急性早幼粒细胞白血病的分子标记及其在细胞分化研究中的意义
作者：朱跃军 童建华 曹琪 孙关林 王振义 陈赛娟 陈竺 曹华 耿解萍
单位：(上海第二医科大学附属瑞金医院，200025)；朱跃军 童建华 曹琪 孙关林 王振义 陈赛娟 陈竺；(军事医学科学院附属307医院)曹华；(中国科学院上海生物化学研究所)耿解萍
关键词：白血病，髓细胞性；维甲酸；受体，药物；重组，基因；细胞分化
中华医学杂志920412
摘要 应用自行研制，能覆盖整个维甲酸受体A基因的探针，检测25例急性早幼粒细胞白血病患者其中23例有基因重组(占92%)，且这些重组均定位于维甲酸受体A(RARA)基因的内含子2。故RARA基因重组可视为急性早幼粒细胞白血病的一种高度特异性分子标记。对2例急性早幼粒细胞白血病用全反式维甲酸(ATRA)诱导缓解过程中的RARA基因结构和细胞形态学进行了动态观察，证明ATRA确实能诱导急性早幼粒细胞白血病细胞在体内分化成熟。
, 百拇医药
非随机性的染色体异常在人类造血系统肿瘤发病机制中起重要作用。急性早幼粒细胞白血病(APL)具有特异的染色体易位t(15；17)(q22；q21)。最近，发现t(15；17)累及17号染色体的维甲酸受体A(ARAR)基因，以及15号染色体上的一个未知基因[1～4]。由于APL细胞在全反式维甲酸(all-trans retinoic acid ATR-A)诱导下可发生分化，这一发现具有重要的意义[5，6]。我们用分离到的能覆盖RARA基因内含子2(长17kb)的5'和3'末端的探针，检测了25例APL，发现23例有基因重组，且其中22例的重组定位于RARA基因的内含子2。利用RARA基因重组作为疾病的分子标记，证明在用ATRA诱导缓解期间，APL细胞在骨髓内发生分化成熟。
对象与方法
1、25例APL患者，其中24例为初发，1例为复发(附表)。APL的诊断系根据FAB标准(M3型)[7]。
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2、细胞遗传学：20例患者按常规G带和R带法作了染色体检查。19例有典型的t(15；17)(q22；21)易位，1例病人有t(11；17)(q23；q21)变异型易位。
3、分子生物学：按常规方法进行Southern印迹分析。用含RARA基因外显子2和3部分顺序的cDNA片段作为探针，筛选了一个人DNA基因库，得到了7个噬菌体克隆，并建立了限制性内切酶图谱(图1)。共分离到5个不含重复顺序的DNA片段，亚克隆至pGE-M blue质粒作为探针，其位置如图1所示。探针使用随机引物系统进行32P标记，比放射活性约为1×109cpm/μg DNA。
结 果
一、APL中RARA基因的重组丛集于基因的内含子2
附表 25例APL患者的细胞遗传学和分子生物学研究结果 病例号
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性
别
年龄
(岁)
病
期
染色体易位
t(15；17)
RARA基因重组
5'端(0.6KbHE)探针
3'端(5.5KbEE)探针
1
男
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注：D初诊；R复发，CR完全缓解(基因重组消失)
我们以前的研究证明，在APL患者中，RARA基因转录本的长度有异常。除了正常细胞可见的3.2kb和4.0kb RARA mRNA条带外，在APL细胞中还存在着长度分别为4.3～4.5kb和3.5～3.7kb的转录本。为了研究APL中RARA基因的结构异常，我们克隆了RARA基因大部，如图1所示，应用含人RARA cDNA外显子2，3部分顺序的探针，筛选了一个人基因组DNA库，共得到7个噬菌体克隆(54、61、64、66、97、100、105)。限制性内切酶谱分析表明，克隆54至100间相互重叠，覆盖一个25kb的区域，克隆105覆盖15kb，但与其它克隆间没有直接的物理关系。通过一系列杂交试验，我们证明克隆54～100所覆盖的25kb含有基因的第3至最后一个外显子，而克隆105含有基因的外显子2，定位于克隆54～100区域的5'上方。进而我们从克隆105分离了一个0.6kb的Hind III-Eco-RI片段(HE探针)，从克隆54分离了一个5.5kb的EcoRI-EcoRI片段(EE探针)，对一组正常人和APL的DNA进行了Southern分析，结果发现这两个探针能够显示同一条18kb的Hind III正常条带。根据测算，在克隆105和54之间的空隙为3kb。这样，我们就确定了整个基因的转录方向及大致结构，发现在外显子2，3之间有一个17kb的大内含子(内含子2)(图1)。
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注：限制性内切酶B(BamHI)；Bg(Bg1II)；E(EcoRI)；H(HindIII)；K(KpnI)。带箭头的黑方块表示外显子及其转录方向。虚线代表克隆105和其它嗜菌体克隆间的“空隙”，其中的一个BamHI和一个Bg1II位点系根据人基因组DNA的Southern杂交结果确定。图谱上、下的黑方块代表使用的探针，上方数字系23例APL的染色体断裂点位置，数字表示病例号
图1 RARA基因的限制性内切酶图谱及APL患者白血病细胞17号染色体断裂点的定位
根据对维甲酸受体基因结构的了解，其3'端编码配基结合域(Ligand binding domain)，5'端编码DNA结合域和反激活(trans-a-ctivation)功能域。APL中的异常受体为了保留与维甲酸结合的能力，必须维持3'端编码顺序的完整性。我们推测APL中异常RARA mRNA的出现很可能是由于染色体易位所致的基因重组，而此种重组较可能发生在基因的5'端。为了证实这个假设，我们应用0.6Kb HE和5.5KbEE探针以及三种限制性内切酶：Bg1II、EcoRI 和 HindIII，对25例APL的DNA进行了Southern分析，结果在23例患者检测到了基因重组(图2)，而在一组其他类型白血病(急性粒细胞性白血病M1型，慢性粒细胞性白血病，毛细胞性白血病等)未检测到基因结构的改变。
, 百拇医药
为了了解染色体易位t(15；17)对RARA基因结构、功能带来的后果，有必要进一步限定断裂点在RARA基因外显子-内含子结构中的确切位置。限制性酶切图谱分析示外显子2内有一个KpnI位点，而在外显子3上游邻近处亦有一个KpnI位点。这两个位点恰好有助于染色体断裂点的精确定位。因此，我们加用了KpnI酶切以及相应的探针对APL患者的DNA进行分析。如图1所示(箭头)，23例中21例的染色体断裂点被定位于上述两个KpnI位点之间，亦即基因的内含子2内。另2例(例5，6)患者的断裂点位于外显子3上方的KpnI的下游。但该区域内仍有一小段内含子2的顺序，故断裂点仍可能位于内含子2。最近应用分子克隆 法和聚合酶链反应方法，证实例5、6的断裂点确在外显子3以上。因此，本文结果绝大多数APL患者17号染色体的断裂点分布于基因的内含子2，为RARA基因的断裂点集中区(RARA-BCR)，而外显子3以下的结构保持正常。
注：C 对照DNA，5、6、17、18、19为APL患者骨髓细胞DNA，编号同表一。指示正常条带，其分子量分别为：EcoRI；5.5kb；HindIII：18kb；Bg1II：13kb。箭头指示重组条带。
, 百拇医药
图2 RARA基因重组的若干代表性结果
二、RARA基因重组在APL细胞分化研究中的意义
ATRA是一个能诱导APL细胞形态分化并在体内治疗APL的有效药物。为了同时观察ATRA临床诱导APL缓解过程中的细胞学和RARA基因变化，我们对2例患者(例20、21)进行了治疗缓解前后的动态研究。如图3所示，例20的骨髓早幼粒细胞在ATRA给药的第14天下降至4%，分化的粒细胞(包括中幼粒，晚幼粒，杆状核及分叶核粒细胞)明显增加，但这些分化细胞仍带有某些形态异常如核/浆发育失衡等。Souther分析结果示重组条带的强度无明显改变，说明并非仅来自于残存的早幼粒细胞。在用ATRA治疗1个月后获得完全缓解，复查骨髓细胞RARA基因结构正常(图3)。例21，骨髓早幼粒细胞的百分率在ATRA治疗21天时明显下降(20%)，成熟粒细胞增多，但异常RARA基因重组带依然存在，且其强度仍相对较高，直到ATRA治疗30天后取得完全缓解时，重组条带方消失(图4)。
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注：上图：ATRA治疗的第1天、14天和经28天治疗后获完全缓解时的Southern分析结果，使用的探针为5.5kbEE。限制性内切酶缩写：H：HindIII；Bg：BglII；E：EcoRI。短线示正常条带。箭头指重组条带。下图：骨髓细胞分类图示。A 早幼粒细胞；B 分化粒系细胞(包括中幼粒、晚幼粒、杆核和分叶核细胞)；C 红系细胞；D 其它系列细胞。骨髓象分析系与Southern分析同一天对同一标本
图3 例20以ATRT诱导缓解过程中的分子生物学和骨髓细胞学检查结果
讨 论
细胞遗传学研究显示绝大多数APL患者细胞存在染色体易位t(15；17)。最近，使用原位杂交技术，将染色体断裂点定位于17q21，而非以前报告的17q11～12。这一位置正好与RARA基因的染色体定位相一致。为了揭示t(15；17)与维甲酸诱导APL细胞分化分子机制间的可能联系，本文研究了25例APL的RARA基因结构，结果23例有该基因的重组(92%)。现已明确，RARA基因重组系由于t(15；17)所致，后者使该基因与来自15号染色体的一个转录单位发生融合[3，4]。有意义的是，本组APL中17号染色体的断裂点几乎都定位于RARA基因的内含子2，因此在所形成的融合基因中，由RARA基因外显子2编码的N末端区编码顺序缺失，为15号染色体的基因顺序所替代，从而可能改变受RARA调节的靶基因谱，在APL的发病原理及APL细胞对ATRA的特殊反应中发挥作用。由于在其它类型的白血病未见RARA基因结构的改变，故该基因的重组也为APL提供了一个特异的标记。此外，本组一例伴变异型染色体易位t(11；17)的APL患者，亦有RARA基因重组，提示变异型易位与经典的t(15；17)具有类似的分子基础。应当指出，本组有2例形态学(FAB-M3)、细胞遗传学存在t(15；17)及临床(对ATRA治疗有效)均为典型的APL病例，未能检测出RARA基因重组，有必要进一步分析。
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体外实验证明维甲酸能诱导HL-60细胞分化，在维甲酸作用下，早幼粒白血病细胞形态逐渐成熟，膜分化抗原CD15表达增加[8]。国内自1986年开始应用ATRA治疗APL，缓解率达85～90%。与细胞毒药物比较，ATRA疗程中不出现骨髓功能抑制，DIC发生率减少，分化的中性分叶核粒细胞内出现Auer小体，从而提示ATRA在APL患者体内有诱导分化作用。本组病例以RARA基因重组作为APL细胞的特异标记，观察了2例APL诱导缓解过程中白血病细胞克隆的演变，结果在ATRA治疗的第2～3周，早幼粒细胞明显减少(可达5%以下)，而分化的粒系细胞在骨髓中的比例大为增高，然而RARA基因的重组条带仍然存在，且其相对强度与ATRA治疗前比较无明显改变，说明此时绝大多数形态学趋向成熟的骨髓粒细胞仍带有白血病克隆的标记。在治疗4～5周临床取得完全缓解后，骨髓细胞的RARA基因结构异常才能消失。因此，RARA基因重组的检测为ATRA诱导APL细胞的分化提供了强有力的证据。但ATRA诱导分化作用的确切机制仍待阐明。
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注：上图：ATRA治疗第0、7、14、21和30天时的Southern分析。使用探针为0.6kbHE 下图：骨髓细胞分类图(同图3)。骨髓像分析系与Soutbern分析同一天同一标本
图4 例21在ATRA治疗期间的分子生物学和骨髓细胞学检查结果
本课题系上海市科委自然科学基金、霍英东青年教师科研基金资助项目
参考文献
1 Lemons RS, et al. Cloning and characterization of the t(15；17) translocation breakpoint region in acute promyelocytic leukemia. Genes Chromosomes Cancer 1990;2:79.
, 百拇医药 2 Borrow J, et al.Molecular analysis of acute promyelocytic leukemia breakpoint cluster region on chromosome 17. Science 1990;249:1577
3 de The H,et al. The t(15；17) translocation of acute promyelocytic leukaemia fuses the retinoic acid receptor a gene to a novel transcribed locus. Nature 1990;347:558.
4 Chen Z, et al. The retinoic acid alpha receptor gene is frequently disrupted in its 5' part in Chinese patients with promyelocytic acute leukemia Leukemia 1991;5:288.
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5 Huang ME, et al. Use of all-trans retinoic acid in the treatment of acute promyelocytic leukemia. Blood 1988;72:567.
6 Wang ZY, et al. Treatment of acute promyelocytic leukemia with all-trans retinoic acid in China. Nouv Rev Fr Hematol 1990;32:34.
7 Bennett JM, et al. Proposals for the classification of the acute leukaemias. Br J Haematol 1976;33:451.
8 Koeffler, HP. Induction of differentiation of human acute myelogenous leukemia cells : Therapeutic implications. Blood 1983:62:709., http://www.100md.com
单位：(上海第二医科大学附属瑞金医院，200025)；朱跃军 童建华 曹琪 孙关林 王振义 陈赛娟 陈竺；(军事医学科学院附属307医院)曹华；(中国科学院上海生物化学研究所)耿解萍
关键词：白血病，髓细胞性；维甲酸；受体，药物；重组，基因；细胞分化
中华医学杂志920412
摘要 应用自行研制，能覆盖整个维甲酸受体A基因的探针，检测25例急性早幼粒细胞白血病患者其中23例有基因重组(占92%)，且这些重组均定位于维甲酸受体A(RARA)基因的内含子2。故RARA基因重组可视为急性早幼粒细胞白血病的一种高度特异性分子标记。对2例急性早幼粒细胞白血病用全反式维甲酸(ATRA)诱导缓解过程中的RARA基因结构和细胞形态学进行了动态观察，证明ATRA确实能诱导急性早幼粒细胞白血病细胞在体内分化成熟。
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非随机性的染色体异常在人类造血系统肿瘤发病机制中起重要作用。急性早幼粒细胞白血病(APL)具有特异的染色体易位t(15；17)(q22；q21)。最近，发现t(15；17)累及17号染色体的维甲酸受体A(ARAR)基因，以及15号染色体上的一个未知基因[1～4]。由于APL细胞在全反式维甲酸(all-trans retinoic acid ATR-A)诱导下可发生分化，这一发现具有重要的意义[5，6]。我们用分离到的能覆盖RARA基因内含子2(长17kb)的5'和3'末端的探针，检测了25例APL，发现23例有基因重组，且其中22例的重组定位于RARA基因的内含子2。利用RARA基因重组作为疾病的分子标记，证明在用ATRA诱导缓解期间，APL细胞在骨髓内发生分化成熟。
对象与方法
1、25例APL患者，其中24例为初发，1例为复发(附表)。APL的诊断系根据FAB标准(M3型)[7]。
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2、细胞遗传学：20例患者按常规G带和R带法作了染色体检查。19例有典型的t(15；17)(q22；21)易位，1例病人有t(11；17)(q23；q21)变异型易位。
3、分子生物学：按常规方法进行Southern印迹分析。用含RARA基因外显子2和3部分顺序的cDNA片段作为探针，筛选了一个人DNA基因库，得到了7个噬菌体克隆，并建立了限制性内切酶图谱(图1)。共分离到5个不含重复顺序的DNA片段，亚克隆至pGE-M blue质粒作为探针，其位置如图1所示。探针使用随机引物系统进行32P标记，比放射活性约为1×109cpm/μg DNA。
结 果
一、APL中RARA基因的重组丛集于基因的内含子2
附表 25例APL患者的细胞遗传学和分子生物学研究结果 病例号
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性
别
年龄
(岁)
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染色体易位
t(15；17)
RARA基因重组
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注：D初诊；R复发，CR完全缓解(基因重组消失)
我们以前的研究证明，在APL患者中，RARA基因转录本的长度有异常。除了正常细胞可见的3.2kb和4.0kb RARA mRNA条带外，在APL细胞中还存在着长度分别为4.3～4.5kb和3.5～3.7kb的转录本。为了研究APL中RARA基因的结构异常，我们克隆了RARA基因大部，如图1所示，应用含人RARA cDNA外显子2，3部分顺序的探针，筛选了一个人基因组DNA库，共得到7个噬菌体克隆(54、61、64、66、97、100、105)。限制性内切酶谱分析表明，克隆54至100间相互重叠，覆盖一个25kb的区域，克隆105覆盖15kb，但与其它克隆间没有直接的物理关系。通过一系列杂交试验，我们证明克隆54～100所覆盖的25kb含有基因的第3至最后一个外显子，而克隆105含有基因的外显子2，定位于克隆54～100区域的5'上方。进而我们从克隆105分离了一个0.6kb的Hind III-Eco-RI片段(HE探针)，从克隆54分离了一个5.5kb的EcoRI-EcoRI片段(EE探针)，对一组正常人和APL的DNA进行了Southern分析，结果发现这两个探针能够显示同一条18kb的Hind III正常条带。根据测算，在克隆105和54之间的空隙为3kb。这样，我们就确定了整个基因的转录方向及大致结构，发现在外显子2，3之间有一个17kb的大内含子(内含子2)(图1)。
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注：限制性内切酶B(BamHI)；Bg(Bg1II)；E(EcoRI)；H(HindIII)；K(KpnI)。带箭头的黑方块表示外显子及其转录方向。虚线代表克隆105和其它嗜菌体克隆间的“空隙”，其中的一个BamHI和一个Bg1II位点系根据人基因组DNA的Southern杂交结果确定。图谱上、下的黑方块代表使用的探针，上方数字系23例APL的染色体断裂点位置，数字表示病例号
图1 RARA基因的限制性内切酶图谱及APL患者白血病细胞17号染色体断裂点的定位
根据对维甲酸受体基因结构的了解，其3'端编码配基结合域(Ligand binding domain)，5'端编码DNA结合域和反激活(trans-a-ctivation)功能域。APL中的异常受体为了保留与维甲酸结合的能力，必须维持3'端编码顺序的完整性。我们推测APL中异常RARA mRNA的出现很可能是由于染色体易位所致的基因重组，而此种重组较可能发生在基因的5'端。为了证实这个假设，我们应用0.6Kb HE和5.5KbEE探针以及三种限制性内切酶：Bg1II、EcoRI 和 HindIII，对25例APL的DNA进行了Southern分析，结果在23例患者检测到了基因重组(图2)，而在一组其他类型白血病(急性粒细胞性白血病M1型，慢性粒细胞性白血病，毛细胞性白血病等)未检测到基因结构的改变。
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为了了解染色体易位t(15；17)对RARA基因结构、功能带来的后果，有必要进一步限定断裂点在RARA基因外显子-内含子结构中的确切位置。限制性酶切图谱分析示外显子2内有一个KpnI位点，而在外显子3上游邻近处亦有一个KpnI位点。这两个位点恰好有助于染色体断裂点的精确定位。因此，我们加用了KpnI酶切以及相应的探针对APL患者的DNA进行分析。如图1所示(箭头)，23例中21例的染色体断裂点被定位于上述两个KpnI位点之间，亦即基因的内含子2内。另2例(例5，6)患者的断裂点位于外显子3上方的KpnI的下游。但该区域内仍有一小段内含子2的顺序，故断裂点仍可能位于内含子2。最近应用分子克隆 法和聚合酶链反应方法，证实例5、6的断裂点确在外显子3以上。因此，本文结果绝大多数APL患者17号染色体的断裂点分布于基因的内含子2，为RARA基因的断裂点集中区(RARA-BCR)，而外显子3以下的结构保持正常。
注：C 对照DNA，5、6、17、18、19为APL患者骨髓细胞DNA，编号同表一。指示正常条带，其分子量分别为：EcoRI；5.5kb；HindIII：18kb；Bg1II：13kb。箭头指示重组条带。
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图2 RARA基因重组的若干代表性结果
二、RARA基因重组在APL细胞分化研究中的意义
ATRA是一个能诱导APL细胞形态分化并在体内治疗APL的有效药物。为了同时观察ATRA临床诱导APL缓解过程中的细胞学和RARA基因变化，我们对2例患者(例20、21)进行了治疗缓解前后的动态研究。如图3所示，例20的骨髓早幼粒细胞在ATRA给药的第14天下降至4%，分化的粒细胞(包括中幼粒，晚幼粒，杆状核及分叶核粒细胞)明显增加，但这些分化细胞仍带有某些形态异常如核/浆发育失衡等。Souther分析结果示重组条带的强度无明显改变，说明并非仅来自于残存的早幼粒细胞。在用ATRA治疗1个月后获得完全缓解，复查骨髓细胞RARA基因结构正常(图3)。例21，骨髓早幼粒细胞的百分率在ATRA治疗21天时明显下降(20%)，成熟粒细胞增多，但异常RARA基因重组带依然存在，且其强度仍相对较高，直到ATRA治疗30天后取得完全缓解时，重组条带方消失(图4)。
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注：上图：ATRA治疗的第1天、14天和经28天治疗后获完全缓解时的Southern分析结果，使用的探针为5.5kbEE。限制性内切酶缩写：H：HindIII；Bg：BglII；E：EcoRI。短线示正常条带。箭头指重组条带。下图：骨髓细胞分类图示。A 早幼粒细胞；B 分化粒系细胞(包括中幼粒、晚幼粒、杆核和分叶核细胞)；C 红系细胞；D 其它系列细胞。骨髓象分析系与Southern分析同一天对同一标本
图3 例20以ATRT诱导缓解过程中的分子生物学和骨髓细胞学检查结果
讨 论
细胞遗传学研究显示绝大多数APL患者细胞存在染色体易位t(15；17)。最近，使用原位杂交技术，将染色体断裂点定位于17q21，而非以前报告的17q11～12。这一位置正好与RARA基因的染色体定位相一致。为了揭示t(15；17)与维甲酸诱导APL细胞分化分子机制间的可能联系，本文研究了25例APL的RARA基因结构，结果23例有该基因的重组(92%)。现已明确，RARA基因重组系由于t(15；17)所致，后者使该基因与来自15号染色体的一个转录单位发生融合[3，4]。有意义的是，本组APL中17号染色体的断裂点几乎都定位于RARA基因的内含子2，因此在所形成的融合基因中，由RARA基因外显子2编码的N末端区编码顺序缺失，为15号染色体的基因顺序所替代，从而可能改变受RARA调节的靶基因谱，在APL的发病原理及APL细胞对ATRA的特殊反应中发挥作用。由于在其它类型的白血病未见RARA基因结构的改变，故该基因的重组也为APL提供了一个特异的标记。此外，本组一例伴变异型染色体易位t(11；17)的APL患者，亦有RARA基因重组，提示变异型易位与经典的t(15；17)具有类似的分子基础。应当指出，本组有2例形态学(FAB-M3)、细胞遗传学存在t(15；17)及临床(对ATRA治疗有效)均为典型的APL病例，未能检测出RARA基因重组，有必要进一步分析。
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体外实验证明维甲酸能诱导HL-60细胞分化，在维甲酸作用下，早幼粒白血病细胞形态逐渐成熟，膜分化抗原CD15表达增加[8]。国内自1986年开始应用ATRA治疗APL，缓解率达85～90%。与细胞毒药物比较，ATRA疗程中不出现骨髓功能抑制，DIC发生率减少，分化的中性分叶核粒细胞内出现Auer小体，从而提示ATRA在APL患者体内有诱导分化作用。本组病例以RARA基因重组作为APL细胞的特异标记，观察了2例APL诱导缓解过程中白血病细胞克隆的演变，结果在ATRA治疗的第2～3周，早幼粒细胞明显减少(可达5%以下)，而分化的粒系细胞在骨髓中的比例大为增高，然而RARA基因的重组条带仍然存在，且其相对强度与ATRA治疗前比较无明显改变，说明此时绝大多数形态学趋向成熟的骨髓粒细胞仍带有白血病克隆的标记。在治疗4～5周临床取得完全缓解后，骨髓细胞的RARA基因结构异常才能消失。因此，RARA基因重组的检测为ATRA诱导APL细胞的分化提供了强有力的证据。但ATRA诱导分化作用的确切机制仍待阐明。
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注：上图：ATRA治疗第0、7、14、21和30天时的Southern分析。使用探针为0.6kbHE 下图：骨髓细胞分类图(同图3)。骨髓像分析系与Soutbern分析同一天同一标本
图4 例21在ATRA治疗期间的分子生物学和骨髓细胞学检查结果
本课题系上海市科委自然科学基金、霍英东青年教师科研基金资助项目
参考文献
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