野败型杂交水稻恢复基因的AFLP标记研究
作者：何光华 裴炎 杨光伟 唐梅 谢戎 侯磊 杨正林 李永洪
单位：何光华 裴炎 杨光伟 唐梅 侯磊(西南农业大学生物技术中心，重庆北碚 400716)；谢戎 杨正林 李永洪 何光华(四川省农业科学院水稻高粱研究所，泸州 646100)
关键词：野败型；杂交水稻；恢复基因；AFLP标记
遗传学报000404
摘要：选择汕优63 F2的高可育株和高不育株分别建立2个基因池，利用AFLP标记技术对2池间的多态性进行了研究。分析表明，64组引物在两池间全部扩增出了稳定、清晰的带纹，共计3477条带。多数引物在基因池间未呈现多态性，只有引物组合E-AGC/M-CAA在基因池间表现多态性，用双亲、F1、F2单株以及生产和育种上的骨干不育系与恢复系验证均表明这组引物所揭示的多态性片段与恢复基因有关(命名为AP1)。AP1为单拷贝，与恢复基因间的距离为4.76cM。
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中图分类号：Q343.1+7 文献标识码：A 文章编号：0379-172(2000)04-304-310
AFLP Markers of Restoring Genes of the Wild-Abortive Hybrid Rice
HE Guang-Hua, PEI Yan, YANG Guang-Wei, TANG Mei,HOU Lei
(Center of Biotechnology, Southwest Agricultural University, Chongqing 400716, China)
HE Guang-Hua,XIE Rong, YANG Zheng-Lin, LI Yong-Hong
(Rice and Sorghum Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Luzhou 646100, China)
, http://www.100md.com
Abstract: Fertile and sterile pools were set up by bulked segregant analysis (BSA) based on the selection for the highly fertile and highly sterile plants of Shanyou 63 F2population The AFLP analysis of the two pools indicated that 64 primer combinations amplified 3 477 stable and clear bands. Exception of the combination E-AGC/M-CAA,all primer combinations had not detected polymorphism between the two pools. It was proved by investigation of two parents, individuals of F2 segregant population, backbone sterile lines and restorer lines that the polymorphic fragment AP1 generated from the primer E-AGC/M-CAA was associated with the restoring gene. AP1 was a single copy detected by Southern blot hybridization. The distance between AP1 and the restoring gene was 4.76cM.
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Key words: wild-abortive; hybrid rice; restoring gene; AFLP marker
植物雄性不育一般分为“细胞核不育”、“细胞质不育”和“质核互作不育”3种类型，目前在生产上大面积使用的是“质核互作不育”类型(如水稻、玉米等)。我国1973年在世界上首次成功地实现了杂交水稻“三系”配套，并在生产上得到了广泛应用，已累计推广近2亿公顷，为我国乃至世界的粮食增产作出了巨大贡献。其中野败型不育胞质使用最多、推广面积最大，占总面积的90%以上。杂交水稻能应用的关键之一就是要求F1具有高的结实率，这一特性是由恢复系所具有的恢复基因决定的。由于它在“三系”杂种优势利用中具有极其重要的地位，其研究历来受到广泛关注[1]。
随着分子标记技术的出现和发展，由于分子标记技术所具有的显著优越性，可对恢复基因进行深入研究。已有一些学者利用RAPD、RFLP等技术在这一领域开展了研究[2～5]，但未得出统一结论。分子标记技术的发展非常迅速，自1980年RFLP提出以来，已先后有20多种技术出现。但1993 Zebeau和Vos[6]发展起来的扩增片段长度多态性(AFLP)技术被认为是一种有效的分子标记，既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性[7]。因此，本研究采用该技术对野败型恢复基因的分子标记进行研究。
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1 材料和方法
1.1 基础群体的构建
1996年夏在泸州配制珍汕97A/明恢63(汕优63)，同年秋海南繁殖F1，并对F1进行单株套袋，成熟时单株收获F1种子。1997年种植F2，苗期剪取幼嫩叶片提取DNA，成熟时分别考查各株结实率。由于汕优63 F2细胞质来源于珍汕97A，全部F2单株均含有不育胞质，凡是结实正常的植株均含有恢复基因、不育株均不含恢复基因，据此建立以下基因池群体：选取高结实的15个单株等量混合DNA构成可育池，简称F池；选取高不育的15个单株等量混合DNA构成不育池，简称S池。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA的提取与纯化叶片DNA的提取参照McCouch[8]的方法进行。
1.2.2 AFLP分析首先分别对基因池进行AFLP分析，然后根据实验结果进行验证。AFLP分析参照AFLPTM试剂盒(Instruction manual，1997)说明书进行。采用了8个E端引物(AAC，AAG，ACA，ACC，ACG，ACT，AGC，AGG)和8个M端引物(CAA，CAC，CAG，CAT，CTA，CTC，CTG，CTT)，构成64组引物对。
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酶切基因组DNA：25μl反应体系中含有超纯水14μl, 5×reaction buffer 5l, Sample DNA 4l(含DNA约0.2μg)，内切酶EcoRI和MseI 2μl(各3U)，混匀，用封口膜封口后于37℃酶切2h, 70℃ 15min灭活酶。
人工接头连接：在酶切后的DNA中，于冰上加入人工接头24μl、T4 DNA连接酶1μl，缓慢混匀，置于20℃保温2h，即得到AFLP中PCR反应的模板DNA。
预扩增：25μl反应体系中含预扩增Mix 20μl, PCR buffer for AFLP 2.5μl, Taq DNA聚合酶1U，模板DNA 2.5μl。预扩增时EcoRI端将A作为选择扩增碱基，Mse端将C作为选择扩增碱基。反应扩增条件为：94℃ 30s, 56℃ 1min, 72℃ 1min, 20个循环。
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标记引物：10μl反应体系中含一种E端引物3.6μl, 5×T4 Kinase buffer 2μl,[γ-32P]ATP 1.5μl, ddH2O 2.4μl, T4 Kinase 0.5μl。37℃反应1h，70℃温浴10min。
选择性扩增：20μl反应体系中含有标记的E端引物4.5μl, AFLP杇rade water 12.5μl,10×PCR buffer for AFLP 2μl, Taq DNA聚合酶1l(1U/l)。在EcoR端和Mse端分别选用2个碱基作为选择扩增碱基。扩增条件为：94℃ 30s, 65℃ 30s, 72℃ 1min, 1个循环；94℃ 30s, 65℃～56℃ 30s(每个循环温度下降约0.7℃), 72℃ 1min, 12个循环；94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 1min, 23个循环。
扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶置-70℃放射自显影2～7d后，观察结果并摄影。
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1.2.3 特征片段的回收纯化 在放射自显影时，将X光片与凝胶对齐，并作好标记。显影后再对齐，用干净刀片在特征片段位置将凝胶回收入1.5ml管中，加入1ml TE, 15min后，倾出TE，再加入1ml TE(内含100mmol/L NaCl)，煮沸10min。室温下冷却过夜，即得纯化DNA，置于4℃备用。
1.2.4 Southern杂交 用地高辛标记探针，真空转移DNA，Southern杂交参照《分子克隆实验指南》进行。
2 结果与分析
2.1 明恢63与珍汕97A间的多态性
采用15对E端与M端引物组合分析了明恢63与珍汕97A间的多态性，结果表明，AFLP扩增带纹非常稳定、清晰，15对引物共扩增出了815条带，平均每个引物扩增54.33条带，289条表现为多态性，多态性频率为35.46%。说明AFLP技术可以用于本实验研究。
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2.2 与恢复基因相关的分子标记筛选
由于15组引物中每组引物均能在双亲间扩增出多态性，因此我们首先在基因池间寻找多态性，采用了64组引物对基因池进行筛选。结果所有的引物都能稳定扩增出清晰带纹，一般能扩增出50～100条带，64组引物共计扩增出了3 477条带，经过反复验证，多数引物在基因池间不存在多态性差异，只有引物E-AGC/MC-AA在基因池间稳定扩增出差异带，可育池比不育池多1条带(图1)，命名为AP1。由于两基因池间除恢复性存在差异外，其他性状无差异，因此推测该差异片段可能与恢复基因有关。为了确证该片段是否与恢复基因连锁，我们进行了以下验证。
图1 基因池、亲本、F1的多态性
(引物为E-AGC/M-CAA)
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F：可育池；S：不育池；P1：明恢63；P2：珍97A；F1：汕优63
Fig.1 AFLP patterns amplified with primers E-AGC/M-CAA of the fertile and sterile pools ,the parents Minhui 63 and Zhenshan 97A,F1 hybrids Shanyou 63.The polymorphic DNA fragment AP1 putatively associating with the restoring gene is indicated by arrow
F:Fertile pools; S:Sterile pools; P1:Minghui 63; P2:Zhenshan 97A; F1:Shanyou 63
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2.3 特征片段验证
2.3.1 筛选片段的双亲验证 明恢63细胞核具有恢复基因，而珍汕97A含不育基因，理论上两者在特征片段位置上应存在差异。用上述筛选的引物E-AGC/MC-AA对珍汕97A、明恢63进行了验证，结果能在珍汕97A和明恢63间同一位置表现出差异，明恢63具有特征带，而珍汕97A无。说明该组引物在双亲间也表现出多态性(图1)。汕优63是明恢63与珍汕97A的杂交1代，具有明恢63与珍汕97A的细胞核，细胞质来源于珍汕97A，由于汕优63表现高结实性，具有恢复基因，也应具有该特征片段，从图1上也证明了这一点。
2.3.2 筛选片段的恢复系、不育系验证 选取育种上和生产上的7个能恢复野败不育系的骨干恢复系，7个能被明恢63恢复的不育系进行AFLP分析，引物组合E-AGC/M-CAA显示，7个恢复系均具有该特征带，而7个不育系均无此带(图2)，进一步表明所筛选的特征片段可能与恢复基因有关。
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图2 特征片段的恢复系与不育系验证(E-AGC/M-CAA)
F：可育池；S：不育池；1～7：恢复系；8～14：不育系
Fig.2 AFLP patterns of fragment AP1 amplifiedwith primer E-AGC/M-CAA in fertile and sterile lines for verification
F: Fertile pools; S: Sterile pools; 1～7:Restorer lines;8～14:Strile lines
2.3.3 筛选片段的单株验证及与恢复基因间的分子图谱距离 要确定特征片段是否与恢复基因有关，分离群体的单株验证是非常重要的。用所获得的特征片段引物(E-AGC/MC-AA)对73个F2单株进行了验证，结果显示(图3为其中的一部分)，在特征片段位置上，30株可育株均具有该特征片段，而43株不育株中39株无此特征片段，4株出现交换，说明该特征片段与恢复基因连锁。根据43株不育株的特征带情况，采用极大似然法计算得出该特征片段AP1与恢复基因间的距离为4.76cM。
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图3 引物组合E-AGC/M-CAA的F2单株验证
F、S同图1；1～33为F2单株，17～33为不育株，R为交换型
Fig.3 AFLP patterns amplified with primers E-AGC/M-CAA showing the specific fragment AP1 in individuals of F2 segregant population for verification.Fragment AP1 is indicated by jkarrow F、S: Same as the names in Fig.1; F2: Individuals of F2 segregant population
, 百拇医药 (1～16: Fertile,17～33:Sterile);R:Recombinant type
2.4 特征片段的回收纯化及Southern杂交
将特征片段从变性聚丙烯酰胺凝胶上回收并纯化，再用E-AGC/MC-AA引物进行扩增，检测所回收的片段是否为目的片段。图4显示，回收片段与基因池间多态性位置完全一致，说明回收片段确为目的片段。用EcoR、Hind、BamH对明恢63和珍汕97A进行酶切，电泳后真空印迹到尼龙膜上，用回收纯化的特征片段为探针进行杂交，结果表明，该特征片段为单拷贝，但3个酶均未揭示出明恢63与珍汕97A间存在多态性(图5)。
图4 回收片段的再扩增
AP1：回收再扩增片段
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Fig.4 AFLP patterns of re-amplified fragment AP1 recovered from the denaturing polyacrylamide gel The re-amplified fragment AP1 is indicated by arrow
图5 特征片段的Southern杂交
Fig.5 Southern blot hybridization patterns with digoxigen-labelled AP1 between Minghui 63 and Zhenshan 97A digested with EcoRⅠ,Hind Ⅲ and BamHⅠ
1：EocRⅠ;2：Hind Ⅲ; 3：BamHⅠR：Minghui 63;A：Zhenshan 97A
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3 讨论
自从“三系”杂交水稻理论一提出，就开始了恢复基因的研究，到目前为止已有30余篇文献报道了恢复基因或恢复性的遗传研究结果。这些研究主要集中在育性指标的采用和划分、恢复基因的数目、恢复基因的等位性、恢复基因的效应、恢复基因的定位等经典遗传理论方面，取得了很好的效果。但由于不同研究者采用了不同的育性指标，以及这些指标的划分标准很不一致，加之育性指标受环境影响等原因，导致研究结果差异甚大[1]。由于分子生物学的迅速发展，分子标记技术的出现为进一步研究恢复基因的特性提供了强有力的手段和可能，目前已在这一方面开展了初步研究。Zhang等[4](1997)发现了6个RAPD阳性标记，结合RFLP技术，定位了3个标记与Rf3基因连锁，位于染色体1上，未发现与Rf4相关的标记。李平等[2]采用数量性状QTL定位原理，鉴别出了8个基因座位，其中有两个座位表现较强的作用，分别位于染色体3和4上。Yao等[3]认为两对恢复基因分别存在于染色体1和染色体10上。Tan等[5]找到了两个恢复基因座位，均位于染色体10上。我们利用AFLP技术，结合F2 BSA (Bulked Segregant Analysis)池，寻找到了1个标记，BSA法寻找标记的关键在于验证，我们经双亲、F1、F2单株、育种上的骨干恢复系和不育系验证均表明该标记与恢复基因相关。同时值得注意的是所用的7个骨干恢复系均能恢复野败不育胞质、7个骨干不育系均能被明恢63恢复，分析表明，该特征片段在它们之间也显示出多态性，7个恢复系均具有特征片段，而7个不育系均无此片段，暗示该标记可能在其他遗传背景中也成立。同时7个不育系为不同的胞质不育类型：冈型(籼细胞质)、K型(粳细胞质)、印尼水田谷型、野败型等，是否我们所筛选的标记为它们的共同标记？或在恢复基因群中这些不育胞质共同具有1对恢复基因？值得进一步深入研究。
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我们在AFLP操作中，发现有几个问题值得注意：(1)DNA酶切充分是关键，如果酶切不彻底，容易造成假阳性或假阴性；(2)防止DNA污染很重要，由于AFLP技术涉及两次扩增，因此痕量DNA污染将对结果造成较大影响，容易产生假阴性，甚至可能在基因池间找不出多态性；(3)在采用BSA池法寻找多态性时，AFLP与RAPD和RFLP等技术不同，通常在使用RAPD或RFLP技术时，首先对双亲间的多态性进行检测，当寻找到多态性引物或探针时，再将其用在BSA池间，以进一步筛选出与目标性状相关的标记。而AFLP则不同，每个引物能扩增出50～100条带，远远多于其他标记，正如在本实验中，15对引物都能在亲本间扩增出多态性，首先对亲本进行分析是无效的，因此建议先对BSA池进行分析，当获得多态性引物时，再用亲本进行验证；(4)由于AFLP涉及到酶切和扩增，提取DNA时的残留物质会有影响，因此要求DNA的提取质量要好。
获得与目标性状相连锁的分子标记后，重要应用之一便是分子标记辅助育种。这一技术已在水稻白叶枯病上取得了成功[9，10]。水稻恢复基因的辅助选择可采取这样的方法，将AFLP标记进行回收、克隆，测定片段两端100bp碱基序列，合成两对20～24bp的核苷酸引物，将AFLP标记转化为PCR标记后，对杂交分离群体后代进行单株鉴定，即可区分出哪些植株含有恢复基因、哪些植株不具有恢复基因，从而达到辅助育种之目的。这方面的研究我们正在进行当中。
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参考文献
[1]何光华，裴 炎，杨光伟. 野败型杂交水稻恢复基因的遗传机理研究进展. 西南农业学报，1998，11(4)：110～117.
[2]李平，周开达，陈 英等. 利用分子标记定位水稻野败型核质互作雄性不育恢复基因. 遗传学报，1996，23(5)：357～362.
[3]Yao F Y, XU C G, YU S B et al. Mapping and genetic analysis of two fertility restorer loci the wide朼bortive cytoplasmic male sterility system of rice (Oryza sativa L.). Euphytica, 1997, 98:183～187.
[4]Zhang G, Bharaj T S, Lu Y et al. Mapping of the Rf3 nuclear fertility restoring gene for WA cytoplasmic male sterility in rice using RAPD and RFLP markers. TAG, 1997, 94:27～33.
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[5]Tan X L, Vanavichit A, Amornsilpa S et al. Genetic analysis of rice CMS-WA fertility restoration based on QTL mapping. TAG, 1998, 97(5/6):994～999.
[6]Zebeau M, Vos P. Selective restriction fragment arnplification: a general method for DNA fingerprinting. European Patent Appliction No.0534 858 A1, 1993.
[7] 邱 芳，伏健民，金德敏等. 遗传多样性的分子检测. 生物多样性，1998，6(2)：143～150.
[8] McCouch S P, Kochert G, Yu Z H et al. Molecular mapping of rice chromosomes. TAG, 1988, 76:815～829.
[9] 陆朝福，李晓兵，朱立煌等. 用PCR技术诊断水稻的白叶枯病抗性. 遗传学报，1996，23(2)：110～116.
[10] Huang N. Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice: markeraided selection using RFLP and PCR. TAG, 1997, 95:313～320., 百拇医药
单位：何光华 裴炎 杨光伟 唐梅 侯磊(西南农业大学生物技术中心，重庆北碚 400716)；谢戎 杨正林 李永洪 何光华(四川省农业科学院水稻高粱研究所，泸州 646100)
关键词：野败型；杂交水稻；恢复基因；AFLP标记
遗传学报000404
摘要：选择汕优63 F2的高可育株和高不育株分别建立2个基因池，利用AFLP标记技术对2池间的多态性进行了研究。分析表明，64组引物在两池间全部扩增出了稳定、清晰的带纹，共计3477条带。多数引物在基因池间未呈现多态性，只有引物组合E-AGC/M-CAA在基因池间表现多态性，用双亲、F1、F2单株以及生产和育种上的骨干不育系与恢复系验证均表明这组引物所揭示的多态性片段与恢复基因有关(命名为AP1)。AP1为单拷贝，与恢复基因间的距离为4.76cM。
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AFLP Markers of Restoring Genes of the Wild-Abortive Hybrid Rice
HE Guang-Hua, PEI Yan, YANG Guang-Wei, TANG Mei,HOU Lei
(Center of Biotechnology, Southwest Agricultural University, Chongqing 400716, China)
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(Rice and Sorghum Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Luzhou 646100, China)
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Abstract: Fertile and sterile pools were set up by bulked segregant analysis (BSA) based on the selection for the highly fertile and highly sterile plants of Shanyou 63 F2population The AFLP analysis of the two pools indicated that 64 primer combinations amplified 3 477 stable and clear bands. Exception of the combination E-AGC/M-CAA,all primer combinations had not detected polymorphism between the two pools. It was proved by investigation of two parents, individuals of F2 segregant population, backbone sterile lines and restorer lines that the polymorphic fragment AP1 generated from the primer E-AGC/M-CAA was associated with the restoring gene. AP1 was a single copy detected by Southern blot hybridization. The distance between AP1 and the restoring gene was 4.76cM.
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Key words: wild-abortive; hybrid rice; restoring gene; AFLP marker
植物雄性不育一般分为“细胞核不育”、“细胞质不育”和“质核互作不育”3种类型，目前在生产上大面积使用的是“质核互作不育”类型(如水稻、玉米等)。我国1973年在世界上首次成功地实现了杂交水稻“三系”配套，并在生产上得到了广泛应用，已累计推广近2亿公顷，为我国乃至世界的粮食增产作出了巨大贡献。其中野败型不育胞质使用最多、推广面积最大，占总面积的90%以上。杂交水稻能应用的关键之一就是要求F1具有高的结实率，这一特性是由恢复系所具有的恢复基因决定的。由于它在“三系”杂种优势利用中具有极其重要的地位，其研究历来受到广泛关注[1]。
随着分子标记技术的出现和发展，由于分子标记技术所具有的显著优越性，可对恢复基因进行深入研究。已有一些学者利用RAPD、RFLP等技术在这一领域开展了研究[2～5]，但未得出统一结论。分子标记技术的发展非常迅速，自1980年RFLP提出以来，已先后有20多种技术出现。但1993 Zebeau和Vos[6]发展起来的扩增片段长度多态性(AFLP)技术被认为是一种有效的分子标记，既有RFLP的可靠性，又有RAPD的方便性[7]。因此，本研究采用该技术对野败型恢复基因的分子标记进行研究。
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1 材料和方法
1.1 基础群体的构建
1996年夏在泸州配制珍汕97A/明恢63(汕优63)，同年秋海南繁殖F1，并对F1进行单株套袋，成熟时单株收获F1种子。1997年种植F2，苗期剪取幼嫩叶片提取DNA，成熟时分别考查各株结实率。由于汕优63 F2细胞质来源于珍汕97A，全部F2单株均含有不育胞质，凡是结实正常的植株均含有恢复基因、不育株均不含恢复基因，据此建立以下基因池群体：选取高结实的15个单株等量混合DNA构成可育池，简称F池；选取高不育的15个单株等量混合DNA构成不育池，简称S池。
1.2 实验方法
1.2.1 DNA的提取与纯化叶片DNA的提取参照McCouch[8]的方法进行。
1.2.2 AFLP分析首先分别对基因池进行AFLP分析，然后根据实验结果进行验证。AFLP分析参照AFLPTM试剂盒(Instruction manual，1997)说明书进行。采用了8个E端引物(AAC，AAG，ACA，ACC，ACG，ACT，AGC，AGG)和8个M端引物(CAA，CAC，CAG，CAT，CTA，CTC，CTG，CTT)，构成64组引物对。
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酶切基因组DNA：25μl反应体系中含有超纯水14μl, 5×reaction buffer 5l, Sample DNA 4l(含DNA约0.2μg)，内切酶EcoRI和MseI 2μl(各3U)，混匀，用封口膜封口后于37℃酶切2h, 70℃ 15min灭活酶。
人工接头连接：在酶切后的DNA中，于冰上加入人工接头24μl、T4 DNA连接酶1μl，缓慢混匀，置于20℃保温2h，即得到AFLP中PCR反应的模板DNA。
预扩增：25μl反应体系中含预扩增Mix 20μl, PCR buffer for AFLP 2.5μl, Taq DNA聚合酶1U，模板DNA 2.5μl。预扩增时EcoRI端将A作为选择扩增碱基，Mse端将C作为选择扩增碱基。反应扩增条件为：94℃ 30s, 56℃ 1min, 72℃ 1min, 20个循环。
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标记引物：10μl反应体系中含一种E端引物3.6μl, 5×T4 Kinase buffer 2μl,[γ-32P]ATP 1.5μl, ddH2O 2.4μl, T4 Kinase 0.5μl。37℃反应1h，70℃温浴10min。
选择性扩增：20μl反应体系中含有标记的E端引物4.5μl, AFLP杇rade water 12.5μl,10×PCR buffer for AFLP 2μl, Taq DNA聚合酶1l(1U/l)。在EcoR端和Mse端分别选用2个碱基作为选择扩增碱基。扩增条件为：94℃ 30s, 65℃ 30s, 72℃ 1min, 1个循环；94℃ 30s, 65℃～56℃ 30s(每个循环温度下降约0.7℃), 72℃ 1min, 12个循环；94℃ 30s, 56℃ 30s, 72℃ 1min, 23个循环。
扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：凝胶置-70℃放射自显影2～7d后，观察结果并摄影。
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1.2.3 特征片段的回收纯化 在放射自显影时，将X光片与凝胶对齐，并作好标记。显影后再对齐，用干净刀片在特征片段位置将凝胶回收入1.5ml管中，加入1ml TE, 15min后，倾出TE，再加入1ml TE(内含100mmol/L NaCl)，煮沸10min。室温下冷却过夜，即得纯化DNA，置于4℃备用。
1.2.4 Southern杂交 用地高辛标记探针，真空转移DNA，Southern杂交参照《分子克隆实验指南》进行。
2 结果与分析
2.1 明恢63与珍汕97A间的多态性
采用15对E端与M端引物组合分析了明恢63与珍汕97A间的多态性，结果表明，AFLP扩增带纹非常稳定、清晰，15对引物共扩增出了815条带，平均每个引物扩增54.33条带，289条表现为多态性，多态性频率为35.46%。说明AFLP技术可以用于本实验研究。
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2.2 与恢复基因相关的分子标记筛选
由于15组引物中每组引物均能在双亲间扩增出多态性，因此我们首先在基因池间寻找多态性，采用了64组引物对基因池进行筛选。结果所有的引物都能稳定扩增出清晰带纹，一般能扩增出50～100条带，64组引物共计扩增出了3 477条带，经过反复验证，多数引物在基因池间不存在多态性差异，只有引物E-AGC/MC-AA在基因池间稳定扩增出差异带，可育池比不育池多1条带(图1)，命名为AP1。由于两基因池间除恢复性存在差异外，其他性状无差异，因此推测该差异片段可能与恢复基因有关。为了确证该片段是否与恢复基因连锁，我们进行了以下验证。
图1 基因池、亲本、F1的多态性
(引物为E-AGC/M-CAA)
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F：可育池；S：不育池；P1：明恢63；P2：珍97A；F1：汕优63
Fig.1 AFLP patterns amplified with primers E-AGC/M-CAA of the fertile and sterile pools ,the parents Minhui 63 and Zhenshan 97A,F1 hybrids Shanyou 63.The polymorphic DNA fragment AP1 putatively associating with the restoring gene is indicated by arrow
F:Fertile pools; S:Sterile pools; P1:Minghui 63; P2:Zhenshan 97A; F1:Shanyou 63
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2.3 特征片段验证
2.3.1 筛选片段的双亲验证 明恢63细胞核具有恢复基因，而珍汕97A含不育基因，理论上两者在特征片段位置上应存在差异。用上述筛选的引物E-AGC/MC-AA对珍汕97A、明恢63进行了验证，结果能在珍汕97A和明恢63间同一位置表现出差异，明恢63具有特征带，而珍汕97A无。说明该组引物在双亲间也表现出多态性(图1)。汕优63是明恢63与珍汕97A的杂交1代，具有明恢63与珍汕97A的细胞核，细胞质来源于珍汕97A，由于汕优63表现高结实性，具有恢复基因，也应具有该特征片段，从图1上也证明了这一点。
2.3.2 筛选片段的恢复系、不育系验证 选取育种上和生产上的7个能恢复野败不育系的骨干恢复系，7个能被明恢63恢复的不育系进行AFLP分析，引物组合E-AGC/M-CAA显示，7个恢复系均具有该特征带，而7个不育系均无此带(图2)，进一步表明所筛选的特征片段可能与恢复基因有关。
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图2 特征片段的恢复系与不育系验证(E-AGC/M-CAA)
F：可育池；S：不育池；1～7：恢复系；8～14：不育系
Fig.2 AFLP patterns of fragment AP1 amplifiedwith primer E-AGC/M-CAA in fertile and sterile lines for verification
F: Fertile pools; S: Sterile pools; 1～7:Restorer lines;8～14:Strile lines
2.3.3 筛选片段的单株验证及与恢复基因间的分子图谱距离 要确定特征片段是否与恢复基因有关，分离群体的单株验证是非常重要的。用所获得的特征片段引物(E-AGC/MC-AA)对73个F2单株进行了验证，结果显示(图3为其中的一部分)，在特征片段位置上，30株可育株均具有该特征片段，而43株不育株中39株无此特征片段，4株出现交换，说明该特征片段与恢复基因连锁。根据43株不育株的特征带情况，采用极大似然法计算得出该特征片段AP1与恢复基因间的距离为4.76cM。
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图3 引物组合E-AGC/M-CAA的F2单株验证
F、S同图1；1～33为F2单株，17～33为不育株，R为交换型
Fig.3 AFLP patterns amplified with primers E-AGC/M-CAA showing the specific fragment AP1 in individuals of F2 segregant population for verification.Fragment AP1 is indicated by jkarrow F、S: Same as the names in Fig.1; F2: Individuals of F2 segregant population
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2.4 特征片段的回收纯化及Southern杂交
将特征片段从变性聚丙烯酰胺凝胶上回收并纯化，再用E-AGC/MC-AA引物进行扩增，检测所回收的片段是否为目的片段。图4显示，回收片段与基因池间多态性位置完全一致，说明回收片段确为目的片段。用EcoR、Hind、BamH对明恢63和珍汕97A进行酶切，电泳后真空印迹到尼龙膜上，用回收纯化的特征片段为探针进行杂交，结果表明，该特征片段为单拷贝，但3个酶均未揭示出明恢63与珍汕97A间存在多态性(图5)。
图4 回收片段的再扩增
AP1：回收再扩增片段
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Fig.4 AFLP patterns of re-amplified fragment AP1 recovered from the denaturing polyacrylamide gel The re-amplified fragment AP1 is indicated by arrow
图5 特征片段的Southern杂交
Fig.5 Southern blot hybridization patterns with digoxigen-labelled AP1 between Minghui 63 and Zhenshan 97A digested with EcoRⅠ,Hind Ⅲ and BamHⅠ
1：EocRⅠ;2：Hind Ⅲ; 3：BamHⅠR：Minghui 63;A：Zhenshan 97A
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3 讨论
自从“三系”杂交水稻理论一提出，就开始了恢复基因的研究，到目前为止已有30余篇文献报道了恢复基因或恢复性的遗传研究结果。这些研究主要集中在育性指标的采用和划分、恢复基因的数目、恢复基因的等位性、恢复基因的效应、恢复基因的定位等经典遗传理论方面，取得了很好的效果。但由于不同研究者采用了不同的育性指标，以及这些指标的划分标准很不一致，加之育性指标受环境影响等原因，导致研究结果差异甚大[1]。由于分子生物学的迅速发展，分子标记技术的出现为进一步研究恢复基因的特性提供了强有力的手段和可能，目前已在这一方面开展了初步研究。Zhang等[4](1997)发现了6个RAPD阳性标记，结合RFLP技术，定位了3个标记与Rf3基因连锁，位于染色体1上，未发现与Rf4相关的标记。李平等[2]采用数量性状QTL定位原理，鉴别出了8个基因座位，其中有两个座位表现较强的作用，分别位于染色体3和4上。Yao等[3]认为两对恢复基因分别存在于染色体1和染色体10上。Tan等[5]找到了两个恢复基因座位，均位于染色体10上。我们利用AFLP技术，结合F2 BSA (Bulked Segregant Analysis)池，寻找到了1个标记，BSA法寻找标记的关键在于验证，我们经双亲、F1、F2单株、育种上的骨干恢复系和不育系验证均表明该标记与恢复基因相关。同时值得注意的是所用的7个骨干恢复系均能恢复野败不育胞质、7个骨干不育系均能被明恢63恢复，分析表明，该特征片段在它们之间也显示出多态性，7个恢复系均具有特征片段，而7个不育系均无此片段，暗示该标记可能在其他遗传背景中也成立。同时7个不育系为不同的胞质不育类型：冈型(籼细胞质)、K型(粳细胞质)、印尼水田谷型、野败型等，是否我们所筛选的标记为它们的共同标记？或在恢复基因群中这些不育胞质共同具有1对恢复基因？值得进一步深入研究。
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我们在AFLP操作中，发现有几个问题值得注意：(1)DNA酶切充分是关键，如果酶切不彻底，容易造成假阳性或假阴性；(2)防止DNA污染很重要，由于AFLP技术涉及两次扩增，因此痕量DNA污染将对结果造成较大影响，容易产生假阴性，甚至可能在基因池间找不出多态性；(3)在采用BSA池法寻找多态性时，AFLP与RAPD和RFLP等技术不同，通常在使用RAPD或RFLP技术时，首先对双亲间的多态性进行检测，当寻找到多态性引物或探针时，再将其用在BSA池间，以进一步筛选出与目标性状相关的标记。而AFLP则不同，每个引物能扩增出50～100条带，远远多于其他标记，正如在本实验中，15对引物都能在亲本间扩增出多态性，首先对亲本进行分析是无效的，因此建议先对BSA池进行分析，当获得多态性引物时，再用亲本进行验证；(4)由于AFLP涉及到酶切和扩增，提取DNA时的残留物质会有影响，因此要求DNA的提取质量要好。
获得与目标性状相连锁的分子标记后，重要应用之一便是分子标记辅助育种。这一技术已在水稻白叶枯病上取得了成功[9，10]。水稻恢复基因的辅助选择可采取这样的方法，将AFLP标记进行回收、克隆，测定片段两端100bp碱基序列，合成两对20～24bp的核苷酸引物，将AFLP标记转化为PCR标记后，对杂交分离群体后代进行单株鉴定，即可区分出哪些植株含有恢复基因、哪些植株不具有恢复基因，从而达到辅助育种之目的。这方面的研究我们正在进行当中。
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参考文献
[1]何光华，裴 炎，杨光伟. 野败型杂交水稻恢复基因的遗传机理研究进展. 西南农业学报，1998，11(4)：110～117.
[2]李平，周开达，陈 英等. 利用分子标记定位水稻野败型核质互作雄性不育恢复基因. 遗传学报，1996，23(5)：357～362.
[3]Yao F Y, XU C G, YU S B et al. Mapping and genetic analysis of two fertility restorer loci the wide朼bortive cytoplasmic male sterility system of rice (Oryza sativa L.). Euphytica, 1997, 98:183～187.
[4]Zhang G, Bharaj T S, Lu Y et al. Mapping of the Rf3 nuclear fertility restoring gene for WA cytoplasmic male sterility in rice using RAPD and RFLP markers. TAG, 1997, 94:27～33.
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[5]Tan X L, Vanavichit A, Amornsilpa S et al. Genetic analysis of rice CMS-WA fertility restoration based on QTL mapping. TAG, 1998, 97(5/6):994～999.
[6]Zebeau M, Vos P. Selective restriction fragment arnplification: a general method for DNA fingerprinting. European Patent Appliction No.0534 858 A1, 1993.
[7] 邱 芳，伏健民，金德敏等. 遗传多样性的分子检测. 生物多样性，1998，6(2)：143～150.
[8] McCouch S P, Kochert G, Yu Z H et al. Molecular mapping of rice chromosomes. TAG, 1988, 76:815～829.
[9] 陆朝福，李晓兵，朱立煌等. 用PCR技术诊断水稻的白叶枯病抗性. 遗传学报，1996，23(2)：110～116.
[10] Huang N. Pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice: markeraided selection using RFLP and PCR. TAG, 1997, 95:313～320., 百拇医药