苜蓿高含硫氨基酸蛋白转基因植株再生
作者：吕德扬 范云六 俞梅敏 唐顺学 侯宁 汪清
单位：吕德扬 唐顺学 侯宁 汪清(中国科学院遗传研究所，北京 100101)；范云六 俞梅敏(中国农业科学院生物技术研究中心，北京 100081)
关键词：苜蓿；高含硫氨基酸蛋白基因；转化植株
遗传学报000408
摘要：通过农杆菌介导法将高含硫氨基酸蛋白基因转入苜蓿，成功地诱导转基因植株再生。转化植株生长和发育良好。苜蓿子叶外植体是较理想的转化受体。冷凉湿润的环境条件是苜蓿移栽成活率高所必需的。
中图分类号：Q813 文献标识码：A 文章编号：0379-172(2000)04-331-337
Regeneration of HNP Transgenic Alfalfa Plants by Agrobacterium
, 百拇医药
Mediated Gene Transfer
LÜ De-Yang, TANG Shun-Xue,HOU Ning, WANG Qing
(Institute of Genetics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)
FAN Yun-Liu, YU Mei-Min
(Biotechnology Research Centre, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)
Abstract: Transgenic plants regenerated from cotyledons of M. sativa L. infected using Agrobacterium tumefaciens A281 with plasmid pBF649 containing a gene encoding protein of high sulfur-amino acid content (HNP) were obtained successfully. The plants grew and fertiled well in field. Cotyledon explants were better recipient for transformation of M. sativa L. Environment of suitable temperature (15℃) and high humidity on high viability of the plants transplanted into soil were essential conditions.
, 百拇医药
Key words: Medicago sativa L; HNP gene; transgenic plant
苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上最重要的豆科牧草，种植面积约3 500万公顷。苜蓿在我国已有2 000年以上的栽培历史，现种植面积133万公顷[1]。苜蓿既是重要饲料农作物，同时又是改良土壤、保持水土和保护环境的重要作物。苜蓿的营养丰富，蛋白质含量占其干物质重量的17%～20%。然而，苜蓿蛋白质的含硫氨基酸的含量较低。实验证明含硫氨基酸含量的增加可提高羊毛产量22%以上，增产的幅度在22%～104%[2，3]，同时还可增加牲畜的重量。含硫氨基酸的这种独特作用是别的氨基酸不具有的[3]。通过遗传转化方法，将外源高含硫氨基酸蛋白基因转入苜蓿，增加苜蓿植株含硫氨基酸的含量可能是苜蓿改良的有效途径。
外源抗性目的基因转入苜蓿的研究已有成功的报道，如抗除草剂基因[4]，抗病毒基因[5]，和抗虫基因[6]等。外源品质改良基因转化苜蓿的报道很少。本文叙述苜蓿高含硫氨基酸蛋白(HNP)基因转化植株再生的方法、程序和一些影响因素。
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1 材料和方法
1.1 无菌实生苗的产生
所试品种为生产用的保定苜蓿。种子先用75%酒精浸泡10min，再用0.1% HgCl2消毒10～20min，无菌水冲洗3～4次，最后接种到MSO[7]上，25℃光照培养，5～7d苗龄的实生苗子叶用于转化实验。
1.2 质粒、菌株和菌液制备
pBF649质粒含有高含硫氨基酸蛋白(HNP)基因，由启动子35S调控，HNP基因长度1.1kb，其中编码区0.8kb，基因两端有Hind和Kpn双酶切位点，另外还含有NPT基因(Pnos)。质粒在大肠杆菌中保存。所用农杆菌菌株为含有双元载体pBF649质粒的A281[8]。基因构建由杜杰完成[9]。将根癌农杆菌A281划线培养在含100mg/L卡那霉素(Kan)的LB或YEB培养基上，挑取单菌落接种到LB或YEB液体培养基中，25℃黑暗振荡培养，对数生长期的菌液用于感染外植体。
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1.3 苜蓿外植体的转化、培养和植株再生
取5～7d苗龄的实生苗子叶，切去1/3，将2/3片子叶浸入用MSO稀释3～5倍的菌液中，0.5h后取出，置于无菌滤纸上，吸去表面菌液，接种到UM[10，11]上，子叶和菌共培养4d后转到筛选培养基(UM+50mg/L Kan+300mg/L头孢霉素)上，约4周后，把子叶愈伤组织转至MSD4+100mg/L头孢霉素(Cef)上，再过4周后将体细胞胚(体胚)转到MSO上，诱导完整植株再生[10，12]。
1.4 转化植株的筛选和移栽
切取再生植株的叶片，分成两半，接种到UM+100mg/L Kan上，Kan抗性植株在室温下放置数天，先移至装有营养土的花盆，成活后再移到大田。
1.5 NPT酶活性检测
, 百拇医药
按Roy等[13]报道的纸层析法测定。植物材料液氮研磨，用缓冲液抽提，离心，同位素标记，纸层析和X光片压片曝光。
1.6植物DNA的提取
取大田生长植株叶片，液氮研磨，缓冲液提取，酚-氯仿抽担去蛋白，酒精沉淀DNA等步骤按Mettler等报道[14]方法进行。
1.7 Southern blot分析
探针用低融点琼脂糖回收Hind和Kpn双酶切pBF649的基因片段。DNA转移，预杂交，杂交，X光片压片，洗片按分子克隆实验指南[15]的方法。
1.8 转化植株含硫氨基酸含量的测定和育性分析
在苜蓿植株开花前，取茎上部的茎叶，烘干，粉碎，盐酸水解，上机测定，氨基酸分析(仪器为日立835-10A型)，由中国农科院畜牧所分析室进行。植株育性的检测则是从大田生长植株上采下快开花的花蕾，用解剖刀切开取出花药，在载玻片上用醋酸洋红压片，显微镜下观察。
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1.9 转化植株T1代性状分析
1.9.1 Kan抗性测定 从T0植株种子生长的植株，采下上部浅黄色的叶片，经酒精、升汞消毒后接种到UM+100mg/L Kan上，诱导叶片愈伤组织产生[10]。
1.9.2 PCR扩增朣outhem blot鉴定 从T1代植株顶部摘取幼嫩茎叶，按上述“1.6”的介绍提取DNA，按HNP基因编码序列0.8kb设计引物进行DNA PCR扩增。
引物序列：5′ ATGTCCAAACCTTTTCTATCTTTGC3′；
引物序列：5′TCACATCAGGCACAGCACGTG3′。
其扩增方法按McGarvey等[16]介绍的进行，探针用低融点琼脂糖回收Hind和Kpn双酶切pBF649的基因片段(1.1kb)、DNA转移、预杂交、杂交等与上述“1.7”介绍的相同。
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2 结果与讨论
2.1子叶外植体转化植株再生
子叶外植体经转化处理后，在筛选培养基上诱导愈伤组织，子叶愈伤组织的诱导频率为21%～28%。对照未产生愈伤组织。愈伤组织在MSD4上分化体胚，分化率在70%左右。愈伤组织分化体胚数多的可达数十个(图版I-1)，体胚发育成完整植株(图版I-1)。苜蓿实生苗子叶不仅取材容易， 而且转化率高。苜蓿子叶受体比茎段[4，6，17]、 叶柄[4]和叶片[5]更为理想。这与子叶组织的松软而厚、细胞生长快、体胚分化力强[18]的特点有关。A281菌株致病力强，与Chabaud等[19]和Du等[20]的结果一致。苜蓿子叶外植体农杆菌介导转化比实生苗根原生质体电激转化[7]程序简单， 操作方便， 重复性好；比苜蓿基因枪轰击[21]转化效率高得多。再生植株盆栽成活率低，死亡率高，低温(15℃)和湿润环境是苜蓿植株移栽成活率高所必需的[12]。
, 百拇医药
1. 苜蓿子叶外植体经农杆菌感染的体细胞胚的再生；
1. Somatic embryogenesis from cotyledon of M. sativa L. infected by A. tumefaciens A281 with pBF649
containing a gene encoding protein of rich sulfur-mino acids;
2. 苜蓿子叶外植体HNP转基因植株
2. HNP transgenic plants developed
from somatic embryos of seedling cotyledons of M. sativa L.
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2.2 NPT酶显示活性
苜蓿Kan抗性植株的NPT酶显示活性(图1)，这说明NPT酶基因已整合到转化植株染色体DNA上。
图1 苜蓿HNP转基因植株NPTⅡ酶活性检测
1.正对照;2～4.转基因植株;5.负对照
Fig.1 NPT-Ⅱenzyme activity assay of HNP transgenic alfalfa plants
1.+CK;2 ～4.Transgenic plants;5.-CK
2.3 Southern blot阳性反应
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Kan抗性植株DNA Southern blot分析均显示杂交条带，而对照植株无任何带。图2显示转化植株DNA经Hind和Kpn双酶切的均有1条带(1.1kb，图2，A)，而Hind单酶切的有1条带、 2条带和3条带(图2，B)， HNP基因除了多位点和或多拷贝插入到植物DNA上外，还有单位点， 很可能是单基因插入的。这一结果与Shahin等[6]、Chabaud等[19]、Hill等[5]、Du等[20]和Thomas等[22]苜蓿转化的报道相似。
图2 苜蓿HNP转基因植株DNA Southern blot 结果
1～9.转基因植株;10.-CK对照植株;11.+CK(HNP基因,探针)
, 百拇医药
Fig.2 Southern blot analysis of HNP transgenic alfalfa plants
1～9.Transgenic plants;10.-CK(control plant);11.+CK(HNP gene,probe)
2.4 转化植株含硫氨基酸含量分析
表1显示15株转基因植株含硫氨基酸的含量与对照植株(含硫氨基酸含量的平均值)相比，有的增加、有的相似和有的减少。其中植株MSH4、MSH8和MSH15分别比对照植株的含硫氨基酸含量增加13.9%、16.6%和20.8%，差异极显著。对照植株(非转化处理的子叶外植体植株)之间含硫氨基酸含量的差异不显著。另外，检测结果证明，转基因植株与对照植株之间17种氨基酸总量(包括含硫氨基酸在内)并没有变化，MSH8比CK2含硫氨基酸含量高16.6%，而这两株的天冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸等17种氨基酸的总量分别是干物质重量的37.70%和37.76%，差异很小。这一结果与百脉根HNP转基因植株含硫氨基酸含量提高显著的结果①一致。我们从苜蓿和百脉根HNP转基因植株的一致结果认为，HNP基因在苜蓿转化植株中得到表达。
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表1 苜蓿高含硫氨基酸转基因植株含硫氨基酸的含量
Table Content of sulfur-amino acids from transgenic alfalfa plants 田间种植号
Ordinal of plants
Southern blot
分析
Southrn blot
analysis
含硫氨基酸含量(mg/100g)
Content of sulfur-amino acids
, http://www.100md.com
%含硫氨基酸增加
%increase of sulfru amino acid
胱氨酸
Cystine
蛋氨酸
Methionine
总量
Tital
1
+
330
380
, http://www.100md.com
710
-1.4
3
+
350
390
740
2.7
4
+
380
440
820
, http://www.100md.com 13.88**
5
+
330
380
710
-1.4
8
+
380
460
840
16.6**
, 百拇医药
10
+
-
-
-
-
11
+
350
400
750
4.2
12
+
, http://www.100md.com
340
370
710
-1.4
13
+
330
360
690
-4.3
14
+
370
, 百拇医药 410
780
8.3*
15
+
380
490
870
20.8**
16
+
-
-
, http://www.100md.com
-
17
+
-
-
-
18
+
-
-
-
19
+
-
, 百拇医药
-
-
20
+
-
-
-
21
+
-
-
-
22
+
, http://www.100md.com
-
-
-
23
+
-
-
-
6(CK1)
-
330
410
740
7(CK2)
, 百拇医药
-
310
410
720
9(CK3)
-
330
380
710
*差异显著;Significant difference **差异极显著;very significant difference
2.5 植株结实率的分析
表2显示4株转基因植株中有3株结实很好，可育(被醋酸洋红染色的花粉)的百分率
, 百拇医药
与对照相似。有1株结实率差，空瘪花粉(不被醋酸洋红染色的)占61%。转化植株不育的
现象在玉米[23]、小麦[24,25]和大豆[26]等转基因植株中是常见的。
表2 苜蓿HNP转基因植株花粉可育花粉比例
Table 2 Rate of fertile pollens of transgenic alfalfa plants 植株编号
Ordinal of plant
检测花粉数1)
No.of total pollens calculated
, 百拇医药
可育花粉数
No.of fertile pollens
%可育花粉
%fertile pollens
4
2457
1966
80
8
1440
1166
81
, http://www.100md.com 14
1097
428
39
15
1424
1196
84
6(CK1)
1923
1577
82
7(CK2)
, http://www.100md.com
958
747
78
8(CK3)
1116
926
83
1)醋酸洋红染色 Acetic acid-carmine dyed
2.6 转基因植株Kan抗性性状的遗传
转基因植株的Kan抗性可传给子代，T1代Kan抗性有分离，在自由传粉条件下，植株分离比例近11(表3)，符合孟德尔遗传的分离定律。
, 百拇医药 表3 苜蓿HNP转基因植株T1代的分离
Table 3 Segregation of T1 generation of HNP transgenic alfalfa plants under open pollination 植株编号
Ordinal of plant
根数
No.of root
Kan抗性根数
No.of root for
Kan resistance
Kan敏感的根数
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No.of root for
Kan sensitivity
分离比例
Rate of segregation
4
62
28
34
1:1.2
8
87
43
, 百拇医药 44
1:1.0
15
69
33
36
1:1.1
CK
31
0
31
0
2.7 转基因植株T1的PCR朣outhern blot
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Kan抗性植株阳性反应的PCR朣outhern blot分析均显示杂交带，而对照无阳性反应(图3)，表明HNP基因已传给苜蓿的子代。
图3 苜蓿HNP转基因植株T1PCR-Southern blot分析
1.正对照,pBF649 HindⅢ和KpnⅠ双酶切片段;
2.负对照植株;3～10.转基因植株
Fig.3 PCR-Southern blot analysis of the T1 plant DNA
1.+CK,DNA fragment of pBF649 restricted by HindⅢand KpnⅠ;2.-CK,control plants;
, 百拇医药
3～10.T1 of HNP transgenic plants
致谢：于小兰，吴 红，赵广宇，张佳云，田 霞，曹学远，王同英等同志参加部分工作，谨此致谢。
参考文献
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苜蓿(Medicago sativa L.)是世界上最重要的豆科牧草，种植面积约3 500万公顷。苜蓿在我国已有2 000年以上的栽培历史，现种植面积133万公顷[1]。苜蓿既是重要饲料农作物，同时又是改良土壤、保持水土和保护环境的重要作物。苜蓿的营养丰富，蛋白质含量占其干物质重量的17%～20%。然而，苜蓿蛋白质的含硫氨基酸的含量较低。实验证明含硫氨基酸含量的增加可提高羊毛产量22%以上，增产的幅度在22%～104%[2，3]，同时还可增加牲畜的重量。含硫氨基酸的这种独特作用是别的氨基酸不具有的[3]。通过遗传转化方法，将外源高含硫氨基酸蛋白基因转入苜蓿，增加苜蓿植株含硫氨基酸的含量可能是苜蓿改良的有效途径。
外源抗性目的基因转入苜蓿的研究已有成功的报道，如抗除草剂基因[4]，抗病毒基因[5]，和抗虫基因[6]等。外源品质改良基因转化苜蓿的报道很少。本文叙述苜蓿高含硫氨基酸蛋白(HNP)基因转化植株再生的方法、程序和一些影响因素。
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1 材料和方法
1.1 无菌实生苗的产生
所试品种为生产用的保定苜蓿。种子先用75%酒精浸泡10min，再用0.1% HgCl2消毒10～20min，无菌水冲洗3～4次，最后接种到MSO[7]上，25℃光照培养，5～7d苗龄的实生苗子叶用于转化实验。
1.2 质粒、菌株和菌液制备
pBF649质粒含有高含硫氨基酸蛋白(HNP)基因，由启动子35S调控，HNP基因长度1.1kb，其中编码区0.8kb，基因两端有Hind和Kpn双酶切位点，另外还含有NPT基因(Pnos)。质粒在大肠杆菌中保存。所用农杆菌菌株为含有双元载体pBF649质粒的A281[8]。基因构建由杜杰完成[9]。将根癌农杆菌A281划线培养在含100mg/L卡那霉素(Kan)的LB或YEB培养基上，挑取单菌落接种到LB或YEB液体培养基中，25℃黑暗振荡培养，对数生长期的菌液用于感染外植体。
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1.3 苜蓿外植体的转化、培养和植株再生
取5～7d苗龄的实生苗子叶，切去1/3，将2/3片子叶浸入用MSO稀释3～5倍的菌液中，0.5h后取出，置于无菌滤纸上，吸去表面菌液，接种到UM[10，11]上，子叶和菌共培养4d后转到筛选培养基(UM+50mg/L Kan+300mg/L头孢霉素)上，约4周后，把子叶愈伤组织转至MSD4+100mg/L头孢霉素(Cef)上，再过4周后将体细胞胚(体胚)转到MSO上，诱导完整植株再生[10，12]。
1.4 转化植株的筛选和移栽
切取再生植株的叶片，分成两半，接种到UM+100mg/L Kan上，Kan抗性植株在室温下放置数天，先移至装有营养土的花盆，成活后再移到大田。
1.5 NPT酶活性检测
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按Roy等[13]报道的纸层析法测定。植物材料液氮研磨，用缓冲液抽提，离心，同位素标记，纸层析和X光片压片曝光。
1.6植物DNA的提取
取大田生长植株叶片，液氮研磨，缓冲液提取，酚-氯仿抽担去蛋白，酒精沉淀DNA等步骤按Mettler等报道[14]方法进行。
1.7 Southern blot分析
探针用低融点琼脂糖回收Hind和Kpn双酶切pBF649的基因片段。DNA转移，预杂交，杂交，X光片压片，洗片按分子克隆实验指南[15]的方法。
1.8 转化植株含硫氨基酸含量的测定和育性分析
在苜蓿植株开花前，取茎上部的茎叶，烘干，粉碎，盐酸水解，上机测定，氨基酸分析(仪器为日立835-10A型)，由中国农科院畜牧所分析室进行。植株育性的检测则是从大田生长植株上采下快开花的花蕾，用解剖刀切开取出花药，在载玻片上用醋酸洋红压片，显微镜下观察。
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1.9 转化植株T1代性状分析
1.9.1 Kan抗性测定 从T0植株种子生长的植株，采下上部浅黄色的叶片，经酒精、升汞消毒后接种到UM+100mg/L Kan上，诱导叶片愈伤组织产生[10]。
1.9.2 PCR扩增朣outhem blot鉴定 从T1代植株顶部摘取幼嫩茎叶，按上述“1.6”的介绍提取DNA，按HNP基因编码序列0.8kb设计引物进行DNA PCR扩增。
引物序列：5′ ATGTCCAAACCTTTTCTATCTTTGC3′；
引物序列：5′TCACATCAGGCACAGCACGTG3′。
其扩增方法按McGarvey等[16]介绍的进行，探针用低融点琼脂糖回收Hind和Kpn双酶切pBF649的基因片段(1.1kb)、DNA转移、预杂交、杂交等与上述“1.7”介绍的相同。
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2 结果与讨论
2.1子叶外植体转化植株再生
子叶外植体经转化处理后，在筛选培养基上诱导愈伤组织，子叶愈伤组织的诱导频率为21%～28%。对照未产生愈伤组织。愈伤组织在MSD4上分化体胚，分化率在70%左右。愈伤组织分化体胚数多的可达数十个(图版I-1)，体胚发育成完整植株(图版I-1)。苜蓿实生苗子叶不仅取材容易， 而且转化率高。苜蓿子叶受体比茎段[4，6，17]、 叶柄[4]和叶片[5]更为理想。这与子叶组织的松软而厚、细胞生长快、体胚分化力强[18]的特点有关。A281菌株致病力强，与Chabaud等[19]和Du等[20]的结果一致。苜蓿子叶外植体农杆菌介导转化比实生苗根原生质体电激转化[7]程序简单， 操作方便， 重复性好；比苜蓿基因枪轰击[21]转化效率高得多。再生植株盆栽成活率低，死亡率高，低温(15℃)和湿润环境是苜蓿植株移栽成活率高所必需的[12]。
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1. 苜蓿子叶外植体经农杆菌感染的体细胞胚的再生；
1. Somatic embryogenesis from cotyledon of M. sativa L. infected by A. tumefaciens A281 with pBF649
containing a gene encoding protein of rich sulfur-mino acids;
2. 苜蓿子叶外植体HNP转基因植株
2. HNP transgenic plants developed
from somatic embryos of seedling cotyledons of M. sativa L.
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2.2 NPT酶显示活性
苜蓿Kan抗性植株的NPT酶显示活性(图1)，这说明NPT酶基因已整合到转化植株染色体DNA上。
图1 苜蓿HNP转基因植株NPTⅡ酶活性检测
1.正对照;2～4.转基因植株;5.负对照
Fig.1 NPT-Ⅱenzyme activity assay of HNP transgenic alfalfa plants
1.+CK;2 ～4.Transgenic plants;5.-CK
2.3 Southern blot阳性反应
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Kan抗性植株DNA Southern blot分析均显示杂交条带，而对照植株无任何带。图2显示转化植株DNA经Hind和Kpn双酶切的均有1条带(1.1kb，图2，A)，而Hind单酶切的有1条带、 2条带和3条带(图2，B)， HNP基因除了多位点和或多拷贝插入到植物DNA上外，还有单位点， 很可能是单基因插入的。这一结果与Shahin等[6]、Chabaud等[19]、Hill等[5]、Du等[20]和Thomas等[22]苜蓿转化的报道相似。
图2 苜蓿HNP转基因植株DNA Southern blot 结果
1～9.转基因植株;10.-CK对照植株;11.+CK(HNP基因,探针)
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Fig.2 Southern blot analysis of HNP transgenic alfalfa plants
1～9.Transgenic plants;10.-CK(control plant);11.+CK(HNP gene,probe)
2.4 转化植株含硫氨基酸含量分析
表1显示15株转基因植株含硫氨基酸的含量与对照植株(含硫氨基酸含量的平均值)相比，有的增加、有的相似和有的减少。其中植株MSH4、MSH8和MSH15分别比对照植株的含硫氨基酸含量增加13.9%、16.6%和20.8%，差异极显著。对照植株(非转化处理的子叶外植体植株)之间含硫氨基酸含量的差异不显著。另外，检测结果证明，转基因植株与对照植株之间17种氨基酸总量(包括含硫氨基酸在内)并没有变化，MSH8比CK2含硫氨基酸含量高16.6%，而这两株的天冬氨酸、赖氨酸、脯氨酸等17种氨基酸的总量分别是干物质重量的37.70%和37.76%，差异很小。这一结果与百脉根HNP转基因植株含硫氨基酸含量提高显著的结果①一致。我们从苜蓿和百脉根HNP转基因植株的一致结果认为，HNP基因在苜蓿转化植株中得到表达。
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表1 苜蓿高含硫氨基酸转基因植株含硫氨基酸的含量
Table Content of sulfur-amino acids from transgenic alfalfa plants 田间种植号
Ordinal of plants
Southern blot
分析
Southrn blot
analysis
含硫氨基酸含量(mg/100g)
Content of sulfur-amino acids
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%含硫氨基酸增加
%increase of sulfru amino acid
胱氨酸
Cystine
蛋氨酸
Methionine
总量
Tital
1
+
330
380
, http://www.100md.com
710
-1.4
3
+
350
390
740
2.7
4
+
380
440
820
, http://www.100md.com 13.88**
5
+
330
380
710
-1.4
8
+
380
460
840
16.6**
, 百拇医药
10
+
-
-
-
-
11
+
350
400
750
4.2
12
+
, http://www.100md.com
340
370
710
-1.4
13
+
330
360
690
-4.3
14
+
370
, 百拇医药 410
780
8.3*
15
+
380
490
870
20.8**
16
+
-
-
, http://www.100md.com
-
17
+
-
-
-
18
+
-
-
-
19
+
-
, 百拇医药
-
-
20
+
-
-
-
21
+
-
-
-
22
+
, http://www.100md.com
-
-
-
23
+
-
-
-
6(CK1)
-
330
410
740
7(CK2)
, 百拇医药
-
310
410
720
9(CK3)
-
330
380
710
*差异显著;Significant difference **差异极显著;very significant difference
2.5 植株结实率的分析
表2显示4株转基因植株中有3株结实很好，可育(被醋酸洋红染色的花粉)的百分率
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与对照相似。有1株结实率差，空瘪花粉(不被醋酸洋红染色的)占61%。转化植株不育的
现象在玉米[23]、小麦[24,25]和大豆[26]等转基因植株中是常见的。
表2 苜蓿HNP转基因植株花粉可育花粉比例
Table 2 Rate of fertile pollens of transgenic alfalfa plants 植株编号
Ordinal of plant
检测花粉数1)
No.of total pollens calculated
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可育花粉数
No.of fertile pollens
%可育花粉
%fertile pollens
4
2457
1966
80
8
1440
1166
81
, http://www.100md.com 14
1097
428
39
15
1424
1196
84
6(CK1)
1923
1577
82
7(CK2)
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958
747
78
8(CK3)
1116
926
83
1)醋酸洋红染色 Acetic acid-carmine dyed
2.6 转基因植株Kan抗性性状的遗传
转基因植株的Kan抗性可传给子代，T1代Kan抗性有分离，在自由传粉条件下，植株分离比例近11(表3)，符合孟德尔遗传的分离定律。
, 百拇医药 表3 苜蓿HNP转基因植株T1代的分离
Table 3 Segregation of T1 generation of HNP transgenic alfalfa plants under open pollination 植株编号
Ordinal of plant
根数
No.of root
Kan抗性根数
No.of root for
Kan resistance
Kan敏感的根数
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No.of root for
Kan sensitivity
分离比例
Rate of segregation
4
62
28
34
1:1.2
8
87
43
, 百拇医药 44
1:1.0
15
69
33
36
1:1.1
CK
31
0
31
0
2.7 转基因植株T1的PCR朣outhern blot
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Kan抗性植株阳性反应的PCR朣outhern blot分析均显示杂交带，而对照无阳性反应(图3)，表明HNP基因已传给苜蓿的子代。
图3 苜蓿HNP转基因植株T1PCR-Southern blot分析
1.正对照,pBF649 HindⅢ和KpnⅠ双酶切片段;
2.负对照植株;3～10.转基因植株
Fig.3 PCR-Southern blot analysis of the T1 plant DNA
1.+CK,DNA fragment of pBF649 restricted by HindⅢand KpnⅠ;2.-CK,control plants;
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3～10.T1 of HNP transgenic plants
致谢：于小兰，吴 红，赵广宇，张佳云，田 霞，曹学远，王同英等同志参加部分工作，谨此致谢。
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