水稻第六染色体长臂亚端粒区遗传图与物理图的整合
作者：严长杰 王文明 翟文学 陈纯贤 郑先武 李晓兵 朱立煌
单位：严长杰(扬州大学农学院，江苏扬州 225009)；王文明 翟文学 陈纯贤 郑先武 李晓兵 朱立煌(中国科学院遗传研究所，北京 100101)
关键词：水稻；分子标记；细菌人工染色体(BAC)；跨叠克隆群(contig)；插入末端
遗传学报000504
摘要：生物染色体亚端粒区域在物种进化过程中是高度活跃的。为了认识水稻染色体亚端粒区 域的组织结构，用水稻第六染色体长臂亚端粒区的RFLP标记G342和R1167作探针筛选BAC文库，以得到的阳性BAC克隆为起点进行染色体步行，构建了覆盖这2个分子标记区域约500kb的BAC跨叠克隆群，将这一区域的遗传图和物理图进行了整合。对14个BAC克隆插入末端进行了亚克隆，鉴定的7个亚克隆末端为单拷贝或低拷贝序列，其中5个定位于G342和R1167的侧翼区域。用覆盖这一区域的BAC插入片段作探针对cDNA文库进行初步筛选，获得4个不同的阳性cDNA克隆。
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中图分类号：Q75 文献标识码：A 文章编号：0379-4172(2000)05-0400-09
Integration of the Genetic Map and the Physical Map of the Subterminal Region on the Longer Arm of Rice Chromosome 6
WANG WenMing ZHAI WenXue CHEN ChunXian ZHENG XianWu LI XiaoBing ZHU LiHuang
(Institute of Genetics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China)
YAN ChangJie
, http://www.100md.com
(Agronomical College, Yang zhou University, Yangzhou 225009, China)
Abstract: The region between RFLP markers G342 and R1167 was the subterminal part of the longer arm on the rice chromosome 6, because Shen et al. (1998) mappedtwo telomeric repeat associated sequences distal to G342. In order to integrate the genetic map and the physical map of the region, G342 and R1167 were firstly used to screen BAC library. Based on the positive clones detected by the two markers and chromosome walking by using the outer most insert-end of the overlapping clones, a contig containing 16 BAC clones which spanned 500kb was constructed. All the insert杄nds of the BAC clones could be amplified with thermal asymmetric interlaced PCR. Fourteen insert-ends were subcloned. Seven of them were identified as a single or low copy sequences and five were mapped on the expected sites flanking G342 or R1167. The insert fragment isolated from the minimum tile BAC clones of the contig was used to screen a cDNA library and four different positive clones were detected.
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Key words: rice; molecular marker; bacterial artificial chromosome; contig; insert end
水稻不仅是全世界主要的粮食作物之一，而且 因其具有基因组小、易于转化、遗传资源丰富等特 点而成为单子叶植物基因组研究的模式植物。Kurata等[1]利用YAC文库构建了水稻基因组的物理图谱，但在第六染色体长臂的物理图谱仅覆盖至分子标记R1608，位于该标记靠端侧的G342至染色体端部为一大的空白区；而其他以BAC文库为基础的物理图谱[2～4]也未达到这一区域。本实验室的Shen等[5]曾将两个端粒标记定位于G342侧翼，陈纯贤等也在比较作图中，将与小麦抗白粉病基因Pm20相关的分子标记Xpsr148定位于这一区域(据本实验室未发表资料，图1)。因此，这一区域的遗传图和物理图的整合，不仅有利于分析、克隆这一区域的基因，而且可以帮助我们进一步研究水稻中该区域与小麦基因组的关系。基于上述考虑，我们利用RFLP标记G342和R1167作探针，筛选 BAC文库，以得到的阳性BAC克隆为基础进行染色体步行，构建了覆盖RFLP标记G342和R1167区域的跨叠克隆群(contig)，将遗传图和物理图进行了整合，并获得4个不同的cDNA克隆。
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图1 水稻第六染色体长臂亚端粒区的局决遗传图(A)和物理图(B)
图体字表示本研究使用的分子标记,细横线下的数据表示图距(cM);粗横线表示BAC克隆.图A下B间的斜线表示物理图谱与遗传图谱的对应区域.美国的图谱引自Causse等[10],日本的图谱引自Harushima等[9]
Fig.1 Agenetic map(A) and its corresponding physical map(B)on the subterminal regionof the longer armof rice chromosome 6
Markers in bold letters indicate those used in the present experiment .Numbers under the thin line are map distance in centimorgans (Kosambi function).Thick lines stand for BAC clones.Lines between A and B shows the corresponding sites in the genetic map and the physical map.The partial genetic maps from those constructed by Causse et al.(1994)and harushima et al,(1998)are also listed for referance
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1 材料和方法
1.1 实验材料
研究中使用的2个水稻BAC文库的高密度膜及有关BAC克隆分别由菲律宾国际水稻研究所Yang等和美国Clemson大学Rod Wing等提供。窄叶青8号和京系17的加倍单倍体(DH)群体用于BAC插入末端的定位。
1.2 BAC文库的筛选
菌落杂交、阳性克隆的鉴定均按Yang等[3]的方法。
1.3 BAC插入末端的分离与亚克隆
用TAIL朠CR法[6]扩增BAC的2个末端，用Advantage PCR朠ure Kit (Clontech, USA)回收符 合要求的扩增片段，克隆到pGEM T easy载体中。分离BAC正向末端(F末端)的特异引物为：
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BF1： 5′-ACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3′；
BF2： 5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3′；
BF3： 5′-AGTCGACCTGCAGGCATGCA-3′。
分离BAC反向末端(R末端)的特异引物为：
BR1： 5′-TTCCGGCTCGTATGTTGTTGGG-3′；
BR2： 5′-AGCGGATAAACAATTTCACACAGGA-3′；
BR3： 5′-GGTGACACTATAGAATACTCA-3′。
按Liu等[6,7]的报道，分别合成并使用了6个任意简并引物，即：
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AD1： 5′-GAGNAGTANCAGAGA-3′；
AD2： 5′-GTGNAGAANCAAAGG-3′；
AD3：5′-ATCGNCNGANACGAA-3′；
AD4： 5′-CGTNCGNACNTAGGA-3′；
AD5： 5′-TCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3′；
AD6： 5′-GTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3′。
1.4 跨叠克隆的排列与染色体步行
用HindⅢ酶切BAC克隆，根据酶切模式排定跨叠克隆间的关系，用分离的BAC末端作探针进行Southern杂交验证。以位于contig最外测的2个末端作探针筛选BAC文库，得到的阳性克隆经末端分析验证并整合到contig中。染色体步行的方向通过BAC末端亚克隆在用窄叶青8号/京系17的DH群体构建的遗传图谱上的定位来确定。构建的contig覆盖长度通过测定BAC克隆的重叠程度和 插入片段的大小来确定。BAC克隆的重叠程度及插入大小通过比较BAC克隆的HindⅢ酶切和NotⅠ酶切检测。脉冲电泳(PFGE)条件：用1% Agarose朙E 凝胶，在0.5×TBE的缓冲液中，以6 V/cm 的电压、120度电泳角度、0.22～6.80s的脉冲时间，14℃下电泳15h。
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1.5 cDNA文库的筛选
用NotⅠ酶切BAC克隆，回收插入片段作探针，按标准的方法[8]筛选1个已建成的水稻cDNA文库(中国水稻研究所钱前博士提供)。
2 结果
2.1 RFLP标记G342和R1167的阳性克隆筛选
RFLP标记G342和R1167是日本Harushima等[9]构建的水稻遗传图谱上的分子标记，RG433是美国Causse等[10]构建的遗传图谱上的分子标记。本实验室在用南京11/巴里拉的DH群体构建的RFLP图谱上，将RG433和G342定位于同一位点； 另外，在用窄叶青8号/京系17的DH群体构建的RFLP图谱上，对R1167的定位结果与日本的图谱相似，并将G342和RG433定位在紧密连锁的2个位点(图1，A)。分别用这3个RFLP标记作探针在BAC文库中进行筛选，其中用G342和RG433作探针得到相同的4个阳性克隆，即43G4、 43N17、 45E6和14D21。这一结果进一步说明RG433和G342两个分子标记是紧密连锁的，物理距离不会超过这4个克隆间相互重叠的片段长度(约50kb)。用R1167对BAC文库进行筛选，也获得4个阳性克隆，即36P18、 20P22、 38M6和38N7(表1)。根据HindⅢ酶切模式对这些克隆进行排列及杂交分析，发现前4个克隆和后4个克隆形成2个独立的contig。
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表1 用RFLP标记及染色体步行鉴定的BAC克隆
Table 1 Positive BAC clones detected by RFLP markers and cloned insert-ends as markers for chromosome walking 标记
Marker
克隆名称
Clone name
本文编号
No.in this paper
插入大小
Insert size(kb)a)
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亚克隆末端
Subcloned insert-endb)
亚克隆插入大小
Subclone size (kb)
亚克隆拷贝数
Copy number of the insert-endc)
G342
45E6
10
100
R*
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0.8
1
14D21
11
100
43G4
12
65
43N17
13
80
F
1.0
, http://www.100md.com 1
R1167
20P22
1
115
F*
0.4
1
R
0.5
ND
38M6
2
70
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38N7
3
70
36P18
4
95
F*
0.5
1
43N17F
27O15
15
90
, 百拇医药 F*
0.4
2
29K24
14
80
14D23
16
105
F
0.4
1
R*
0.5
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2～3
36P18F
47H14
5
130
19F19
6
130
34F5
7
130
F
0.4
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ND
R
0.6
ND
48N23
8
137
F
0.7
ND
R
0.5
ND
45E6R
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7E5
9
140
F
0.4
ND
R
0.4
ND
a)BAC插入大小根据HindⅢ酶切(图3，A)或Not I酶切(图3，B)检测结果；b)F表示正向插入末端，R表示反向插入末端，带*号者为定位的末端；c)与窄叶青8号和京系17亲本经BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、EcorⅤ、HindⅢ、和XbaⅠ8种酶切杂交，最少的杂交带数视为拷贝数；ND：未确定
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a)The insert size of the BAC clones was estimated from the restrictive pattern digested by HindⅢ(Fig.3,A)or Not I(Fig.3,B);b)F for forward insert end and R for reverse end.Those with * were maped insert-ends.c)Hybridized bands in the Sputhern analysis on ZYQ and JX17 total DNA digested with BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、EcorⅤ、HindⅢ、ScaⅠ,and XbaⅠ were looked as copy number.ND for not determined
2.2 BAC插入末端分析和染色体步行
用TAIL朠CR法分离BAC末端，根据末端间的相互关系，发现在G342/RG433的contig中，45E6 的R末端及43N17的F末端分别位于最远的两端；在R1167的contig中，20P22的R末端及36P18的F末端分别位于contig的两个最外端。遂用这些末端作探针，对BAC文库进行筛选。结果用45E6的R末端获得1个阳性克隆，即7E5， 用43N17的F末端获得3个阳性克隆，即27O15、 29K24和14D23。用36P18的F端获得4个阳性克隆，即47H14、 19F19、 34F5和48N23(表1)。用BAC克隆的插入末端进行Southern杂交分析，证明了这些BAC克隆的跨叠关系(图1，B；图2)。至此，构建的contig包含16个BAC克隆，其中20P22、 36P18、 48N23、 7E5和14D23 5个BAC克隆可代表整个contig。根据这5个BAC克隆的HindⅢ酶切模式及脉冲电泳分析(图3)，估计该contig覆盖了水稻第六染色体长臂亚端粒区500kb的区域。
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图2 BAC未端的Southern分析结果
BAC克隆HindⅢ酶切,0.8%琼脂糖凝胶电泳,Southern转移到尼龙膜上,分别用20P22F(A)、36P18F(B)、48N23R(C)和14D23F(D)作探针进行杂交。实心箭头示跨叠克隆间相同的杂交带，空心箭头示重复序列杂交带。BAC克隆的编号同表1。M：λDNA-HindⅢ分子量标记
Fig.2 Southern analysis on the BAC clones in the contig by using some subcloned insert-ends as probes HindⅢ-digested BAC clones were hybridized with 20P22F(A),36P18F(B),48N23R(C),and 14D23F(D),respectively.Black arrows shows the identical bands between overlapping clones,white arrow shows the band revealed by multiple copy probe.Lane No.for Bac clones was listed in Table 1.M for λDNA-HindⅢ molecular weight marker
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图3 BAC克隆的酶切分析
A：Contig中BAC克隆的HindⅢ酶切模式.1～4、5～8和9～16含大量相同的酶切片段；B：部分BAC克隆的PFGE分析。BAC克隆的编号同表1
Fig.3 Restrictive patterns of BAC clones
A:HindⅢ-digested patterns of the BAC clones in the contig.some band were identical in lane 1～4,lane5～8,and lane9～16:respectively;B:PFGE analysis on some BAC clones digested by Not I.Lane number for the BAC clones was listed in Table 1
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2.3 遗传图与物理图的整合
对TAIL朠CR分离的部分BAC末端进行了亚 克隆，将这些亚克隆列于表1。用其中的7个亚克隆作探针与窄叶青8号和京系17的亲本膜杂交，发现这些探针为单拷贝序列或低拷贝重复序列。5个亚克隆末端在双亲间有多态，可以进行遗传定位。根据定位结果与contig的排列，将遗传图谱与物理图谱进行了整合(图1)，图1中同时列出了美国、日本构建的这一区域的遗传图谱和以南京11/巴里拉的DH群体构建的遗传图谱。新构建的遗传图谱将该区域的分子标记增加到8个，覆盖2个作图单位(cM)，物理图距为500kb。因此，这一区域的1cM相当于250kb。 2.4 cDNA的初步分析(图4) 用覆盖整个contig的BAC克隆插入片段作探针筛水稻的cDNA文库，对约104个pfu进行了筛选，获得4个阳性克隆，即MC5、MC18、MC24和MC25(图4，A)。用这4个阳性cDNA克隆作探针，与整个contig包含的BAC克隆进行Southern分析， 表明它们是彼此不同的独立的cDNA克隆。其中3个cDNA克隆在所有的BAC克隆上均有杂交信号，并且，多数杂交带相同(图4，B)，暗示它们来自某同一基因家族。
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图4 cDNA分析
A：4个阳性cDNA克隆的Ava I酶切模式。1：MC5；2：MC18；3：MC24；4：MC25；M：λDNA-HindⅢ分子量标记。B：用阳性cDNA克隆MC18、MC24和MC25作探针分别与contig中的16个BAC克隆HindⅢ酶切的Sourhern杂交模式，BAC克隆的排列次序同图2。箭头示载体位置
Fig.4 Analysis on cDNAs
A:The Ava I restrictive patterns of the 4 positive cDNA clones.Lane 1:MC5;lane 2:MC18;lane3:MC24;Lane 4:MC25;M:for λDNA-HindⅢ molecular weight marker.B:Hybridization patterns of Southern analysis on HindⅢ-digested BAC clones using cDNA clones,MC18,MC24,and MC25,as probes,respectively.The lane order is as those in Fig.2.Arrows show the vector bands
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3 讨论
利用插入末端进行染色体步行是物理作图的一个基本环节。常用的分离插入末端的方法有反向PCR法(inverse PCR)、质粒拯救法(plasmid rescue)和TAIL朠CR法[6,11]。由于构建BAC文库的载体特征，反向PCR法和质粒拯救法可分别分离插入的正向末端(左末端)和反向末端(右末端)。本研究中，我们按Liu等[6,7]报道的方法，扩增到了contig包含的全部BAC克隆的插入末端，并对其中的14个末端进行了亚克隆，定位的5个亚克隆末端位于预期的位点上。然而，用插入末端进行染色体步行面临许多困难，首先，能否得到新的阳性克隆，取决于整个文库对基因组的覆盖率；其次，当插入 末端为重复序列时，就会增加排除假阳性克隆的难度，对于这一困难，我们采用末端交互杂交法，取得了很好的效果。在本研究中，用于染色体步行的末端亚克隆属单拷贝序列或低拷贝重复序列。当用插入末端亚克隆作探针对候选阳性克隆进行Southern分析时，凡属相互跨叠的克隆，都会产生至少1条相同的杂交带。如图2所示，在不同位置产生的杂交带说明杂交探针为重复序列。如何保持步行方向的正确性是染色体步行的又一难点。若步行的方向不对，则会造成离目标越来越远。本研究的目的之一是构建RFLP标记G342与R1167间的contig，在分别得到这两个标记的阳性克隆并构建了各自的contig岛(island)后，必须通过染色体步行来填补其间的缺口。当我们用43N17F进行步行并得到新的阳性克隆时，以为可以将两个岛连在一起。经末端亚克隆的定位分析才发现步行方向反了。因此，遗传作图可帮助判断步行方向的正 确性。
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Harushima等[9]报道的水稻分子遗传图谱含2275个分子标记，是目前最高密度的水稻遗传图谱。在作图过程中，我们利用了该图谱上的分子标记G342和R1167，并将它们与美国Causse等[10]构建的图谱上的分子标记RG433同时定位于用窄叶青8号/京系17的DH群体构建的RFLP图谱上，从而确立了这3个图谱间在这一区域的对应关系。物理作图揭示出，在遗传图谱上位于同一位点的分子标记，其物理距离可能相差很大；而遗传图谱上位于不同位点的标记，其物理距离可能较小。如图1所示，20P22F与45E6R在遗传图谱上定位于同一位点，但其物理距离大于45E6R与27O15F间的距离，而后者间的遗传距离为1.5cM。造成这种差异的原因固然与染色体不同区域间交换频率不同有关，也可能与作图群体偏小有关。尽管如此，G342和RG433在ZYQ/JX17图谱上相距0.2cM，它们的 实际物理距离不会超过其共有的阳性BAC克隆约50kb的重叠区域，即遗传图谱上1cM相当于250kb；构建的contig在遗传图谱上覆盖2cM，物理图谱上覆盖500kb的区域。因此，遗传图距的大小虽然可以作为标记间距离的参考，但其实际距离必须通过物理作图才能确定。
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由于分子标记G342与RG433相对应，因此，构建的contig在美国图谱上对应于RG433靠端侧的亚端粒区域，这一区域在美国图谱上含有3个水稻cDNA标记和1个燕麦cDNA标记(图1，A)，本研究中使用的日本图谱上的分子标记R1167来自水稻根的cDNA文库，已鉴定的7个插入末端为单拷贝或低拷贝，且仅对104个pfu进行筛选，就得到4个不同的阳性cDNA克隆，这些事实均暗示这一区域存在大量的基因编码区。因此，本研究结果不仅为基因作图提供了新的分子标记，而且，为分析、克隆这一区域的基因打下了基础。
致谢： 实验过程中得到杨代常博士、徐吉成博士、毛龙博士和郑文明博士的帮助，并获中国科学院王宽诚教育基金资助，特此致谢。
国家自然基金重点项目(批准号:39630190)和863计划生物技术领域课题的一部分
参考文献
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1999-06-04
1999-09-20, http://www.100md.com
单位：严长杰(扬州大学农学院，江苏扬州 225009)；王文明 翟文学 陈纯贤 郑先武 李晓兵 朱立煌(中国科学院遗传研究所，北京 100101)
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WANG WenMing ZHAI WenXue CHEN ChunXian ZHENG XianWu LI XiaoBing ZHU LiHuang
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Abstract: The region between RFLP markers G342 and R1167 was the subterminal part of the longer arm on the rice chromosome 6, because Shen et al. (1998) mappedtwo telomeric repeat associated sequences distal to G342. In order to integrate the genetic map and the physical map of the region, G342 and R1167 were firstly used to screen BAC library. Based on the positive clones detected by the two markers and chromosome walking by using the outer most insert-end of the overlapping clones, a contig containing 16 BAC clones which spanned 500kb was constructed. All the insert杄nds of the BAC clones could be amplified with thermal asymmetric interlaced PCR. Fourteen insert-ends were subcloned. Seven of them were identified as a single or low copy sequences and five were mapped on the expected sites flanking G342 or R1167. The insert fragment isolated from the minimum tile BAC clones of the contig was used to screen a cDNA library and four different positive clones were detected.
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Key words: rice; molecular marker; bacterial artificial chromosome; contig; insert end
水稻不仅是全世界主要的粮食作物之一，而且 因其具有基因组小、易于转化、遗传资源丰富等特 点而成为单子叶植物基因组研究的模式植物。Kurata等[1]利用YAC文库构建了水稻基因组的物理图谱，但在第六染色体长臂的物理图谱仅覆盖至分子标记R1608，位于该标记靠端侧的G342至染色体端部为一大的空白区；而其他以BAC文库为基础的物理图谱[2～4]也未达到这一区域。本实验室的Shen等[5]曾将两个端粒标记定位于G342侧翼，陈纯贤等也在比较作图中，将与小麦抗白粉病基因Pm20相关的分子标记Xpsr148定位于这一区域(据本实验室未发表资料，图1)。因此，这一区域的遗传图和物理图的整合，不仅有利于分析、克隆这一区域的基因，而且可以帮助我们进一步研究水稻中该区域与小麦基因组的关系。基于上述考虑，我们利用RFLP标记G342和R1167作探针，筛选 BAC文库，以得到的阳性BAC克隆为基础进行染色体步行，构建了覆盖RFLP标记G342和R1167区域的跨叠克隆群(contig)，将遗传图和物理图进行了整合，并获得4个不同的cDNA克隆。
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图1 水稻第六染色体长臂亚端粒区的局决遗传图(A)和物理图(B)
图体字表示本研究使用的分子标记,细横线下的数据表示图距(cM);粗横线表示BAC克隆.图A下B间的斜线表示物理图谱与遗传图谱的对应区域.美国的图谱引自Causse等[10],日本的图谱引自Harushima等[9]
Fig.1 Agenetic map(A) and its corresponding physical map(B)on the subterminal regionof the longer armof rice chromosome 6
Markers in bold letters indicate those used in the present experiment .Numbers under the thin line are map distance in centimorgans (Kosambi function).Thick lines stand for BAC clones.Lines between A and B shows the corresponding sites in the genetic map and the physical map.The partial genetic maps from those constructed by Causse et al.(1994)and harushima et al,(1998)are also listed for referance
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1 材料和方法
1.1 实验材料
研究中使用的2个水稻BAC文库的高密度膜及有关BAC克隆分别由菲律宾国际水稻研究所Yang等和美国Clemson大学Rod Wing等提供。窄叶青8号和京系17的加倍单倍体(DH)群体用于BAC插入末端的定位。
1.2 BAC文库的筛选
菌落杂交、阳性克隆的鉴定均按Yang等[3]的方法。
1.3 BAC插入末端的分离与亚克隆
用TAIL朠CR法[6]扩增BAC的2个末端，用Advantage PCR朠ure Kit (Clontech, USA)回收符 合要求的扩增片段，克隆到pGEM T easy载体中。分离BAC正向末端(F末端)的特异引物为：
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BF1： 5′-ACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3′；
BF2： 5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGA-3′；
BF3： 5′-AGTCGACCTGCAGGCATGCA-3′。
分离BAC反向末端(R末端)的特异引物为：
BR1： 5′-TTCCGGCTCGTATGTTGTTGGG-3′；
BR2： 5′-AGCGGATAAACAATTTCACACAGGA-3′；
BR3： 5′-GGTGACACTATAGAATACTCA-3′。
按Liu等[6,7]的报道，分别合成并使用了6个任意简并引物，即：
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AD1： 5′-GAGNAGTANCAGAGA-3′；
AD2： 5′-GTGNAGAANCAAAGG-3′；
AD3：5′-ATCGNCNGANACGAA-3′；
AD4： 5′-CGTNCGNACNTAGGA-3′；
AD5： 5′-TCGA(G/C)T(A/T)T(G/C)G(A/T)GTT-3′；
AD6： 5′-GTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3′。
1.4 跨叠克隆的排列与染色体步行
用HindⅢ酶切BAC克隆，根据酶切模式排定跨叠克隆间的关系，用分离的BAC末端作探针进行Southern杂交验证。以位于contig最外测的2个末端作探针筛选BAC文库，得到的阳性克隆经末端分析验证并整合到contig中。染色体步行的方向通过BAC末端亚克隆在用窄叶青8号/京系17的DH群体构建的遗传图谱上的定位来确定。构建的contig覆盖长度通过测定BAC克隆的重叠程度和 插入片段的大小来确定。BAC克隆的重叠程度及插入大小通过比较BAC克隆的HindⅢ酶切和NotⅠ酶切检测。脉冲电泳(PFGE)条件：用1% Agarose朙E 凝胶，在0.5×TBE的缓冲液中，以6 V/cm 的电压、120度电泳角度、0.22～6.80s的脉冲时间，14℃下电泳15h。
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1.5 cDNA文库的筛选
用NotⅠ酶切BAC克隆，回收插入片段作探针，按标准的方法[8]筛选1个已建成的水稻cDNA文库(中国水稻研究所钱前博士提供)。
2 结果
2.1 RFLP标记G342和R1167的阳性克隆筛选
RFLP标记G342和R1167是日本Harushima等[9]构建的水稻遗传图谱上的分子标记，RG433是美国Causse等[10]构建的遗传图谱上的分子标记。本实验室在用南京11/巴里拉的DH群体构建的RFLP图谱上，将RG433和G342定位于同一位点； 另外，在用窄叶青8号/京系17的DH群体构建的RFLP图谱上，对R1167的定位结果与日本的图谱相似，并将G342和RG433定位在紧密连锁的2个位点(图1，A)。分别用这3个RFLP标记作探针在BAC文库中进行筛选，其中用G342和RG433作探针得到相同的4个阳性克隆，即43G4、 43N17、 45E6和14D21。这一结果进一步说明RG433和G342两个分子标记是紧密连锁的，物理距离不会超过这4个克隆间相互重叠的片段长度(约50kb)。用R1167对BAC文库进行筛选，也获得4个阳性克隆，即36P18、 20P22、 38M6和38N7(表1)。根据HindⅢ酶切模式对这些克隆进行排列及杂交分析，发现前4个克隆和后4个克隆形成2个独立的contig。
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表1 用RFLP标记及染色体步行鉴定的BAC克隆
Table 1 Positive BAC clones detected by RFLP markers and cloned insert-ends as markers for chromosome walking 标记
Marker
克隆名称
Clone name
本文编号
No.in this paper
插入大小
Insert size(kb)a)
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亚克隆末端
Subcloned insert-endb)
亚克隆插入大小
Subclone size (kb)
亚克隆拷贝数
Copy number of the insert-endc)
G342
45E6
10
100
R*
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0.8
1
14D21
11
100
43G4
12
65
43N17
13
80
F
1.0
, http://www.100md.com 1
R1167
20P22
1
115
F*
0.4
1
R
0.5
ND
38M6
2
70
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38N7
3
70
36P18
4
95
F*
0.5
1
43N17F
27O15
15
90
, 百拇医药 F*
0.4
2
29K24
14
80
14D23
16
105
F
0.4
1
R*
0.5
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2～3
36P18F
47H14
5
130
19F19
6
130
34F5
7
130
F
0.4
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ND
R
0.6
ND
48N23
8
137
F
0.7
ND
R
0.5
ND
45E6R
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7E5
9
140
F
0.4
ND
R
0.4
ND
a)BAC插入大小根据HindⅢ酶切(图3，A)或Not I酶切(图3，B)检测结果；b)F表示正向插入末端，R表示反向插入末端，带*号者为定位的末端；c)与窄叶青8号和京系17亲本经BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、EcorⅤ、HindⅢ、和XbaⅠ8种酶切杂交，最少的杂交带数视为拷贝数；ND：未确定
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a)The insert size of the BAC clones was estimated from the restrictive pattern digested by HindⅢ(Fig.3,A)or Not I(Fig.3,B);b)F for forward insert end and R for reverse end.Those with * were maped insert-ends.c)Hybridized bands in the Sputhern analysis on ZYQ and JX17 total DNA digested with BamHⅠ、BglⅡ、EcoRⅠ、EcorⅤ、HindⅢ、ScaⅠ,and XbaⅠ were looked as copy number.ND for not determined
2.2 BAC插入末端分析和染色体步行
用TAIL朠CR法分离BAC末端，根据末端间的相互关系，发现在G342/RG433的contig中，45E6 的R末端及43N17的F末端分别位于最远的两端；在R1167的contig中，20P22的R末端及36P18的F末端分别位于contig的两个最外端。遂用这些末端作探针，对BAC文库进行筛选。结果用45E6的R末端获得1个阳性克隆，即7E5， 用43N17的F末端获得3个阳性克隆，即27O15、 29K24和14D23。用36P18的F端获得4个阳性克隆，即47H14、 19F19、 34F5和48N23(表1)。用BAC克隆的插入末端进行Southern杂交分析，证明了这些BAC克隆的跨叠关系(图1，B；图2)。至此，构建的contig包含16个BAC克隆，其中20P22、 36P18、 48N23、 7E5和14D23 5个BAC克隆可代表整个contig。根据这5个BAC克隆的HindⅢ酶切模式及脉冲电泳分析(图3)，估计该contig覆盖了水稻第六染色体长臂亚端粒区500kb的区域。
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图2 BAC未端的Southern分析结果
BAC克隆HindⅢ酶切,0.8%琼脂糖凝胶电泳,Southern转移到尼龙膜上,分别用20P22F(A)、36P18F(B)、48N23R(C)和14D23F(D)作探针进行杂交。实心箭头示跨叠克隆间相同的杂交带，空心箭头示重复序列杂交带。BAC克隆的编号同表1。M：λDNA-HindⅢ分子量标记
Fig.2 Southern analysis on the BAC clones in the contig by using some subcloned insert-ends as probes HindⅢ-digested BAC clones were hybridized with 20P22F(A),36P18F(B),48N23R(C),and 14D23F(D),respectively.Black arrows shows the identical bands between overlapping clones,white arrow shows the band revealed by multiple copy probe.Lane No.for Bac clones was listed in Table 1.M for λDNA-HindⅢ molecular weight marker
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图3 BAC克隆的酶切分析
A：Contig中BAC克隆的HindⅢ酶切模式.1～4、5～8和9～16含大量相同的酶切片段；B：部分BAC克隆的PFGE分析。BAC克隆的编号同表1
Fig.3 Restrictive patterns of BAC clones
A:HindⅢ-digested patterns of the BAC clones in the contig.some band were identical in lane 1～4,lane5～8,and lane9～16:respectively;B:PFGE analysis on some BAC clones digested by Not I.Lane number for the BAC clones was listed in Table 1
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2.3 遗传图与物理图的整合
对TAIL朠CR分离的部分BAC末端进行了亚 克隆，将这些亚克隆列于表1。用其中的7个亚克隆作探针与窄叶青8号和京系17的亲本膜杂交，发现这些探针为单拷贝序列或低拷贝重复序列。5个亚克隆末端在双亲间有多态，可以进行遗传定位。根据定位结果与contig的排列，将遗传图谱与物理图谱进行了整合(图1)，图1中同时列出了美国、日本构建的这一区域的遗传图谱和以南京11/巴里拉的DH群体构建的遗传图谱。新构建的遗传图谱将该区域的分子标记增加到8个，覆盖2个作图单位(cM)，物理图距为500kb。因此，这一区域的1cM相当于250kb。 2.4 cDNA的初步分析(图4) 用覆盖整个contig的BAC克隆插入片段作探针筛水稻的cDNA文库，对约104个pfu进行了筛选，获得4个阳性克隆，即MC5、MC18、MC24和MC25(图4，A)。用这4个阳性cDNA克隆作探针，与整个contig包含的BAC克隆进行Southern分析， 表明它们是彼此不同的独立的cDNA克隆。其中3个cDNA克隆在所有的BAC克隆上均有杂交信号，并且，多数杂交带相同(图4，B)，暗示它们来自某同一基因家族。
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图4 cDNA分析
A：4个阳性cDNA克隆的Ava I酶切模式。1：MC5；2：MC18；3：MC24；4：MC25；M：λDNA-HindⅢ分子量标记。B：用阳性cDNA克隆MC18、MC24和MC25作探针分别与contig中的16个BAC克隆HindⅢ酶切的Sourhern杂交模式，BAC克隆的排列次序同图2。箭头示载体位置
Fig.4 Analysis on cDNAs
A:The Ava I restrictive patterns of the 4 positive cDNA clones.Lane 1:MC5;lane 2:MC18;lane3:MC24;Lane 4:MC25;M:for λDNA-HindⅢ molecular weight marker.B:Hybridization patterns of Southern analysis on HindⅢ-digested BAC clones using cDNA clones,MC18,MC24,and MC25,as probes,respectively.The lane order is as those in Fig.2.Arrows show the vector bands
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3 讨论
利用插入末端进行染色体步行是物理作图的一个基本环节。常用的分离插入末端的方法有反向PCR法(inverse PCR)、质粒拯救法(plasmid rescue)和TAIL朠CR法[6,11]。由于构建BAC文库的载体特征，反向PCR法和质粒拯救法可分别分离插入的正向末端(左末端)和反向末端(右末端)。本研究中，我们按Liu等[6,7]报道的方法，扩增到了contig包含的全部BAC克隆的插入末端，并对其中的14个末端进行了亚克隆，定位的5个亚克隆末端位于预期的位点上。然而，用插入末端进行染色体步行面临许多困难，首先，能否得到新的阳性克隆，取决于整个文库对基因组的覆盖率；其次，当插入 末端为重复序列时，就会增加排除假阳性克隆的难度，对于这一困难，我们采用末端交互杂交法，取得了很好的效果。在本研究中，用于染色体步行的末端亚克隆属单拷贝序列或低拷贝重复序列。当用插入末端亚克隆作探针对候选阳性克隆进行Southern分析时，凡属相互跨叠的克隆，都会产生至少1条相同的杂交带。如图2所示，在不同位置产生的杂交带说明杂交探针为重复序列。如何保持步行方向的正确性是染色体步行的又一难点。若步行的方向不对，则会造成离目标越来越远。本研究的目的之一是构建RFLP标记G342与R1167间的contig，在分别得到这两个标记的阳性克隆并构建了各自的contig岛(island)后，必须通过染色体步行来填补其间的缺口。当我们用43N17F进行步行并得到新的阳性克隆时，以为可以将两个岛连在一起。经末端亚克隆的定位分析才发现步行方向反了。因此，遗传作图可帮助判断步行方向的正 确性。
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Harushima等[9]报道的水稻分子遗传图谱含2275个分子标记，是目前最高密度的水稻遗传图谱。在作图过程中，我们利用了该图谱上的分子标记G342和R1167，并将它们与美国Causse等[10]构建的图谱上的分子标记RG433同时定位于用窄叶青8号/京系17的DH群体构建的RFLP图谱上，从而确立了这3个图谱间在这一区域的对应关系。物理作图揭示出，在遗传图谱上位于同一位点的分子标记，其物理距离可能相差很大；而遗传图谱上位于不同位点的标记，其物理距离可能较小。如图1所示，20P22F与45E6R在遗传图谱上定位于同一位点，但其物理距离大于45E6R与27O15F间的距离，而后者间的遗传距离为1.5cM。造成这种差异的原因固然与染色体不同区域间交换频率不同有关，也可能与作图群体偏小有关。尽管如此，G342和RG433在ZYQ/JX17图谱上相距0.2cM，它们的 实际物理距离不会超过其共有的阳性BAC克隆约50kb的重叠区域，即遗传图谱上1cM相当于250kb；构建的contig在遗传图谱上覆盖2cM，物理图谱上覆盖500kb的区域。因此，遗传图距的大小虽然可以作为标记间距离的参考，但其实际距离必须通过物理作图才能确定。
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由于分子标记G342与RG433相对应，因此，构建的contig在美国图谱上对应于RG433靠端侧的亚端粒区域，这一区域在美国图谱上含有3个水稻cDNA标记和1个燕麦cDNA标记(图1，A)，本研究中使用的日本图谱上的分子标记R1167来自水稻根的cDNA文库，已鉴定的7个插入末端为单拷贝或低拷贝，且仅对104个pfu进行筛选，就得到4个不同的阳性cDNA克隆，这些事实均暗示这一区域存在大量的基因编码区。因此，本研究结果不仅为基因作图提供了新的分子标记，而且，为分析、克隆这一区域的基因打下了基础。
致谢： 实验过程中得到杨代常博士、徐吉成博士、毛龙博士和郑文明博士的帮助，并获中国科学院王宽诚教育基金资助，特此致谢。
国家自然基金重点项目(批准号:39630190)和863计划生物技术领域课题的一部分
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