细菌mtl-D朌基因的克隆及在转基因八里庄杨中的表达
作者：刘凤华 孙仲序 崔德才 杜保兴 王春荣 陈受宜
单位：刘凤华 杜保兴 陈受宜(中国科学院遗传研究所， 北京 100101)；孙仲序 崔德才 王春荣(山东农业大学， 山东泰安 271000)
关键词：大肠杆菌mtl朌基因；八里庄杨；转基因植株；分子鉴定；耐盐性
遗传学报000508
摘要： 运用PCR方法克隆了大肠杆菌1-磷酸甘露醇脱氢酶(mtl-D)基因，序列分析表明与已发表序列相比，除第416位密码子由AAA代替CAT、相应的氨基酸由Lys代替His外，其他部分均相同。该基因插入植物双元载体中，经土壤农杆菌介导导入八里庄杨[1]，经卡那霉素筛选后再经盐胁迫筛选获得一批较高耐盐性的转化植株，在附加0.6%NaCl的培养基中生长良好，而对照在附加0.4% NaCl的培养基中不能存活。对转化植株进行的PCR检测、Northern杂交，说明外源基因已整合到染色体上并且有转录。
, http://www.100md.com
中图分类号： Q943 文献标识码： A 文章编号： 0379-4172(2000)05-0428-06
Cloning of E. coli mtl-D Gene and Its Expression
in Transgenic Balizhuangyang (Populus)
LIU FengHua, DU BaoXing,CHEN ShouYi
(Institute of Genetics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)
SUN ZhongXu, CUI DeCai, WANG ChunRong
, http://www.100md.com (Shandong Agriculture University, Shandong 271000, China)
Abstract: E. coli 1-phosphate mannitol dehydrogenase gene (mtl-D) was cloned using PCR method. Sequence analysis showed that the gene was the same as the published one except that codon CAT at position 416 was replaced by AAA and resulted in a Lys residue instead of His. This gene (mtl-D) was inserted in a binary vector and transformed into populas via agrobacteria. Several transgenic plants grow very well in 0.6% NaCl while controls can not survive even in 0.4% NaCl. PCR analysis and Northern blotting indicated that foreign gene was integrated into the genome of transgenic plant and transcribed successfully.
, http://www.100md.com
Key words: mtl-D gene of E. coli; transgenic Balizhuangyang (Populus); transgenic
plant; molecular identification; salt-tolerance gene of E. coli; transgenic Balizhuangyang (Populus); transgenic
plant; molecular identification; salt-tolerance
限制植物生长的非生物因素有干旱、盐碱、低温等，其中尤以干旱和盐碱为甚[2]。大多数生物在干旱和盐碱胁迫下积累一些小分子有机物如季胺类、多元醇类和糖醇等以调节细胞渗透压，这些化合物广泛存在于细菌、真菌、藻类、植物及哺乳动物中。1992年Michell等将大肠杆菌来源的1-磷酸甘露醇脱氢酶基因转化烟草[3]，提高了转基因烟草的耐盐性，刘俊君等将该基因导入烟草、玉米也获得了高耐盐性转基因植株[4]。
, http://www.100md.com
本文用PCR方法克隆了大肠杆菌1-磷酸甘露醇脱氢酶(mtl-D,EC1.1.1.17)基因导入八里庄杨，对转基因植株进行了分子鉴定、耐盐性检测及盐胁迫下细胞膜渗透测定。
1 材料和方法
1.1 材料
八里庄杨(Populus×Xiao Zhannica, cv. “Balizhuangyang”)产于山东，山东农业大学提供。
Taq DNA聚合酶由本组自制，其他核酸工具酶购自Boebringer Mannheim公司，α-32P-dNTP为NEN公司产品，PCR引物由本组合成，双元载体pBin438由方荣祥教授惠赐，大肠杆菌及各种质粒由本实验室提供。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 DNA提取 细菌DNA提取和纯化按Sambrook方法进行[5]，植物总DNA提取按以前报
道的方法[6]。
1.2.2 mtl朌基因的PCR扩增及克隆 根据已报道的大肠杆菌mtl朌基因序列设计引物，为方便亚克隆在5′端分别设计了BamHⅠ和KpnⅠ的识别位点。
引物1 5′AGAGGATCCAGGTTAATACTATGAAAG；
引物2 5′TGACTAGCGACTGTTTCCATGGTCGG。
PCR扩增反应在25l体积中进行，内含E. coli DNA 25ng, 反应缓冲液(10mol/L Tris朒Cl pH8.3, 50mmol/L KCl, 2mmol/L MgCl2), dNTP各200mol/L，引物各加0.2mmol /L, Taq DNA聚合酶1U，覆盖25l液体石蜡，反应物预变性3min，接着进行92℃ 1min; 54℃ 1min; 72℃ 2min;循环35周期，经琼脂糖凝胶电泳检查后用Gene Clean Kit回收扩增片段，以pUC19为
, 百拇医药
载体扩增片段克隆于E. coli JM 83中。
1.2.3 DNA序列分析 序列反应用ABI公司的Taq Dye Primer Cyde Sequencing Kit,反应在PE Genamp PCR System 9600上进行，序列反应在ABI Sequencer上完成。
1.2.4 植物表达载体的构建和农杆菌转化 mtl朌基因植物表达载体的构建按常规方法进行(图1)，双元表达载体pBin438含有双重35S启动子和翻译增强子TMV的“”片段，用BamHI和KpnI将mtl-D基因从克隆在pUC19质粒中切出来后插入pBin438中，得到的表达质粒再直接转化农杆菌LBA4404[7]。
图1 植物表达载体简图
, 百拇医药
Fig.1 Structure of bionary vector
1.2.5 八里庄杨的转化、再生和筛选 将培养过夜的农杆菌经稀释后感染生长旺盛的八里庄杨分生组织，在暗室中培养5d，再在含15mg/L卡那霉素的分化培养基中筛选，得到抗卡那霉素的绿芽，3周后再将芽分别转至含20mg/L卡那霉素的生长培养基中筛选2次，再生小植株(图2)。
图2 转基因八里庄杨及对照在含20mg/L卡那霉素的生根培养基中的生长情况(C是对照)
Fig.2 Rooting condition of poplar of Balizhuang and control in MS medium containing 20ml/L Kan(C is control)
, 百拇医药
1.2.6 转化植株的耐盐性筛选 转化植株的耐盐性筛选在MS培养基中分别添加0.2%～1.0% NaCl进行(MS培养基中盐浓度为0.45%)。
1.2.7 转基因植株的分子检测 PCR检测(图3)及Northern杂交检测(图4)按常规进行[5]。
图3 转化植株的PCR检测
4：A18；6：标准分子量
Fig.3 PCR analysis of transgenic poplar of Balizhuang
4:A18;6:DNA marker
, 百拇医药
图4 转基因八里庄杨的Northem杂交分析
Fig.4 Northem analysis of transgenic poplar
1.2.8 植物大分子渗漏值的测定 根据Leopeld(1987)方法略加修改进行[8]，每个样品用打孔器自叶片钻取10个圆片(φ＝0.35cm)，加入超纯水2ml，室温下40rpm振荡4h后，紫外比色测定OD254，得到的是总渗漏值(表1)。
表1 转基因八里庄杨和大分子渗漏值
Table 1 Memerane pemeability of transgenic poplar of Balizhuang 植株号
Number of plants
, 百拇医药
CK
1
2
3
4
5
大分子渗漏值
Leakage rate of micromolecules
0.628
0.625
0.320
0.611
0.436
, http://www.100md.com
0.605
2 结果
2.1 mtl朌基因的克隆和序列分析
参照已报道的mtl朌基因的修正序列[7]，设计了2个用于PCR扩增的引物，为了便于对克隆序列的遗传操作，在引物的5′端和3′端分别设计了Bam HI和KpnI的识别序列，用上述引物经PCR反应扩增得到约1.1kb的片段，序列分析表明，除416位密码子由AAA代替CAT外，其他序列与mtl朌基因修正序列相同(图5)，因此所克隆的片段是mtl朌基因的完整读码框架。
图5 mtl-D基因的序列分析
, 百拇医药
Fig.5 Sequence analysis of mtl-D gene
2.2 转化植株筛选和耐盐性测定
将上述双元植物表达载体转化八里庄杨分生组织块，经15mg/L卡那霉素筛选2次后，得到绿色的抗性芽，20d后将抗性芽转至含20mg/L卡那霉素生长培养基中，筛选2次后再转到含20mg/L卡那霉素的生根培养基中再生植株(图2)。
转化植株的耐盐性实验是在MS培养基中添加0.2%～0.6% NaCl进行的，图6显示在附加0.4%盐浓度下对照和转化植株生长情况，大多数转化植株能在附加0.4% NaCl的培养基中正常生长，而对照附加0.3% NaCl时有较明显盐害，当NaCl增至0.4%时，对照植株趋于死亡，当盐浓度达0.6%以上时，转基株受盐害明显，但仍优于对照(表2)，表明转化植株耐盐性有明显提高。
, http://www.100md.com
图6 转基因八里庄杨及其对照在含0.4%NaCl的培养基上的生长情况(C为对照)
Fig.6 Growth condition of transgenic poplar and control in MS medium containing 0.4% NaCl (Cis control)
表2 抗转化植侏的耐盐性实验
Table 2 Salt tolerant test of transgenic plantlet NaCl浓度
NaCl concentration
转化植株Transgenis plantlet
对照Control
, http://www.100md.com
供试材料数
Num.of plants
黄化数
Num.of chlorisis
黄化率
Chlorisis rate(%)
供试材料数
Num.of plants
黄化数
Num.of chlorisis
黄化率
Chlorisis rate(%)
, 百拇医药
0.3
42
8
19.05
43
38
87.5
0.4
40
9
22.5
45
42
, 百拇医药 93.21
0.5
44
15
34.1
46
45
97.8
0.6
34
16
47.06
43
, http://www.100md.com 43
100
0.8
36
26
72.22
34
34
100
1.0
32
28
87.5
31
, 百拇医药
31
100
2.3 转化八里庄杨的分子检测
经过耐盐性筛选的10株转化八里庄杨的PCR检测(图3)和Northern杂交分析(图4)，可见经盐胁迫筛选到的耐盐转化植株除了A18外都有mtl朌基因插入和表达。
3 讨论
3.1 本实验所用的报告基因为NPTⅡ基因，所以外植体是否具有对卡那霉素抗性便成为一种选择标记。但不同植物材料和不同外植体类型对卡那霉素的抗性强弱也不相同。本实验筛选压力梯度实验表明，未转化外植体在50mg/L Kan筛选条件下，可使愈伤组织生长显著受阻，3周内全部失绿，白化死亡，且无分化发生。转基因八里庄杨叶片外植体可以在含50mg/L Kan的选择培养基上正常出芽，出芽时间较正常培养基上的对照略为迟缓，但分化频率无明显变化，30d后统计出芽率为53.26%。另外，转化植株能在含15mg/L Kan的培养基上生根，而对照在同样培养基上却无一生存。经卡那霉素抗性实验筛选得到的植株，移至补充有0.3%～1%NaCl的MS培养基中作进一步筛选。以未转化植株为对照，从含0.6% NaCl的培养基中筛选到14株耐盐性明显提高的转化植株(表2)。选出的14株植株的进一步分子鉴定说明它们的耐盐性并非由组培过程中产生突变或由于胁迫所产生的适应性所致。
, 百拇医药
3.2 糖醇作为渗透调节剂其分子机制尚不完全清楚，有人认为当细胞质中电解质含量低于液泡时，糖醇起着调节细胞质渗透势的作用，或者当电解质浓度很高时保护膜和蛋白质，无论哪一种作用，渗透调节剂均位于细胞质中，本文以细胞膜大分子总泄漏率为指标说明转基因植株在盐胁迫下细胞膜所受影响小于对照。看来，甘露醇在高离子强度时对细胞膜有保护作用。
3.3 植物基因工程一般以烟草为模式植物，本实验发现在组培过程中随继代培养时间的增加，植株的耐盐性也有所增加，烟草的耐盐性较高，经继代培养后其耐盐性有时可高达1.5% NaCl，八里庄杨对盐胁迫比较敏感，在继代数代后仍不能在附加0.2% NaCl的培养基中正常生长，其耐盐性本底远低于烟草，且其转化频率也较高，看来用八里庄杨作为植物耐盐基因工程的模式植物更为适当。转基因八里庄杨的农艺性状及田间抗逆性实验正在进行中。
致谢： 作者感谢方荣祥教授惠赐植物表达载体。
, 百拇医药 国家863高技术计划资助(863-101-01-03-01)
参考文献
[1]陈维伦， 郭东升， 杨善英. 用组织培养快速繁殖八里庄杨的研究. 植物学集刊1， 1983， (1)： 135～138.
[2]张福锁. 见：环境胁迫与植物育种. 北京： 农业出版社， 1993， 330～335.
[3]Michell C T et al. Expression of a bacterial mtl-D gene in transgenic tobacco leads to production and accumulation of mannitol. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89: 2600～2604.
[4]刘俊君等. 转基因烟草的甘露醇合成和耐盐性. 生物工程学报， 1996， 2(2)： 206～210.
, http://www.100md.com
[5]Sambrook E F, Fintsh T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989.
[6]陈受宜等. 水稻抗盐突变体的分子生物学鉴定. 植物学报， 1991， 33： 569～573.
[7]李太元， 田颖川， 秦晓峰. 高效抗虫转基因的研究. 中国科学(B辑)， 1994， 24(3)： 276～283.
[8]Davis T, Yamada M, Elgorl M et al. Nucleotide sequence of the mannitol (mtl) operon in Escherichia coli. Journal of Mol. Microbiol., 1989, 2: 205～412.
[9]Lepold A C, R P. In： Willing Toenniessen GH (eds). Salinity Tolerance in plants. Wiley, New York: 1984, 67.
1999-05-14
1999-09-24, http://www.100md.com
单位：刘凤华 杜保兴 陈受宜(中国科学院遗传研究所， 北京 100101)；孙仲序 崔德才 王春荣(山东农业大学， 山东泰安 271000)
关键词：大肠杆菌mtl朌基因；八里庄杨；转基因植株；分子鉴定；耐盐性
遗传学报000508
摘要： 运用PCR方法克隆了大肠杆菌1-磷酸甘露醇脱氢酶(mtl-D)基因，序列分析表明与已发表序列相比，除第416位密码子由AAA代替CAT、相应的氨基酸由Lys代替His外，其他部分均相同。该基因插入植物双元载体中，经土壤农杆菌介导导入八里庄杨[1]，经卡那霉素筛选后再经盐胁迫筛选获得一批较高耐盐性的转化植株，在附加0.6%NaCl的培养基中生长良好，而对照在附加0.4% NaCl的培养基中不能存活。对转化植株进行的PCR检测、Northern杂交，说明外源基因已整合到染色体上并且有转录。
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中图分类号： Q943 文献标识码： A 文章编号： 0379-4172(2000)05-0428-06
Cloning of E. coli mtl-D Gene and Its Expression
in Transgenic Balizhuangyang (Populus)
LIU FengHua, DU BaoXing,CHEN ShouYi
(Institute of Genetics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)
SUN ZhongXu, CUI DeCai, WANG ChunRong
, http://www.100md.com (Shandong Agriculture University, Shandong 271000, China)
Abstract: E. coli 1-phosphate mannitol dehydrogenase gene (mtl-D) was cloned using PCR method. Sequence analysis showed that the gene was the same as the published one except that codon CAT at position 416 was replaced by AAA and resulted in a Lys residue instead of His. This gene (mtl-D) was inserted in a binary vector and transformed into populas via agrobacteria. Several transgenic plants grow very well in 0.6% NaCl while controls can not survive even in 0.4% NaCl. PCR analysis and Northern blotting indicated that foreign gene was integrated into the genome of transgenic plant and transcribed successfully.
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Key words: mtl-D gene of E. coli; transgenic Balizhuangyang (Populus); transgenic
plant; molecular identification; salt-tolerance gene of E. coli; transgenic Balizhuangyang (Populus); transgenic
plant; molecular identification; salt-tolerance
限制植物生长的非生物因素有干旱、盐碱、低温等，其中尤以干旱和盐碱为甚[2]。大多数生物在干旱和盐碱胁迫下积累一些小分子有机物如季胺类、多元醇类和糖醇等以调节细胞渗透压，这些化合物广泛存在于细菌、真菌、藻类、植物及哺乳动物中。1992年Michell等将大肠杆菌来源的1-磷酸甘露醇脱氢酶基因转化烟草[3]，提高了转基因烟草的耐盐性，刘俊君等将该基因导入烟草、玉米也获得了高耐盐性转基因植株[4]。
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本文用PCR方法克隆了大肠杆菌1-磷酸甘露醇脱氢酶(mtl-D,EC1.1.1.17)基因导入八里庄杨，对转基因植株进行了分子鉴定、耐盐性检测及盐胁迫下细胞膜渗透测定。
1 材料和方法
1.1 材料
八里庄杨(Populus×Xiao Zhannica, cv. “Balizhuangyang”)产于山东，山东农业大学提供。
Taq DNA聚合酶由本组自制，其他核酸工具酶购自Boebringer Mannheim公司，α-32P-dNTP为NEN公司产品，PCR引物由本组合成，双元载体pBin438由方荣祥教授惠赐，大肠杆菌及各种质粒由本实验室提供。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 DNA提取 细菌DNA提取和纯化按Sambrook方法进行[5]，植物总DNA提取按以前报
道的方法[6]。
1.2.2 mtl朌基因的PCR扩增及克隆 根据已报道的大肠杆菌mtl朌基因序列设计引物，为方便亚克隆在5′端分别设计了BamHⅠ和KpnⅠ的识别位点。
引物1 5′AGAGGATCCAGGTTAATACTATGAAAG；
引物2 5′TGACTAGCGACTGTTTCCATGGTCGG。
PCR扩增反应在25l体积中进行，内含E. coli DNA 25ng, 反应缓冲液(10mol/L Tris朒Cl pH8.3, 50mmol/L KCl, 2mmol/L MgCl2), dNTP各200mol/L，引物各加0.2mmol /L, Taq DNA聚合酶1U，覆盖25l液体石蜡，反应物预变性3min，接着进行92℃ 1min; 54℃ 1min; 72℃ 2min;循环35周期，经琼脂糖凝胶电泳检查后用Gene Clean Kit回收扩增片段，以pUC19为
, 百拇医药
载体扩增片段克隆于E. coli JM 83中。
1.2.3 DNA序列分析 序列反应用ABI公司的Taq Dye Primer Cyde Sequencing Kit,反应在PE Genamp PCR System 9600上进行，序列反应在ABI Sequencer上完成。
1.2.4 植物表达载体的构建和农杆菌转化 mtl朌基因植物表达载体的构建按常规方法进行(图1)，双元表达载体pBin438含有双重35S启动子和翻译增强子TMV的“”片段，用BamHI和KpnI将mtl-D基因从克隆在pUC19质粒中切出来后插入pBin438中，得到的表达质粒再直接转化农杆菌LBA4404[7]。
图1 植物表达载体简图
, 百拇医药
Fig.1 Structure of bionary vector
1.2.5 八里庄杨的转化、再生和筛选 将培养过夜的农杆菌经稀释后感染生长旺盛的八里庄杨分生组织，在暗室中培养5d，再在含15mg/L卡那霉素的分化培养基中筛选，得到抗卡那霉素的绿芽，3周后再将芽分别转至含20mg/L卡那霉素的生长培养基中筛选2次，再生小植株(图2)。
图2 转基因八里庄杨及对照在含20mg/L卡那霉素的生根培养基中的生长情况(C是对照)
Fig.2 Rooting condition of poplar of Balizhuang and control in MS medium containing 20ml/L Kan(C is control)
, 百拇医药
1.2.6 转化植株的耐盐性筛选 转化植株的耐盐性筛选在MS培养基中分别添加0.2%～1.0% NaCl进行(MS培养基中盐浓度为0.45%)。
1.2.7 转基因植株的分子检测 PCR检测(图3)及Northern杂交检测(图4)按常规进行[5]。
图3 转化植株的PCR检测
4：A18；6：标准分子量
Fig.3 PCR analysis of transgenic poplar of Balizhuang
4:A18;6:DNA marker
, 百拇医药
图4 转基因八里庄杨的Northem杂交分析
Fig.4 Northem analysis of transgenic poplar
1.2.8 植物大分子渗漏值的测定 根据Leopeld(1987)方法略加修改进行[8]，每个样品用打孔器自叶片钻取10个圆片(φ＝0.35cm)，加入超纯水2ml，室温下40rpm振荡4h后，紫外比色测定OD254，得到的是总渗漏值(表1)。
表1 转基因八里庄杨和大分子渗漏值
Table 1 Memerane pemeability of transgenic poplar of Balizhuang 植株号
Number of plants
, 百拇医药
CK
1
2
3
4
5
大分子渗漏值
Leakage rate of micromolecules
0.628
0.625
0.320
0.611
0.436
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0.605
2 结果
2.1 mtl朌基因的克隆和序列分析
参照已报道的mtl朌基因的修正序列[7]，设计了2个用于PCR扩增的引物，为了便于对克隆序列的遗传操作，在引物的5′端和3′端分别设计了Bam HI和KpnI的识别序列，用上述引物经PCR反应扩增得到约1.1kb的片段，序列分析表明，除416位密码子由AAA代替CAT外，其他序列与mtl朌基因修正序列相同(图5)，因此所克隆的片段是mtl朌基因的完整读码框架。
图5 mtl-D基因的序列分析
, 百拇医药
Fig.5 Sequence analysis of mtl-D gene
2.2 转化植株筛选和耐盐性测定
将上述双元植物表达载体转化八里庄杨分生组织块，经15mg/L卡那霉素筛选2次后，得到绿色的抗性芽，20d后将抗性芽转至含20mg/L卡那霉素生长培养基中，筛选2次后再转到含20mg/L卡那霉素的生根培养基中再生植株(图2)。
转化植株的耐盐性实验是在MS培养基中添加0.2%～0.6% NaCl进行的，图6显示在附加0.4%盐浓度下对照和转化植株生长情况，大多数转化植株能在附加0.4% NaCl的培养基中正常生长，而对照附加0.3% NaCl时有较明显盐害，当NaCl增至0.4%时，对照植株趋于死亡，当盐浓度达0.6%以上时，转基株受盐害明显，但仍优于对照(表2)，表明转化植株耐盐性有明显提高。
, http://www.100md.com
图6 转基因八里庄杨及其对照在含0.4%NaCl的培养基上的生长情况(C为对照)
Fig.6 Growth condition of transgenic poplar and control in MS medium containing 0.4% NaCl (Cis control)
表2 抗转化植侏的耐盐性实验
Table 2 Salt tolerant test of transgenic plantlet NaCl浓度
NaCl concentration
转化植株Transgenis plantlet
对照Control
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供试材料数
Num.of plants
黄化数
Num.of chlorisis
黄化率
Chlorisis rate(%)
供试材料数
Num.of plants
黄化数
Num.of chlorisis
黄化率
Chlorisis rate(%)
, 百拇医药
0.3
42
8
19.05
43
38
87.5
0.4
40
9
22.5
45
42
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0.5
44
15
34.1
46
45
97.8
0.6
34
16
47.06
43
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0.8
36
26
72.22
34
34
100
1.0
32
28
87.5
31
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2.3 转化八里庄杨的分子检测
经过耐盐性筛选的10株转化八里庄杨的PCR检测(图3)和Northern杂交分析(图4)，可见经盐胁迫筛选到的耐盐转化植株除了A18外都有mtl朌基因插入和表达。
3 讨论
3.1 本实验所用的报告基因为NPTⅡ基因，所以外植体是否具有对卡那霉素抗性便成为一种选择标记。但不同植物材料和不同外植体类型对卡那霉素的抗性强弱也不相同。本实验筛选压力梯度实验表明，未转化外植体在50mg/L Kan筛选条件下，可使愈伤组织生长显著受阻，3周内全部失绿，白化死亡，且无分化发生。转基因八里庄杨叶片外植体可以在含50mg/L Kan的选择培养基上正常出芽，出芽时间较正常培养基上的对照略为迟缓，但分化频率无明显变化，30d后统计出芽率为53.26%。另外，转化植株能在含15mg/L Kan的培养基上生根，而对照在同样培养基上却无一生存。经卡那霉素抗性实验筛选得到的植株，移至补充有0.3%～1%NaCl的MS培养基中作进一步筛选。以未转化植株为对照，从含0.6% NaCl的培养基中筛选到14株耐盐性明显提高的转化植株(表2)。选出的14株植株的进一步分子鉴定说明它们的耐盐性并非由组培过程中产生突变或由于胁迫所产生的适应性所致。
, 百拇医药
3.2 糖醇作为渗透调节剂其分子机制尚不完全清楚，有人认为当细胞质中电解质含量低于液泡时，糖醇起着调节细胞质渗透势的作用，或者当电解质浓度很高时保护膜和蛋白质，无论哪一种作用，渗透调节剂均位于细胞质中，本文以细胞膜大分子总泄漏率为指标说明转基因植株在盐胁迫下细胞膜所受影响小于对照。看来，甘露醇在高离子强度时对细胞膜有保护作用。
3.3 植物基因工程一般以烟草为模式植物，本实验发现在组培过程中随继代培养时间的增加，植株的耐盐性也有所增加，烟草的耐盐性较高，经继代培养后其耐盐性有时可高达1.5% NaCl，八里庄杨对盐胁迫比较敏感，在继代数代后仍不能在附加0.2% NaCl的培养基中正常生长，其耐盐性本底远低于烟草，且其转化频率也较高，看来用八里庄杨作为植物耐盐基因工程的模式植物更为适当。转基因八里庄杨的农艺性状及田间抗逆性实验正在进行中。
致谢： 作者感谢方荣祥教授惠赐植物表达载体。
, 百拇医药 国家863高技术计划资助(863-101-01-03-01)
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