利用花粉辐射诱发普通小麦与大赖草染色体易位的研究
作者：刘文轩 陈佩度 刘大钧
单位：刘文轩(河南省农业科学院小麦研究所,郑州 450002)；陈佩度 刘大钧(南京农业大学农业部作物细胞遗传重点开放实验室，南京 210095)
关键词：小麦；大赖草；花粉辐射；原位杂交；染色体C-分带；易位素
遗传学报000108
摘要：将小麦-大赖草Lr.2和Lr.14染色体二体异附加系94G15和94G45即将成熟花粉经60Coγ射线辐射处理，然后分别给普通小麦品种扬麦5号和绵阳11授粉。辐射M1的PMC MI期染色体经Giemsa C-分带和基因组DNA荧光原位杂交处理后进行染色配对分析，从17株M1单株中筛选到5株PMC MI期大赖草染色体与小麦配对的个体。根据这5株单株自交M2种子根尖细胞有丝分裂中期染色体C-分带和原位杂交检测，筛选并鉴定出了LW8(3)1和LW11(3)12个涉及大赖草Lr.14染色体的小麦-大赖草易位系。还就花粉辐射在诱发小麦-亲缘物种染色体易位的可行性及有效性，以及所获2个易位系的利用价值进行了讨论。
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中图分类号：Q343 文献标识码：A
文章编号：0379-4172(2000)01-0044-0049
Studies of the Development of Triticum aestivum-Leymus racemosus Translocation Lines by Pollen Irradiation
LIU Wen-Xuan,CHEN Pei-Du,LIU Da-Jun
(Key Lab.of Crop Cytogenetics,CMA,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)
Abstract:Pollens of 94G15 and 94G45,two wheat lines added to chromosome Lr.14 and Lr.2 of Leymus racemosus respectively were irradiated via 60Co-γ rays and then used to hybridize with two common wheat varieties-Yangmai 5 and Mianyang 11.The five plants showing chromosome pairing between T.aestivum and L.racemosus at PMC MI stage were selected from seventeen examined plants of M1 progeny as the result of meiosis configuration analysis of chromosomes treated with Giemsa C-bandingand fluorescent in situ hybridization.Among which,two T.aestivum-L.racemosus alien translocation lines——LW8(3)1 and LW11(3)1 were developed on the basis of further identification of M2 RTC chromosomes by C-banding and in situ hybridization.In addition,feasibility and effectiveness of the pollen irradiation in the development of T.aestivum-relatives alien translocations and the availability of the translocation lines of T.aestivum-L.racemosus are also discussed.
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Key words:T.aestivum;L.racemosus; pollen irradiation; translocation lines
诱发普通小麦与亲缘物种间染色体易位是向小麦转移亲缘物种抗病虫害、抗旱耐瘠、优质等优良基因的一个有效途径。诱发染色体易位的主要 方法有电离辐射、部分同源配对控制体系、组织培养、杀配子基因效应等。其中电离辐射方法简单，易位效果不受亲缘物种与小麦亲缘关系远近以及目标基因在染色体上位置的影响，在易位系选育方面应用非常普遍[1，2]。电离辐射常以小麦-亲缘物种杂种、异附加系或代换系的种子、减数分裂期成株和花粉为处理对象[3]。目前利用种子或减数分裂期成株进行辐射已得到了小麦与黑麦、簇毛麦、山羊草、冰草、新麦草等至少5个亲缘属的易位系[4]，但利用花粉辐射选育易位系的报道还很少见。
大赖草属于禾本科小麦族赖草属，主要分布在前苏联的南欧、西伯利亚以及我国新疆等沙丘和沙漠中。大赖草除对不良环境有很好的适应性外，还抗小麦赤霉病、根腐病等多种真菌性病害，而且具有大穗大粒等优良性状。为了将大赖草有利基因 导入小麦，南京农业大学细胞遗传所于1985年开始了小麦与大赖草的远缘杂交工作，目前已经得到一批小麦-大赖草异附加系[5，6]，其中分别添加了大赖草Lr.2、Lr.7和Lr.14染色体的异附加系对赤霉病表现出较好的抗性[7]。
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本研究在上述工作基础上，以小麦-大赖草抗赤霉病异附加系为起始材料，采用花粉辐射手段，力图对花粉辐射诱发易位的可行性及有效性进行探讨，并从辐射后代中筛选小麦大赖草易位系，为小麦遗传研究及育种提供有用的遗传材料.
1 材料和方法
1.1 供试材料
小麦-大赖草Lr.2染色体二体异附加系94G45以及Lr.14二体异附加系94G15；普通小麦品种扬麦5号、绵阳11号等，均由本所提供。
1.2 实验方法
1.2.1 花粉辐射及辐射后代处理 取小麦-大赖草二体异附加系即将大量开花的麦穗，用60Co-γ射线进行辐射处理。辐射剂量率为100R/分，总剂量1 000R。辐射后立即从处理过的麦穗上采集花粉，给3～4d前去雄的麦穗授粉，并套袋隔离。辐射M1植株在花粉母细胞减数分裂中期I观察大赖草染色体与小麦染色体的配对情况。大赖草与小麦染色体发生配对的植株套袋自交，M2种子发芽、剪根，在有丝分裂中期用Giemsa C-分带和荧光原位杂交技术筛选、鉴定小麦-大赖草染色体易位系。
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1.2.2 细胞遗传学研究方法 根尖细胞有丝分裂染色体制片：种子在垫有2层湿润滤纸的培养皿内于25℃下萌发。当根长至1～1.5cm时剪取2条种子根，置0℃冰水中处理24h，然后用卡诺氏固定液(3份95%乙醇1份冰醋酸)固定2～7d，在45%醋酸中压片，相差镜下观察，计数。花粉母细胞染色体制片：挑取含中期I分裂相的花药，在卡诺氏固定液中固定。在45%醋酸中压片。染色体Giemsa C-分带：根尖或花粉母细胞染色体制片在-70℃冰箱中冰冻，揭去盖片，在100%乙醇中过夜。染色体分带具体程序参照Gill(1991)[8]方法。荧光原位杂交：以bio-11-dUTP标记的大赖草基因组DNA为探针。DNA提取及探针的生物素标记、原位杂交过程同陈佩度的方法[9]。DNA杂交信号的放大与检测采用兔抗生物素抗体和连结FITC的绵羊抗兔抗体系统。在450～490nm波长下观察杂交结果，大赖草染色质部分呈黄绿色，小麦染色体呈红棕色。具体方法参照Friebe(1993)[2]。
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2 结果与分析
2.1 花粉辐射对杂交当代(M0)结实率的影响
分别取小麦柎罄挡軱r.2以及Lr.14染色体二体异附加系94G45和94G15的即将大量开花的穗子进行60Co-γ射线处理，辐射剂量1 000R。用经辐射处理穗子的花粉给3～4d前已去雄的扬麦5号和绵阳11号授粉。共授粉1 469朵小花，得杂交种 子617粒，平均杂交结实率为42%左右，比对照杂交结实率下降23.1%～48.9%(表1)。由此可见，1 000R的辐射剂量低于或接近半致死剂量。
表1 花粉国辐射当代Mo杂交结实率
Table 1 Seed setting percentage of pollen-irradiated Mo 杂交结合
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Hybrid combination
授粉小花数
No.of pollinated floret
结实小花数
No.of seedy florets
结实率(%)
Percentage of
seed setting(%)
结实率比
Ck降低(%)
Percentage lower
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than check(%)
Yangmai 5×94G15 pollenIKR
919
314
34.2
48.9
Yangmai 5×94G15(CK1)
130
108
83.1
-
Mianyang 11×94G15 pollenIKR
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219
137
62.6
23.1
Mianyang 11×94G15(CK2)
105
90
85.7
-
Mianyang 11×94G45 pollenIKR
331
166
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50.2
36.0
Mianyang 11×94G45(CK3)
130
112
86.2
-
2.2 花粉辐射M1植株PMC MI染色体配对分析
花粉辐射所获M1种子中590粒当年夏季南繁加代失败，余下27粒秋季播种在南京农业大学实验网室，只有17粒出苗，长成植株。对这17株进行了PMC MI染色体配对构型分析，结果有12株(64.6%)PMC MI有多价体构型，形成的多价体多为三价体和四价体，也有个别为五价体、六价体，有些单株PMC MI同时含有3～4个多价体构型(图版I-1，2)。不同杂交组合后代PMC MI出现多价体的个体数相差很大：扬麦5号×94G15花粉IKR后代观察的8株全有多价体，其中有6株(75.0%)PMC MI出现2个以上多价体构型；绵阳11×94G15花粉IKRM1后代观察的3株中有2株(66.7%)具多价体；绵阳11×94G45花粉IKR组合观察了6 株，其中只有1株(16.7%)具有多价体。而未经辐射的对照(扬麦5号×94G45)F1每个MI期的花粉母细胞均含有1个四价体，(绵阳11×94G15)F1和(绵阳11×94G45)F1单株PMC MI没有出现多价体构型(表2)。表2 花粉辐射后代PMC MI具多价体配对构型及发生异源染色体配对个体数
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Table 2 Number of plants with multivalent of paired chromosome of L racemosus 杂交结合
Hybrid combination
观察株数
No.of observed plants
具多价体株数
No.of plants sith multivalent
小麦-大赖草染色体配对株数
No.of plants with paired Lr
Yangmai 5×94G15 pollenIKR
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8
8a
3
Yangmai 5×94G15(CK1)
10
10b
0
Mianyang 11×94G15 pollenIKR
3
2
1
Mianyang 11×94G15(CK2)
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8
0
0
Mianyang 11×94G45 pollenIKR
6
1
0
Mianyang 11×94G45(CK3)
12
0
0
注：a.其中6株的花粉母细胞有2个以上多价体；b.花粉母细胞有一个四价体
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Note：a.Among which,there are six plants with above two multivalents in a PMC.
b.There is a quadrivalent in a PMC
为了确定大赖草染色体是否参与了染色体配对。我们对PMC MI染色体进行了Giemsa C-分带和荧光原位杂交.结果在具有多价体的10个单株中有4株大赖草染色体与小麦发生了配对(图版I-3)。染色体荧光原位杂交结果也清晰地显示出呈黄绿色的大赖草染色体与显红棕色的小麦染色体发生了配对(图版II-1)。其中扬麦5号×94G15花粉IKR组合有3株[LW8(4)2、LW8-4、LW8(3)1]、绵阳11×94G15花粉IKR组合有1株[LW11(3)1]发生了大赖草与小麦染色体的配对(表2)。此外，在另外7株无多价体构型的辐射后代中，扬麦5号×94G15花粉IKR组合有1株[LW8(3)2]大赖草染色体与小麦配成棒状二价体。
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在通常情况下，大赖草染色体与小麦染色体不发生配对。因此，初步推测上述这5株大赖草与小麦染色体发生配对的单株很有可能含有小麦-大赖草易位染色体.
2.3 花粉辐射M2代小麦-大赖草易位系的筛选与鉴定
对上述5株可能已发生了小麦-大赖草染色体易位的植株自交M2种子根尖细胞有丝分裂中期染色体进行了Giemsa C-分带和荧光原位杂交分析.结果证实来自扬麦5号×94G15花粉IKR的LW8(3)1以及来自绵阳11×94G15花粉IKR组合的LW11(3)1 2个单株的确含有小麦-大赖草易位染色体.
根据染色体荧光原位杂交结果，LW8(3)1易位系的染色体易位断点在大赖草Lr.14短臂近末端处，属于由绝大部分大赖草染色体与一小段小麦染 色体组成的顶端易位类型，大赖草染色体易位片段占易位染色体总长的78%左右(图版II-2)。从Giemsa C-分带照片上可以看到LW8(3)1有丝分裂中期I的根尖细胞中含有2条与小麦染色体明显不同的染色体，该染色体短臂末端有一些很弱的C-分带.长臂末端有一很强的C-带(图版Ⅱ-4)。大赖草Lr.14染色体长臂末端有一强C-带，短臂末端没有C-带.因此，该染色体是大赖草Lr.14染色体的长臂及短臂的一部分和某条小麦染色体的一小段组成的易位染色体。但仅根据C-分带结果很难确定这一小段染色体片段来自小麦的哪条染色体
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经过染色体Giemsa C-分带结果来看，LW11(3)1的染色体易位发生在大赖草Lr.14长臂和小麦6B染色体短臂之间，易位断点在6B染色体Giemsa C-带S2.2区，FL0.42附近，易位染色体为T6BL.6BS朙r.14L(图版I5，6)。荧光原位杂交结果表明，大赖草染色体Lr.14易位片段占易位染色 体短臂长度的67%，占易位染色体总长的29%左右(图版II-3)。
这2个易位系自交均可正常结实，自交结实率在90%以上。它们的抗赤霉病性状正在鉴定之中。
3 讨论
花粉辐射在小麦中的应用主要在产生单倍体植株[10]、提高远缘杂种植株获得率[11]和产生带有少数父本性状的偏母后代[12]方面。尽管Snape(1983)在花粉辐射M1和M2代中发现了端体、缺失体、双着丝粒染色体以及小麦染色体间的相互易位等染色体结构变异[12]，但迄今尚未见到利用花粉辐射诱发小麦-亲缘物种染色体易位的其他报道.陶舜华(1989)用低剂量γ射线辐射大赖草花粉，然后给波斯小麦、新疆小麦授粉，经胚培养后杂种植株获得率提高到21.6%，并且得到了具有某些大赖草特征的普通小麦[11]。但尚不能确定经过花粉辐射后小麦与大赖草染色体是否发生了易位。花粉辐射在其他 植物，如烟草、大麦、玉米、番茄，豌豆、油菜、辣椒和番薯上的应用也基本上集中在诱导单倍体、提高远缘杂交结实率和获得只带少数父本性状的偏母本后代方面[13]，利用花粉辐射诱发染色体易位的研究尚未见报道。
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本研究以小麦-大赖草异附加二体为起始材料，利用即将成熟的花粉进行辐射处理，结果从17株M1中就选到2个不同类型的易位系，小麦-大赖草染色体之间发生易位的单株频率达到11.8%，表明花粉辐射是诱发小麦-亲缘物种染色体将近位的一个好方法.但由于所用样本比较少，而且实验追踪的只是小麦大赖草染色体间的易位情况，本研究只是在花粉辐射诱发染色体易位方面进行了初步尝试，尚难对花粉辐射对染色体易位的作用作出综合、准确的评定.
染色体Giemsa C-分带技术和以基因组DNA为探针的分子原位杂交技术等为小麦-亲缘物种易位系的鉴定提供了精确可靠的手段.这些技术与传统细胞遗传分析方法，如PMC MI染然体构型分析以及染色体臂比、大小、随体的有无等形态分析相结合，既缩短了选育易位系所需时间，又提高了鉴定易位系的准确性[14，15]。我们将PMC MI染色体构型分析、Giemsa C-分带和原位杂技术相结合，从花粉辐射到小麦-赖草易位系的确定只用了不足2年的时间.
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染色体结构变异体，如缺失体和易位系在构建控制表型性状的基因、生化标记以及DNA分子标记的物理图谱，研究染色体结构与功能，转换基因位点之间的遗传连锁距离和实际物理距离以及分离与克隆基因方面都有很大利用价值[16]。本研究得到的2个易位系中大赖草染色体片段从占染色体总长的29%到78%，采用这种方法，可望获得一系列涉及不同长度大赖草染色体片段的易位系，可为大赖草基因定位，构建生化以及DNA分子标记物理 图谱以及向小麦转移大赖草有利基因等方面的研究提供有用的遗传材料。
致谢：江苏省农科院原子能所协助辐射处理，谨致谢忱。
1.花粉辐射M1代PMC MI染色体构型，示17Ⅱ+1Ⅳ+1Ⅴ；
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2.花粉辐射M1代PMC MI染色体构型，示15Ⅱ+2Ⅳ+1Ⅴ；
3.花粉辐射M1代PMC MI染色体C-带，示Lr.14与小麦染色体配成本价体；
4.LW8(3)1的RTC染色体C-分带，箭头所指为易位染色体；
5.LW11(3)1的RTC染色体C-分带，箭头所指为T6BL.BS-Lr14L易位染色体；
6.小麦6B、大赖草Lr.14染色体和T6BL.BS-Lr14L易位染色体；
1.Meiotic configuration of M1 plant derived from irradiated pollens.
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Seventeen bivalents,one quadrivalent and a pentivalent are showed;
2.Meiotic configuration of M1 plant derived from irradiated pollens.
Fifteen bivalents,two quadrivalents and a pentivalent are showed;
3.Giemsa C-banding of PMC MI chromosome of M1 plants.
A trivalent composed of Lr.14 and two wheat chromosomes are showed;
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4.RTC C-banded chromosomes of LW8(3)1,arrows show two translocation chromosomes;
5.RTC C-banded chromosomes of LW11(3)1,two translocation chromosomes are showed;
6.C-banded 6B of wheat ,Lr14 of L.racemosus and T6BS.6BL-Lr.14L
1.花粉辐射M1代PMC MI染色体原位杂交，示Lr.14与小麦染色体配成三价体；
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2.LW8(3)2的RTC染色体原位杂交；
3.LW11(3)1的RTC染色体原位杂交；
1.FISH of PMC MI chromosomes of M1 plants .
A trivalent composed of Lr.14 and two wheat chromosemes is showed;
2.FISH of RTC chromosomes of LW8(3)2;
3.FISH of RTC chromosomes of LW11(3)2;
参考文献
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关键词：小麦；大赖草；花粉辐射；原位杂交；染色体C-分带；易位素
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摘要：将小麦-大赖草Lr.2和Lr.14染色体二体异附加系94G15和94G45即将成熟花粉经60Coγ射线辐射处理，然后分别给普通小麦品种扬麦5号和绵阳11授粉。辐射M1的PMC MI期染色体经Giemsa C-分带和基因组DNA荧光原位杂交处理后进行染色配对分析，从17株M1单株中筛选到5株PMC MI期大赖草染色体与小麦配对的个体。根据这5株单株自交M2种子根尖细胞有丝分裂中期染色体C-分带和原位杂交检测，筛选并鉴定出了LW8(3)1和LW11(3)12个涉及大赖草Lr.14染色体的小麦-大赖草易位系。还就花粉辐射在诱发小麦-亲缘物种染色体易位的可行性及有效性，以及所获2个易位系的利用价值进行了讨论。
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Abstract:Pollens of 94G15 and 94G45,two wheat lines added to chromosome Lr.14 and Lr.2 of Leymus racemosus respectively were irradiated via 60Co-γ rays and then used to hybridize with two common wheat varieties-Yangmai 5 and Mianyang 11.The five plants showing chromosome pairing between T.aestivum and L.racemosus at PMC MI stage were selected from seventeen examined plants of M1 progeny as the result of meiosis configuration analysis of chromosomes treated with Giemsa C-bandingand fluorescent in situ hybridization.Among which,two T.aestivum-L.racemosus alien translocation lines——LW8(3)1 and LW11(3)1 were developed on the basis of further identification of M2 RTC chromosomes by C-banding and in situ hybridization.In addition,feasibility and effectiveness of the pollen irradiation in the development of T.aestivum-relatives alien translocations and the availability of the translocation lines of T.aestivum-L.racemosus are also discussed.
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Key words:T.aestivum;L.racemosus; pollen irradiation; translocation lines
诱发普通小麦与亲缘物种间染色体易位是向小麦转移亲缘物种抗病虫害、抗旱耐瘠、优质等优良基因的一个有效途径。诱发染色体易位的主要 方法有电离辐射、部分同源配对控制体系、组织培养、杀配子基因效应等。其中电离辐射方法简单，易位效果不受亲缘物种与小麦亲缘关系远近以及目标基因在染色体上位置的影响，在易位系选育方面应用非常普遍[1，2]。电离辐射常以小麦-亲缘物种杂种、异附加系或代换系的种子、减数分裂期成株和花粉为处理对象[3]。目前利用种子或减数分裂期成株进行辐射已得到了小麦与黑麦、簇毛麦、山羊草、冰草、新麦草等至少5个亲缘属的易位系[4]，但利用花粉辐射选育易位系的报道还很少见。
大赖草属于禾本科小麦族赖草属，主要分布在前苏联的南欧、西伯利亚以及我国新疆等沙丘和沙漠中。大赖草除对不良环境有很好的适应性外，还抗小麦赤霉病、根腐病等多种真菌性病害，而且具有大穗大粒等优良性状。为了将大赖草有利基因 导入小麦，南京农业大学细胞遗传所于1985年开始了小麦与大赖草的远缘杂交工作，目前已经得到一批小麦-大赖草异附加系[5，6]，其中分别添加了大赖草Lr.2、Lr.7和Lr.14染色体的异附加系对赤霉病表现出较好的抗性[7]。
, 百拇医药
本研究在上述工作基础上，以小麦-大赖草抗赤霉病异附加系为起始材料，采用花粉辐射手段，力图对花粉辐射诱发易位的可行性及有效性进行探讨，并从辐射后代中筛选小麦大赖草易位系，为小麦遗传研究及育种提供有用的遗传材料.
1 材料和方法
1.1 供试材料
小麦-大赖草Lr.2染色体二体异附加系94G45以及Lr.14二体异附加系94G15；普通小麦品种扬麦5号、绵阳11号等，均由本所提供。
1.2 实验方法
1.2.1 花粉辐射及辐射后代处理 取小麦-大赖草二体异附加系即将大量开花的麦穗，用60Co-γ射线进行辐射处理。辐射剂量率为100R/分，总剂量1 000R。辐射后立即从处理过的麦穗上采集花粉，给3～4d前去雄的麦穗授粉，并套袋隔离。辐射M1植株在花粉母细胞减数分裂中期I观察大赖草染色体与小麦染色体的配对情况。大赖草与小麦染色体发生配对的植株套袋自交，M2种子发芽、剪根，在有丝分裂中期用Giemsa C-分带和荧光原位杂交技术筛选、鉴定小麦-大赖草染色体易位系。
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1.2.2 细胞遗传学研究方法 根尖细胞有丝分裂染色体制片：种子在垫有2层湿润滤纸的培养皿内于25℃下萌发。当根长至1～1.5cm时剪取2条种子根，置0℃冰水中处理24h，然后用卡诺氏固定液(3份95%乙醇1份冰醋酸)固定2～7d，在45%醋酸中压片，相差镜下观察，计数。花粉母细胞染色体制片：挑取含中期I分裂相的花药，在卡诺氏固定液中固定。在45%醋酸中压片。染色体Giemsa C-分带：根尖或花粉母细胞染色体制片在-70℃冰箱中冰冻，揭去盖片，在100%乙醇中过夜。染色体分带具体程序参照Gill(1991)[8]方法。荧光原位杂交：以bio-11-dUTP标记的大赖草基因组DNA为探针。DNA提取及探针的生物素标记、原位杂交过程同陈佩度的方法[9]。DNA杂交信号的放大与检测采用兔抗生物素抗体和连结FITC的绵羊抗兔抗体系统。在450～490nm波长下观察杂交结果，大赖草染色质部分呈黄绿色，小麦染色体呈红棕色。具体方法参照Friebe(1993)[2]。
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2 结果与分析
2.1 花粉辐射对杂交当代(M0)结实率的影响
分别取小麦柎罄挡軱r.2以及Lr.14染色体二体异附加系94G45和94G15的即将大量开花的穗子进行60Co-γ射线处理，辐射剂量1 000R。用经辐射处理穗子的花粉给3～4d前已去雄的扬麦5号和绵阳11号授粉。共授粉1 469朵小花，得杂交种 子617粒，平均杂交结实率为42%左右，比对照杂交结实率下降23.1%～48.9%(表1)。由此可见，1 000R的辐射剂量低于或接近半致死剂量。
表1 花粉国辐射当代Mo杂交结实率
Table 1 Seed setting percentage of pollen-irradiated Mo 杂交结合
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Hybrid combination
授粉小花数
No.of pollinated floret
结实小花数
No.of seedy florets
结实率(%)
Percentage of
seed setting(%)
结实率比
Ck降低(%)
Percentage lower
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than check(%)
Yangmai 5×94G15 pollenIKR
919
314
34.2
48.9
Yangmai 5×94G15(CK1)
130
108
83.1
-
Mianyang 11×94G15 pollenIKR
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219
137
62.6
23.1
Mianyang 11×94G15(CK2)
105
90
85.7
-
Mianyang 11×94G45 pollenIKR
331
166
, 百拇医药
50.2
36.0
Mianyang 11×94G45(CK3)
130
112
86.2
-
2.2 花粉辐射M1植株PMC MI染色体配对分析
花粉辐射所获M1种子中590粒当年夏季南繁加代失败，余下27粒秋季播种在南京农业大学实验网室，只有17粒出苗，长成植株。对这17株进行了PMC MI染色体配对构型分析，结果有12株(64.6%)PMC MI有多价体构型，形成的多价体多为三价体和四价体，也有个别为五价体、六价体，有些单株PMC MI同时含有3～4个多价体构型(图版I-1，2)。不同杂交组合后代PMC MI出现多价体的个体数相差很大：扬麦5号×94G15花粉IKR后代观察的8株全有多价体，其中有6株(75.0%)PMC MI出现2个以上多价体构型；绵阳11×94G15花粉IKRM1后代观察的3株中有2株(66.7%)具多价体；绵阳11×94G45花粉IKR组合观察了6 株，其中只有1株(16.7%)具有多价体。而未经辐射的对照(扬麦5号×94G45)F1每个MI期的花粉母细胞均含有1个四价体，(绵阳11×94G15)F1和(绵阳11×94G45)F1单株PMC MI没有出现多价体构型(表2)。表2 花粉辐射后代PMC MI具多价体配对构型及发生异源染色体配对个体数
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Table 2 Number of plants with multivalent of paired chromosome of L racemosus 杂交结合
Hybrid combination
观察株数
No.of observed plants
具多价体株数
No.of plants sith multivalent
小麦-大赖草染色体配对株数
No.of plants with paired Lr
Yangmai 5×94G15 pollenIKR
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8
8a
3
Yangmai 5×94G15(CK1)
10
10b
0
Mianyang 11×94G15 pollenIKR
3
2
1
Mianyang 11×94G15(CK2)
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8
0
0
Mianyang 11×94G45 pollenIKR
6
1
0
Mianyang 11×94G45(CK3)
12
0
0
注：a.其中6株的花粉母细胞有2个以上多价体；b.花粉母细胞有一个四价体
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Note：a.Among which,there are six plants with above two multivalents in a PMC.
b.There is a quadrivalent in a PMC
为了确定大赖草染色体是否参与了染色体配对。我们对PMC MI染色体进行了Giemsa C-分带和荧光原位杂交.结果在具有多价体的10个单株中有4株大赖草染色体与小麦发生了配对(图版I-3)。染色体荧光原位杂交结果也清晰地显示出呈黄绿色的大赖草染色体与显红棕色的小麦染色体发生了配对(图版II-1)。其中扬麦5号×94G15花粉IKR组合有3株[LW8(4)2、LW8-4、LW8(3)1]、绵阳11×94G15花粉IKR组合有1株[LW11(3)1]发生了大赖草与小麦染色体的配对(表2)。此外，在另外7株无多价体构型的辐射后代中，扬麦5号×94G15花粉IKR组合有1株[LW8(3)2]大赖草染色体与小麦配成棒状二价体。
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在通常情况下，大赖草染色体与小麦染色体不发生配对。因此，初步推测上述这5株大赖草与小麦染色体发生配对的单株很有可能含有小麦-大赖草易位染色体.
2.3 花粉辐射M2代小麦-大赖草易位系的筛选与鉴定
对上述5株可能已发生了小麦-大赖草染色体易位的植株自交M2种子根尖细胞有丝分裂中期染色体进行了Giemsa C-分带和荧光原位杂交分析.结果证实来自扬麦5号×94G15花粉IKR的LW8(3)1以及来自绵阳11×94G15花粉IKR组合的LW11(3)1 2个单株的确含有小麦-大赖草易位染色体.
根据染色体荧光原位杂交结果，LW8(3)1易位系的染色体易位断点在大赖草Lr.14短臂近末端处，属于由绝大部分大赖草染色体与一小段小麦染 色体组成的顶端易位类型，大赖草染色体易位片段占易位染色体总长的78%左右(图版II-2)。从Giemsa C-分带照片上可以看到LW8(3)1有丝分裂中期I的根尖细胞中含有2条与小麦染色体明显不同的染色体，该染色体短臂末端有一些很弱的C-分带.长臂末端有一很强的C-带(图版Ⅱ-4)。大赖草Lr.14染色体长臂末端有一强C-带，短臂末端没有C-带.因此，该染色体是大赖草Lr.14染色体的长臂及短臂的一部分和某条小麦染色体的一小段组成的易位染色体。但仅根据C-分带结果很难确定这一小段染色体片段来自小麦的哪条染色体
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经过染色体Giemsa C-分带结果来看，LW11(3)1的染色体易位发生在大赖草Lr.14长臂和小麦6B染色体短臂之间，易位断点在6B染色体Giemsa C-带S2.2区，FL0.42附近，易位染色体为T6BL.6BS朙r.14L(图版I5，6)。荧光原位杂交结果表明，大赖草染色体Lr.14易位片段占易位染色 体短臂长度的67%，占易位染色体总长的29%左右(图版II-3)。
这2个易位系自交均可正常结实，自交结实率在90%以上。它们的抗赤霉病性状正在鉴定之中。
3 讨论
花粉辐射在小麦中的应用主要在产生单倍体植株[10]、提高远缘杂种植株获得率[11]和产生带有少数父本性状的偏母后代[12]方面。尽管Snape(1983)在花粉辐射M1和M2代中发现了端体、缺失体、双着丝粒染色体以及小麦染色体间的相互易位等染色体结构变异[12]，但迄今尚未见到利用花粉辐射诱发小麦-亲缘物种染色体易位的其他报道.陶舜华(1989)用低剂量γ射线辐射大赖草花粉，然后给波斯小麦、新疆小麦授粉，经胚培养后杂种植株获得率提高到21.6%，并且得到了具有某些大赖草特征的普通小麦[11]。但尚不能确定经过花粉辐射后小麦与大赖草染色体是否发生了易位。花粉辐射在其他 植物，如烟草、大麦、玉米、番茄，豌豆、油菜、辣椒和番薯上的应用也基本上集中在诱导单倍体、提高远缘杂交结实率和获得只带少数父本性状的偏母本后代方面[13]，利用花粉辐射诱发染色体易位的研究尚未见报道。
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本研究以小麦-大赖草异附加二体为起始材料，利用即将成熟的花粉进行辐射处理，结果从17株M1中就选到2个不同类型的易位系，小麦-大赖草染色体之间发生易位的单株频率达到11.8%，表明花粉辐射是诱发小麦-亲缘物种染色体将近位的一个好方法.但由于所用样本比较少，而且实验追踪的只是小麦大赖草染色体间的易位情况，本研究只是在花粉辐射诱发染色体易位方面进行了初步尝试，尚难对花粉辐射对染色体易位的作用作出综合、准确的评定.
染色体Giemsa C-分带技术和以基因组DNA为探针的分子原位杂交技术等为小麦-亲缘物种易位系的鉴定提供了精确可靠的手段.这些技术与传统细胞遗传分析方法，如PMC MI染然体构型分析以及染色体臂比、大小、随体的有无等形态分析相结合，既缩短了选育易位系所需时间，又提高了鉴定易位系的准确性[14，15]。我们将PMC MI染色体构型分析、Giemsa C-分带和原位杂技术相结合，从花粉辐射到小麦-赖草易位系的确定只用了不足2年的时间.
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染色体结构变异体，如缺失体和易位系在构建控制表型性状的基因、生化标记以及DNA分子标记的物理图谱，研究染色体结构与功能，转换基因位点之间的遗传连锁距离和实际物理距离以及分离与克隆基因方面都有很大利用价值[16]。本研究得到的2个易位系中大赖草染色体片段从占染色体总长的29%到78%，采用这种方法，可望获得一系列涉及不同长度大赖草染色体片段的易位系，可为大赖草基因定位，构建生化以及DNA分子标记物理 图谱以及向小麦转移大赖草有利基因等方面的研究提供有用的遗传材料。
致谢：江苏省农科院原子能所协助辐射处理，谨致谢忱。
1.花粉辐射M1代PMC MI染色体构型，示17Ⅱ+1Ⅳ+1Ⅴ；
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2.花粉辐射M1代PMC MI染色体构型，示15Ⅱ+2Ⅳ+1Ⅴ；
3.花粉辐射M1代PMC MI染色体C-带，示Lr.14与小麦染色体配成本价体；
4.LW8(3)1的RTC染色体C-分带，箭头所指为易位染色体；
5.LW11(3)1的RTC染色体C-分带，箭头所指为T6BL.BS-Lr14L易位染色体；
6.小麦6B、大赖草Lr.14染色体和T6BL.BS-Lr14L易位染色体；
1.Meiotic configuration of M1 plant derived from irradiated pollens.
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Seventeen bivalents,one quadrivalent and a pentivalent are showed;
2.Meiotic configuration of M1 plant derived from irradiated pollens.
Fifteen bivalents,two quadrivalents and a pentivalent are showed;
3.Giemsa C-banding of PMC MI chromosome of M1 plants.
A trivalent composed of Lr.14 and two wheat chromosomes are showed;
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4.RTC C-banded chromosomes of LW8(3)1,arrows show two translocation chromosomes;
5.RTC C-banded chromosomes of LW11(3)1,two translocation chromosomes are showed;
6.C-banded 6B of wheat ,Lr14 of L.racemosus and T6BS.6BL-Lr.14L
1.花粉辐射M1代PMC MI染色体原位杂交，示Lr.14与小麦染色体配成三价体；
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2.LW8(3)2的RTC染色体原位杂交；
3.LW11(3)1的RTC染色体原位杂交；
1.FISH of PMC MI chromosomes of M1 plants .
A trivalent composed of Lr.14 and two wheat chromosemes is showed;
2.FISH of RTC chromosomes of LW8(3)2;
3.FISH of RTC chromosomes of LW11(3)2;
参考文献
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