0℃搅拌1h。沉淀用1/8体积的Buffer A[10mmol/L K2HPO4-H2PO4 (pH6.5), 5%甘油]溶解，4℃下对相同的缓冲液透析除盐。(2)CM-Sepharose Fast Flow柱层析：经透析除盐后的蛋白上CM-Sepharose Fast Flow柱，用NaCl(0～800mmol/L)进行线性梯度洗脱，分管收集酶活峰，SDS-PAGE电泳分析蛋白质的纯度后合并纯蛋白，用Buffer A透析，4℃保存备用。
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1.2.5 SDS-PAGE电泳 选用Laemmli的高pH不连续缓冲体系，分离胶浓度8%，浓缩胶浓度为5%。
1.2.6 耐热碱性磷酸酯酶的活性测定 参见文献[2]。
1.2.7 热稳定性测定 等量的待测酶液在不同的温度保温10min后，置于冰上10min，在70℃测定残留酶活。
1.2.8 最适温度测定 等量的反应缓冲液先在不同的温度保温10min，然后按耐热碱性磷酸酯酶的活性测定方法于不同温度测定酶活。
2 结果
2.1突变型的筛选和鉴定
通过前述原位显色的方法，我们从约5 000个经诱变的E. coli TG1/pTAP503F菌落中初步筛选到25个无色菌落，抽提质粒后转化E. coli Mph44，将菌落直接于65℃显色，结果有13个菌落不显黄色，在25℃下仍测不出任何活性，表明是FD-TAP完全失活或不能表达的突变型。 其余12个菌株分别接种于20ml 2×YT中，30℃培养2～3h后于42℃诱导培养10h，收集菌体，用50mmol/L Tris-HCl (pH8.8)悬浮后超声破菌后离心取上清。将这些粗酶液分别于80、85、90、95℃保温10min，在65℃测定剩余酶活力，有8个菌株酶活力的变化与野生型相同。这些菌株有两种可能：一是突变导致了酶的表达量下降或酶的比活下降而产生的假阳性；二是突变型酶在高温下对SDS的耐受性下降，因为在破菌缓冲液中含有SDS。 最终我们确定的温度敏感突变型为4个，记为“TAPM1～4”。
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2.2 突变型酶的分离纯化
含有突变TAP质粒的大肠杆菌Mph44发酵后，按材料和方法1.2.4处理，经过细胞破碎，酶的初步分离，CM-Sepharose Fast Flow柱层析和透析等步骤，得到高纯度的突变耐热碱性磷酸酯酶(图1)，4℃保存备用。
图1 TAPM3突变型酶的SDS-PAGE电泳图谱
A.破菌液;B.PEI沉淀;C.(NH4)2SO4沉淀;D.柱层析;E.分子量标记
Fig.1 SDS-PAGE of mutant TAPM3
A.Crude extract;B.PEI treatment;C.(NH4)2SO4 treatment ;D.Column chromography;E.Molecular weight marker
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2.3 突变型酶部分酶学性质的研究
2.3.1 TAPM3突变型的耐热性 将纯化的酶稀释于50mmol/L的Tris-HCl(pH8.8)缓冲液中，在50℃～100℃范围内的不同温度下保温30min后取出，冰水浴30min后70℃测定剩余的酶活力，结果表明，与重组FD-TAP的热稳定性相差很大(图2)，重组FD-TAP的T1/2为95℃，而TAPM3突变型酶的T1/2为83℃。
图2 TAPM3突变型的耐热性
Fig.2 Thermostability of mutant TAPM3
2.3.2 TAPM3突变型的热激活性 在20℃～95℃的温度范围内测定酶活力。图3表明TAPM3突变型的FD-TAP仍有很高的热激活性，最适反应温度约70℃，与野生型酶的热激活性相近似，其余实验均在70℃中进行。
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图3 TAPM3突变型的热激活性
Fig.3 Thermoactivity of mutant TAPM3
2.3.3 pH值对酶活的影响 根据野生型FD-TAP酶性质，1mol/L二乙醇胺系统为最佳反应系统，利用HCl及NaOH调节pH值，在pH10.1～13.0范围内，在不同pH值的二乙醇胺系统中测定酶活(图4)。结果表明最适pH值为12.0，与野生型TAP的最适pH(野生型TAP最适pH为11.6)相比没有明显的变化。
图4 PH值对TAPM3突变型酶活的影响
Fig.4 Effect of PH on the activity of mutant TAPM3
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2.3.4 米氏常数(Km)及转换率(Kcat) 米氏常数的测定以pNPP为底物进行，精确配制不同浓度的pNPP(在1mol/L二乙醇胺pH12.0)的反应体系，加等量酶(8μg/ml)，70℃反应10min。在波长405nm处测定各体系的OD值，按对硝基酚在1mol/L二乙醇胺反应体系中在波长405nm的克分子消光系数为18.8×106/mol，计算各体系底物浓度[S]及对应的反应速度V和相应的1/[S]、1/V。根据1/V＝(1/[S])·(Km/Vmax)+1/Vmax，用Lineweaver朆urk作图法计算出Km值为2.3×10-4mol/L及Vmax值为6.8×10-6molL-1S-1。再根据公式Vmax＝Kcat·[E0] ，其中酶的分子量根据测序结果推出的氨基酸数(野生型TAP共由501个氨基酸残基组成)及氨基酸质量的加权平均值(126.7)来计算，从而得出Kcat为5.4×104S-1，而野生型TAP相应的Km及Kcat值分别为1.4×10-4mol/L和1.7×105S-1，这表明TAPM3酶与底物结合能力和催化能力都降低了(图5)。
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图5 TAPM3突变型米氏常数的测定
Fig.5 Michealis constant of mutant TAPM3
2.3.5活化能在图3中的曲线上选取25℃～45℃的5个点，根据LnK1-LnK2＝E·(1/T1-1/T2)/R，R＝1.98卡/摩尔/度，用Arrhenius作图法计算出活化能约为8.10kcal/mol，野生型酶的活化能约为8.60kcal/mol，变化较为明显(图6)。
图6 TAPM3突变型活化能的测定
Fig.6 Acitvation energy of mutant TAPM3
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2.4 TAPM3(Ts3)突变型的DNA序列分析及性质研究
根据pJAL503多克隆位点附近的DNA序列和FD-TAP基因的序列分别设计合成8个引物，并选取突变型TAPM3对其全基因进行了序列分析，与野生型FD-TAP的DNA序列进行比较[3]，发现存在1个点突变，突变发生在DNA序列的1 279位，由鸟嘌呤(G)转换为腺嘌呤(A)，在基因序列中由原来编码427位的甘氨酸(—GGC—)突变为编码丝氨酸(—AGC—)。
3 讨论
3.1 耐热性(Thermostability)与热激活性(Thermoac杢ivity)
耐热性也称热稳定性，是指蛋白质高级结构耐受温度变性的程度。蛋白质在一定的温度范围内随着温度的升高活性逐渐下降，超过这一范围则活性丧失，这是1个蛋白质从折叠状态向非折叠状态逐渐转变的过程。通常用在某一温度下蛋白质变性后再在最适温度测定活性半衰期表示，文献中常用T1/2或者Tm表示。 热激活性也称亲热性，是指蛋白质的活性受温度激活的特性，通常用最适反应温度Topt表示。酶在达到一定的温度时才具有最大的活力，这与活性中心的构型变化受温度的影响有关。但热激活性也受到温度对蛋白质变性的影响，当温度对蛋白质的激活和变性达到平衡时，也就是最适反应温度。耐热性和热激活性既有联系也有区别，最适反应温度综合反映了温度对活性中心的影响和蛋白质整体结构稳定性的影响。虽然最适反应温度不是酶的特征物理常数，因为它与温度的作用时间有关，作用时间长失活多，所以不是一固定值，但在酶作用时间一定的前提下，就能表征温度对酶活性的影响程度。
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大多数蛋白质的耐热性和热激活性是一致的，即耐热性高热激活性也高，但也有蛋白质的耐热性和热激活性不一致，比如RNA酶，其最适反应温度是37℃，但可耐受100℃的高温。热激活性和耐热性的这种差别反映了两者可能在蛋白质结构中受不同的结构域的影响。本实验中，TAPM3的耐热性明显下降，而热激活性没有变化，这验证了以上观点。
3.2 氨基酸置换对蛋白质耐热性的影响
与野生型FD-TAP相比，TAPM3突变型酶的大部分性质没有发生太大变化，只有耐热性、米氏常数、活化能这3个性质有较明显的变化。从其一级结构来看，427位的甘氨酸变为了丝氨酸，甘氨酸没有不对称碳原子，它的R基为一个氢原子，介于极性与非极性氨基酸之间，正是由于它的侧链简单，在构象上几乎没有任何空间障碍，可以缓和由于肽链弯曲造成的残基侧链间的相互作用。而丝氨酸的R基极性明显高于甘氨酸，再由于它的ρ-碳原子的构象变化，在形成氢键上有各种可能性，因此突变后，丝氢酸改变了FD-TAP结构上的紧密，使酶变得松散，降低了疏水作用，使酶分子内部基团裸露出来，大量的分子内部相互作用丧失，结果导致酶的耐热性下降。
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从活化能的角度看，根据Arrhenius经验式，野生型FD-TAP的活化能为8.60kcal/mol，而TAPM3的活化能仅为8.10kcal/mol，相差约0.5kcal/mol，这个差别说明分子内部相互作用的丧失，使得酶分子只需获得更少的能量就能转入瞬时的活化状态，进行催化反应。从米氏常数比较来看，突变型酶的Km值由1.4×10-4mol/L升为2.3×10-4mol/L，这种变化说明突变后酶结构的打开使酶的活性中心的Ser102“袋”部位与底物间的相互作用减少，亲和力变弱，形成的E·P络合物变得不稳定，容易解离，而Kcat的变化也从另一角度说明了这个问题，Kcat由1.7×105S-1降为5.4×104S-1，说明每个酶分子在单位时间内使pNPP分解为对硝基苯酚的分子数减少了。
, 百拇医药 近年来的研究表明，耐热酶与不耐热酶之间自由能的差异往往只有50kJ/mol，这只相当于几个氢键的能量[8]，也就是说蛋白质耐热性的改变仅与微小的结构改变有关，因此某个关键部位的氨基酸改变将引起蛋白质性质的极大改变。1989年，Menendez朅rias和Argo分析了6个蛋白质家族中70个耐热与不耐热蛋白质的序列，提出只有位于表面的α-螺旋区或结构域界面的氨基酸替代蛋白质柔韧性直降和增加疏水性与蛋白质耐热性增加有关.并提出了位于该区10种常见的氨基酸替代(“Top 10”规则，表1)[9]。这10种常见的氨基酸置换中有几种后来在不少耐热蛋白质中得到了支持[10,11]。
表1 不耐热和耐热蛋白之间10种最常见的氨基酸替换
Table 1 Ordinary substiution amino acid between thermostable and themosensitive protein 不耐热→耐热
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Thermosensitive→
Thermostable
置换区域
Region of
substiution
置换效应 Effect of substitution
疏水性
Hydrophobility
柔韧性 Accessibility
0
1
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2
Lys→Arg
螺旋 helix
+
-
-
-
Ser→Ala
螺旋 helix
+
-
-
-
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Gly→Ala
螺旋和折叠
+
-
-
-
helix & turn
Ser→Thr
折叠和线圈
+
-
+
+
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helix & loop
Ile→Val
螺旋 helix
-
-
+
+
Lys→Ala
螺旋和折叠
+
-
-
-
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helix & loop
Thr→Ala
折叠 turn
+
-
-
-
Lys→Glu
线圈 loop
+
+
-
-
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Glu→Arg
螺旋 helix
+
-
-
-
Asp→Arg
螺旋 helix
+
+
-
-
注(Note):0、1、2表示氨基酸周围的刚性指数 0、1、2 represent rigidity index around amino acid residue
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本实验中TAPM3的Gly(耐热)→Ser(不耐热)的替换虽然在Argo的“Top 10”规则中未曾出现，但二者并不矛盾。目前多数人认为，在耐热蛋白质中氨基酸残基的替代倾向于：(1)外周离子键增加；(2)使蛋白质的疏水性增进或表面亲水性减少；(3)使蛋白质核心致密度增加。
值得注意的是，TAPM3的突变位点位于两个金属离子结合位点His318和His433之间110多个氨基酸序列内，与细菌碱性磷酸酯酶比较，FD-TAP在这一区域多了73个氨基酸，在哺乳类的碱性磷酸酯酶中这一区域也有30多个氨基酸插入[12]，构成1个表面环区的结构域。对人的碱性磷酸酯酶研究表明，该结构域不直接参与酶的催化活性，但与酶的某些理化性质尤其是耐热性直接相关。将哺乳动物的组织非特异性碱性磷酸酯酶(TNAP)的这一结构域拼接到胎盘碱性磷酸酯酶(PLAP)的同一位置，导致了PLAP的耐热性明显下降，在56℃的T1/2由12h下降到8min，而在该结构域内两者只有9个氨基酸的差别[13]。PLAP与精细胞碱性磷酸酯酶(GCAP)在这结构域内只有一个氨基酸的差别，前者为Gly，后者为Glu，将PLAP的Gly替换为Glu，也引起耐热性下降至接近于GCAP的水平[14]。由此可以推测，FD-TAP的这一结构域也可能是决定其耐热性的重要部位之一。
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参考文献
[1] Ikai A. Thermostability and aliphatic index of globular proteins. J. Biochem., 1980, 88:1895～1898.
[2] 盛小禹，王 曦，高静波等. 嗜热细菌碱性磷酸酯酶的研究. 生物化学杂志，1997，13(6)：672～675.
[3] 袁有忠，盛小禹，吕鸿雁等. 耐热碱性磷酸酯酶的基因克隆及在大肠杆菌中的表达. 遗传学报，1998，25(4)：375～380.
[4] 袁有忠，季朝能等. 耐热碱性磷酸酯酶基因的DNA序列分析. 复旦学报，1998，37(4)：513～517.
[5] 袁有忠，佟 石，吕鸿雁等. 耐热碱性磷酸酯酶基因的亚克隆及在大肠杆菌中的表达. 复旦学报，1998，37(2)：146～150.
, http://www.100md.com
[6] J萨姆布鲁克，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南(第二版). 北京：科学出版社，1995.
[7] Kironde F A, Parsonage D, Senior A. Random mutagenesis of the gene for the B-subunit of F1-ATPase from Escherichia coli. Biochem. J., 1989, 259:421～426.
[8] Jaenicke R. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Thermotoga maritima: Strategies of protein stabilization. FEMS Microbiol. Rev., 1996, 18:215～224.
[9]Menendez-Arias L, Argo P. Engineering protein thermal stability. Sequence statistics pont to residue substitutions in π-Helices. J. Mol. Biol., 1989, 206:397～406.
, 百拇医药
[10]Borders C L, Broadwater J A, Bekeny P A, Salmon J E. A structural role for arginine in proteins: multiple hydrogen bonds to backbone carbonyl oxygen. Protein Sci., 1994, 3:541～548.
[11]White P J, Squirrell D J. Improved thermostability of the North American firefly luciferase: satruation mutagenesis at position 354. Biochem. J., 1996, 319(Pt 2):343～350.
[12]Kim E E, Wyckoff H W, Structure of alkaline phosphatase. Clin. Chim. Acta., 1990, 186:175～187.
, 百拇医药
[13]Bossi M, Hoylaerts M F, Milan J L, Modifications in a flexible surface loop modulate the isozyme-specificproperties of mammalian alkaline phosphatase. J. Bio. Chem., 1993, 268:25049～25416.
[14]Watanabe T, Wada N, Kim E E. Mutation of a single amino acid converts germ cell alkaline phosphatase to placental phosphatase. J. Biol. Chem., 1991, 266:21174～21178., 百拇医药
单位：复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室，上海 200433
关键词：耐热碱性磷酸酯酶；随机诱变；氨基酸置换
遗传学报000412
摘要：为了进一步揭示蛋白质的耐热机制，对含有耐热碱性磷酸酯酶(FD-TAP)的表达质粒pTAP503F进行了随机诱变，用菌落原位显色法从约5000个转化子中筛选到4个耐热性下降的突变型克隆，并对其中1个克隆(TAPM3)进行了部分酶学性质、DNA和氨基酸序列的研究。酶学性质研究表明，与野生型相比，该突变型酶的耐热性有较大幅度的下降，而热激活性无明显改变。DNA序列分析表明在1 239位TAPM3发生GA转换，导致427位的甘氨酸变为丝氨酸(G427S)，这种突变对酶的耐热性、米氏常数、活化能影响较为明显。这说明只须1个氨基酸置换就会对蛋白质耐热性变化起巨大作用，并且氨基酸残基侧链的大小、电荷等能使蛋白质结构松散的性质，会导致蛋白质耐热性下降。
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YUAN You-Zhong, ZHAO Si-Hui, ZHOU Zong-Xiang,JI Chao-Neng, SHENG Xiao-Yu, MAO Yu-Min
(Institute of Genetics, State Key Laboratory of Genetic Engineering, Fudan University, Shanghai 200433, China)
Abstract: To reveal the mechanism of protein thermostability, we used in vivo random mutagenesis to generate variants of pTAP503F which contained thermostable alkaline phosphatase (FD-TAP). After screening about 5 000 clones, we obtained 4 temperature-sensitive mutants. The study of enzymatic properties of one mutant (TAPM3) showed that the thermostability of the mutant enzyme descended a lot, compared to the wild type, while the thermoactivity remained stable. DNA sequencing showed that the G-A transition in position 1239 resulted in the substitution from glysine to serine in position 427. This mutation conspicuously affected thermostability, Michaelis constant and energy of activation. This suggests that only one substitution of amino acid will make great changes in thermostability and other properties, meanwhile, side-chain size, charge of residues and so on, which loosen the structure of protein, will result in the descent of thermostability.
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近几年，来自嗜热细菌的耐热蛋白酶的研究吸引了众多研究者，这主要基于以下两个原因：一是这些工作将有助于人们对蛋白质耐热机制的了解，从而为蛋白质的改造奠定良好基础；二是耐热蛋白酶的许多理化性质，尤其是在极端条件下所具有的生物活性，在各种生物技术过程中有着广泛的应用前景。
目前蛋白质耐热性的研究方法主要有两种，一是对来源于嗜温和嗜热细菌同源蛋白进行一级和高级结构的比较，如Merkler提出蛋白质疏水性指数，Ikai提出脂肪族氨基酸指数[1]等。但由于没有考虑二、三级结构因素，这些分析结果的意义比较局限；二是应用蛋白质工程如氨基酸定点或随机突变及基因拼接技术探讨哪些氨基酸的置换或亚结构的相互作用与蛋白质耐热性有关，从而找出一些基本规律。当前国际上主要采用的突变方法是定点突变，其缺点是一方面该法对具有三维结构数据的酶更有用，另一方面由于酶分子可改变的位置很多，限于力量一般只能在少数位置进行研究。 而随机诱变一次可产生大量不同的突变体，在筛选到足够多突变体的情况下可能提供更多信息。更重要的是随机诱变的不确定性使突变的种类很多，这就有可能不局限于前人的经验而发现一些新规律。目前对耐热蛋白随机诱变后进行大规模研究的报道还较少见。
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本室已从1株栖热菌(Thermus sp. FD3041)中克隆了其耐热碱性磷酸酯酶(Thermo-stable alkaline phosphatase，简称FD-TAP)基因，测定了该基因的序列并构建了能在E. coli中表达的质粒[2～5]。它产生的FD-TAP在95℃保温60min后仍保留75%的活力，同时由于检测碱性磷酸酯酶活性方法简便，因此是研究蛋白质耐热性的极好材料。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 E. coli TG1 {supE hsd5 thi D(lac杙roAB) F [traD36 proAB+ lacIq lacZDM15]}, E.coli Mph44{F′[araD139 Τ(ara杔eu)7697 Τlac-4 galU galK rpsL Τ(phoA杙roC) phoR tsxTn5]}为本室保存。克隆有FD-TAP基因的表达质粒pTAP503F为本室构建。
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1.1.3 试剂 聚乙烯亚胺(PEI)，核酸结合剂，用于沉淀核酸和蛋白。CM-Sepharose FastFlow及Wizard plus mini preparation Kit购自Pharmacia Biotech公司，对硝基苯磷酸盐(pNPP)购自Merck公司，亚硝基胍(MNNG)购自Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA样品制备 质粒双链DNA小批量快速制备按文献[6]进行，大量制备时在此基础上以13%(W/V)PEG-000，1.6mol/L NaCl沉淀。
1.2.2 随机诱变方法 按Kironde的方法[7]略加改进。表达质粒pTAP503F转化E.coliITG后，30℃培养过夜。过夜菌按1100接种至200ml含Amp的LB中30℃培养至OD＝0.6，收集菌体悬浮于6ml磷酸缓冲液(100mmol/L，pH6.0)中。1ml菌液作对照，另5ml加入MNNG(先用甲酰胺溶解)至终浓度为100g/ml，30℃轻摇温育，于7.5、15、30、60和120min各取出1ml，分别用10ml磷酸缓冲液洗3次，加入到200ml LB中培养2.5h，离心收集菌体，抽提质粒备用。
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1.2.3 突变型的筛选 用菌落原位显色法筛选，参见文献[2]。
1.2.4 FD-TAP蛋白的分离纯化 (1)细胞破碎及酶的初步处理：将10g湿菌体悬浮于100ml 50mmol/L Tris-HCl、 pH8.8、5%甘油缓冲液中，冰浴中超声破碎，离心后加入PEI去除核酸， 再经离心后上清中逐步加入固体硫酸铵达60%饱和度， 0℃搅拌1h。沉淀用1/8体积的Buffer A[10mmol/L K2HPO4-H2PO4 (pH6.5), 5%甘油]溶解，4℃下对相同的缓冲液透析除盐。(2)CM-Sepharose Fast Flow柱层析：经透析除盐后的蛋白上CM-Sepharose Fast Flow柱，用NaCl(0～800mmol/L)进行线性梯度洗脱，分管收集酶活峰，SDS-PAGE电泳分析蛋白质的纯度后合并纯蛋白，用Buffer A透析，4℃保存备用。
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1.2.5 SDS-PAGE电泳 选用Laemmli的高pH不连续缓冲体系，分离胶浓度8%，浓缩胶浓度为5%。
1.2.6 耐热碱性磷酸酯酶的活性测定 参见文献[2]。
1.2.7 热稳定性测定 等量的待测酶液在不同的温度保温10min后，置于冰上10min，在70℃测定残留酶活。
1.2.8 最适温度测定 等量的反应缓冲液先在不同的温度保温10min，然后按耐热碱性磷酸酯酶的活性测定方法于不同温度测定酶活。
2 结果
2.1突变型的筛选和鉴定
通过前述原位显色的方法，我们从约5 000个经诱变的E. coli TG1/pTAP503F菌落中初步筛选到25个无色菌落，抽提质粒后转化E. coli Mph44，将菌落直接于65℃显色，结果有13个菌落不显黄色，在25℃下仍测不出任何活性，表明是FD-TAP完全失活或不能表达的突变型。 其余12个菌株分别接种于20ml 2×YT中，30℃培养2～3h后于42℃诱导培养10h，收集菌体，用50mmol/L Tris-HCl (pH8.8)悬浮后超声破菌后离心取上清。将这些粗酶液分别于80、85、90、95℃保温10min，在65℃测定剩余酶活力，有8个菌株酶活力的变化与野生型相同。这些菌株有两种可能：一是突变导致了酶的表达量下降或酶的比活下降而产生的假阳性；二是突变型酶在高温下对SDS的耐受性下降，因为在破菌缓冲液中含有SDS。 最终我们确定的温度敏感突变型为4个，记为“TAPM1～4”。
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2.2 突变型酶的分离纯化
含有突变TAP质粒的大肠杆菌Mph44发酵后，按材料和方法1.2.4处理，经过细胞破碎，酶的初步分离，CM-Sepharose Fast Flow柱层析和透析等步骤，得到高纯度的突变耐热碱性磷酸酯酶(图1)，4℃保存备用。
图1 TAPM3突变型酶的SDS-PAGE电泳图谱
A.破菌液;B.PEI沉淀;C.(NH4)2SO4沉淀;D.柱层析;E.分子量标记
Fig.1 SDS-PAGE of mutant TAPM3
A.Crude extract;B.PEI treatment;C.(NH4)2SO4 treatment ;D.Column chromography;E.Molecular weight marker
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2.3 突变型酶部分酶学性质的研究
2.3.1 TAPM3突变型的耐热性 将纯化的酶稀释于50mmol/L的Tris-HCl(pH8.8)缓冲液中，在50℃～100℃范围内的不同温度下保温30min后取出，冰水浴30min后70℃测定剩余的酶活力，结果表明，与重组FD-TAP的热稳定性相差很大(图2)，重组FD-TAP的T1/2为95℃，而TAPM3突变型酶的T1/2为83℃。
图2 TAPM3突变型的耐热性
Fig.2 Thermostability of mutant TAPM3
2.3.2 TAPM3突变型的热激活性 在20℃～95℃的温度范围内测定酶活力。图3表明TAPM3突变型的FD-TAP仍有很高的热激活性，最适反应温度约70℃，与野生型酶的热激活性相近似，其余实验均在70℃中进行。
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图3 TAPM3突变型的热激活性
Fig.3 Thermoactivity of mutant TAPM3
2.3.3 pH值对酶活的影响 根据野生型FD-TAP酶性质，1mol/L二乙醇胺系统为最佳反应系统，利用HCl及NaOH调节pH值，在pH10.1～13.0范围内，在不同pH值的二乙醇胺系统中测定酶活(图4)。结果表明最适pH值为12.0，与野生型TAP的最适pH(野生型TAP最适pH为11.6)相比没有明显的变化。
图4 PH值对TAPM3突变型酶活的影响
Fig.4 Effect of PH on the activity of mutant TAPM3
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2.3.4 米氏常数(Km)及转换率(Kcat) 米氏常数的测定以pNPP为底物进行，精确配制不同浓度的pNPP(在1mol/L二乙醇胺pH12.0)的反应体系，加等量酶(8μg/ml)，70℃反应10min。在波长405nm处测定各体系的OD值，按对硝基酚在1mol/L二乙醇胺反应体系中在波长405nm的克分子消光系数为18.8×106/mol，计算各体系底物浓度[S]及对应的反应速度V和相应的1/[S]、1/V。根据1/V＝(1/[S])·(Km/Vmax)+1/Vmax，用Lineweaver朆urk作图法计算出Km值为2.3×10-4mol/L及Vmax值为6.8×10-6molL-1S-1。再根据公式Vmax＝Kcat·[E0] ，其中酶的分子量根据测序结果推出的氨基酸数(野生型TAP共由501个氨基酸残基组成)及氨基酸质量的加权平均值(126.7)来计算，从而得出Kcat为5.4×104S-1，而野生型TAP相应的Km及Kcat值分别为1.4×10-4mol/L和1.7×105S-1，这表明TAPM3酶与底物结合能力和催化能力都降低了(图5)。
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图5 TAPM3突变型米氏常数的测定
Fig.5 Michealis constant of mutant TAPM3
2.3.5活化能在图3中的曲线上选取25℃～45℃的5个点，根据LnK1-LnK2＝E·(1/T1-1/T2)/R，R＝1.98卡/摩尔/度，用Arrhenius作图法计算出活化能约为8.10kcal/mol，野生型酶的活化能约为8.60kcal/mol，变化较为明显(图6)。
图6 TAPM3突变型活化能的测定
Fig.6 Acitvation energy of mutant TAPM3
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2.4 TAPM3(Ts3)突变型的DNA序列分析及性质研究
根据pJAL503多克隆位点附近的DNA序列和FD-TAP基因的序列分别设计合成8个引物，并选取突变型TAPM3对其全基因进行了序列分析，与野生型FD-TAP的DNA序列进行比较[3]，发现存在1个点突变，突变发生在DNA序列的1 279位，由鸟嘌呤(G)转换为腺嘌呤(A)，在基因序列中由原来编码427位的甘氨酸(—GGC—)突变为编码丝氨酸(—AGC—)。
3 讨论
3.1 耐热性(Thermostability)与热激活性(Thermoac杢ivity)
耐热性也称热稳定性，是指蛋白质高级结构耐受温度变性的程度。蛋白质在一定的温度范围内随着温度的升高活性逐渐下降，超过这一范围则活性丧失，这是1个蛋白质从折叠状态向非折叠状态逐渐转变的过程。通常用在某一温度下蛋白质变性后再在最适温度测定活性半衰期表示，文献中常用T1/2或者Tm表示。 热激活性也称亲热性，是指蛋白质的活性受温度激活的特性，通常用最适反应温度Topt表示。酶在达到一定的温度时才具有最大的活力，这与活性中心的构型变化受温度的影响有关。但热激活性也受到温度对蛋白质变性的影响，当温度对蛋白质的激活和变性达到平衡时，也就是最适反应温度。耐热性和热激活性既有联系也有区别，最适反应温度综合反映了温度对活性中心的影响和蛋白质整体结构稳定性的影响。虽然最适反应温度不是酶的特征物理常数，因为它与温度的作用时间有关，作用时间长失活多，所以不是一固定值，但在酶作用时间一定的前提下，就能表征温度对酶活性的影响程度。
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大多数蛋白质的耐热性和热激活性是一致的，即耐热性高热激活性也高，但也有蛋白质的耐热性和热激活性不一致，比如RNA酶，其最适反应温度是37℃，但可耐受100℃的高温。热激活性和耐热性的这种差别反映了两者可能在蛋白质结构中受不同的结构域的影响。本实验中，TAPM3的耐热性明显下降，而热激活性没有变化，这验证了以上观点。
3.2 氨基酸置换对蛋白质耐热性的影响
与野生型FD-TAP相比，TAPM3突变型酶的大部分性质没有发生太大变化，只有耐热性、米氏常数、活化能这3个性质有较明显的变化。从其一级结构来看，427位的甘氨酸变为了丝氨酸，甘氨酸没有不对称碳原子，它的R基为一个氢原子，介于极性与非极性氨基酸之间，正是由于它的侧链简单，在构象上几乎没有任何空间障碍，可以缓和由于肽链弯曲造成的残基侧链间的相互作用。而丝氨酸的R基极性明显高于甘氨酸，再由于它的ρ-碳原子的构象变化，在形成氢键上有各种可能性，因此突变后，丝氢酸改变了FD-TAP结构上的紧密，使酶变得松散，降低了疏水作用，使酶分子内部基团裸露出来，大量的分子内部相互作用丧失，结果导致酶的耐热性下降。
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从活化能的角度看，根据Arrhenius经验式，野生型FD-TAP的活化能为8.60kcal/mol，而TAPM3的活化能仅为8.10kcal/mol，相差约0.5kcal/mol，这个差别说明分子内部相互作用的丧失，使得酶分子只需获得更少的能量就能转入瞬时的活化状态，进行催化反应。从米氏常数比较来看，突变型酶的Km值由1.4×10-4mol/L升为2.3×10-4mol/L，这种变化说明突变后酶结构的打开使酶的活性中心的Ser102“袋”部位与底物间的相互作用减少，亲和力变弱，形成的E·P络合物变得不稳定，容易解离，而Kcat的变化也从另一角度说明了这个问题，Kcat由1.7×105S-1降为5.4×104S-1，说明每个酶分子在单位时间内使pNPP分解为对硝基苯酚的分子数减少了。
, 百拇医药 近年来的研究表明，耐热酶与不耐热酶之间自由能的差异往往只有50kJ/mol，这只相当于几个氢键的能量[8]，也就是说蛋白质耐热性的改变仅与微小的结构改变有关，因此某个关键部位的氨基酸改变将引起蛋白质性质的极大改变。1989年，Menendez朅rias和Argo分析了6个蛋白质家族中70个耐热与不耐热蛋白质的序列，提出只有位于表面的α-螺旋区或结构域界面的氨基酸替代蛋白质柔韧性直降和增加疏水性与蛋白质耐热性增加有关.并提出了位于该区10种常见的氨基酸替代(“Top 10”规则，表1)[9]。这10种常见的氨基酸置换中有几种后来在不少耐热蛋白质中得到了支持[10,11]。
表1 不耐热和耐热蛋白之间10种最常见的氨基酸替换
Table 1 Ordinary substiution amino acid between thermostable and themosensitive protein 不耐热→耐热
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Thermosensitive→
Thermostable
置换区域
Region of
substiution
置换效应 Effect of substitution
疏水性
Hydrophobility
柔韧性 Accessibility
0
1
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2
Lys→Arg
螺旋 helix
+
-
-
-
Ser→Ala
螺旋 helix
+
-
-
-
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Gly→Ala
螺旋和折叠
+
-
-
-
helix & turn
Ser→Thr
折叠和线圈
+
-
+
+
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helix & loop
Ile→Val
螺旋 helix
-
-
+
+
Lys→Ala
螺旋和折叠
+
-
-
-
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helix & loop
Thr→Ala
折叠 turn
+
-
-
-
Lys→Glu
线圈 loop
+
+
-
-
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Glu→Arg
螺旋 helix
+
-
-
-
Asp→Arg
螺旋 helix
+
+
-
-
注(Note):0、1、2表示氨基酸周围的刚性指数 0、1、2 represent rigidity index around amino acid residue
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本实验中TAPM3的Gly(耐热)→Ser(不耐热)的替换虽然在Argo的“Top 10”规则中未曾出现，但二者并不矛盾。目前多数人认为，在耐热蛋白质中氨基酸残基的替代倾向于：(1)外周离子键增加；(2)使蛋白质的疏水性增进或表面亲水性减少；(3)使蛋白质核心致密度增加。
值得注意的是，TAPM3的突变位点位于两个金属离子结合位点His318和His433之间110多个氨基酸序列内，与细菌碱性磷酸酯酶比较，FD-TAP在这一区域多了73个氨基酸，在哺乳类的碱性磷酸酯酶中这一区域也有30多个氨基酸插入[12]，构成1个表面环区的结构域。对人的碱性磷酸酯酶研究表明，该结构域不直接参与酶的催化活性，但与酶的某些理化性质尤其是耐热性直接相关。将哺乳动物的组织非特异性碱性磷酸酯酶(TNAP)的这一结构域拼接到胎盘碱性磷酸酯酶(PLAP)的同一位置，导致了PLAP的耐热性明显下降，在56℃的T1/2由12h下降到8min，而在该结构域内两者只有9个氨基酸的差别[13]。PLAP与精细胞碱性磷酸酯酶(GCAP)在这结构域内只有一个氨基酸的差别，前者为Gly，后者为Glu，将PLAP的Gly替换为Glu，也引起耐热性下降至接近于GCAP的水平[14]。由此可以推测，FD-TAP的这一结构域也可能是决定其耐热性的重要部位之一。
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参考文献
[1] Ikai A. Thermostability and aliphatic index of globular proteins. J. Biochem., 1980, 88:1895～1898.
[2] 盛小禹，王 曦，高静波等. 嗜热细菌碱性磷酸酯酶的研究. 生物化学杂志，1997，13(6)：672～675.
[3] 袁有忠，盛小禹，吕鸿雁等. 耐热碱性磷酸酯酶的基因克隆及在大肠杆菌中的表达. 遗传学报，1998，25(4)：375～380.
[4] 袁有忠，季朝能等. 耐热碱性磷酸酯酶基因的DNA序列分析. 复旦学报，1998，37(4)：513～517.
[5] 袁有忠，佟 石，吕鸿雁等. 耐热碱性磷酸酯酶基因的亚克隆及在大肠杆菌中的表达. 复旦学报，1998，37(2)：146～150.
, http://www.100md.com
[6] J萨姆布鲁克，E F弗里奇，T曼尼阿蒂斯. 分子克隆实验指南(第二版). 北京：科学出版社，1995.
[7] Kironde F A, Parsonage D, Senior A. Random mutagenesis of the gene for the B-subunit of F1-ATPase from Escherichia coli. Biochem. J., 1989, 259:421～426.
[8] Jaenicke R. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Thermotoga maritima: Strategies of protein stabilization. FEMS Microbiol. Rev., 1996, 18:215～224.
[9]Menendez-Arias L, Argo P. Engineering protein thermal stability. Sequence statistics pont to residue substitutions in π-Helices. J. Mol. Biol., 1989, 206:397～406.
, 百拇医药
[10]Borders C L, Broadwater J A, Bekeny P A, Salmon J E. A structural role for arginine in proteins: multiple hydrogen bonds to backbone carbonyl oxygen. Protein Sci., 1994, 3:541～548.
[11]White P J, Squirrell D J. Improved thermostability of the North American firefly luciferase: satruation mutagenesis at position 354. Biochem. J., 1996, 319(Pt 2):343～350.
[12]Kim E E, Wyckoff H W, Structure of alkaline phosphatase. Clin. Chim. Acta., 1990, 186:175～187.
, 百拇医药
[13]Bossi M, Hoylaerts M F, Milan J L, Modifications in a flexible surface loop modulate the isozyme-specificproperties of mammalian alkaline phosphatase. J. Bio. Chem., 1993, 268:25049～25416.
[14]Watanabe T, Wada N, Kim E E. Mutation of a single amino acid converts germ cell alkaline phosphatase to placental phosphatase. J. Biol. Chem., 1991, 266:21174～21178., 百拇医药