青海省1999年脊髓灰质炎Ⅰ型野毒株的分子病毒学分析
作者：侯晓辉 张礼璧 方勇 张勇 祝双利 赵生仓
单位：侯晓辉 张礼璧 方勇 张勇 祝双利(中国预防医学科学院国家脊髓灰质炎实验室，北京 100050)；赵生仓(青海省卫生防疫站，西宁 810000)
关键词：脊髓灰质炎Ⅰ型野病毒；基因测序；同源性；Neighbor Joining；Bootstrap Test
中国计划免疫000202 摘要：自中国脊髓灰质炎(脊灰)监测网络建立以来，有报告的脊灰暴发和流行主要由脊灰Ⅰ型野病毒引起。1993年在新疆维吾尔自治区分离到1株Ⅲ型野病毒，但未发现Ⅱ型野病毒。此外，1995年、1996年在云南省发现2例Ⅰ型〔1〕、2例Ⅲ型境外输入野毒病例〔2〕。1994年10月以来我国本土未发现脊灰野病毒。但是，1999年10月从青海省循化撒拉族自治县分离到2株脊灰Ⅰ型野病毒，1株来自1位16月龄的病例，另1株来自该病例的接触者。应用基因测序法对该毒株做了VP1片段序列的测定，并与疫苗株SabinⅠ型参考株、国内曾经流行的脊灰Ⅰ型野病毒代表株、我国周边国家部分脊灰Ⅰ型野毒株的序列作了基因同源性比较，并由计算机用Neighbor Joining和Bootstrap Test方法分析处理，构建出它们之间的关系树，初步揭示了该毒株很可能是由境外传入我国。
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中图分类号：R373.2+2 文献标识码：A
文章编号：1006-916X(2000)02-0067-05
Molecular Analysis of the Wild TypeⅠPolioviruses Isolated in Qinghai Province，1999
HOU Xiao-hui, ZHANG Li-bi, FANG Yong, et al.
National Laboratory for Poliomyelitis, CAPM, Beijing 100050, China.
Abstract: Most poliomyelitis cases and heavy outbreaks in China before Oct. 1994 were caused by wild type Ⅰ poliovirus〔3-5〕. No wild type Ⅱ poliovirus but only one wild type Ⅲ poliovirus was reported in China〔6〕. In the years of 1995 and 1996, two wild type Ⅰ polioviruses〔1〕 and two wild type Ⅲ polioviruses〔2〕 imported from Myanmar were reported in Yunnan Province respectively. It has been five years that no indigenous wild poliovirus was isolated in China since the end of year 1994. However, two wild type Ⅰ polioviruses (PV1/QH3274/CHN99 and C3275c) were isolated recently from Xunhua county, Qinghai Province of China. PV1/QH3274/CHN99 was from an AFP case, a sixteen-month-old boy. Another isolate, C3275c, was from his close contact. The sequence of VP1 coding region (300nt) had been identified. No nucleotide difference was found between the two viruses in the 300nt length of VP1 coding region. We compared the homology and analyzed the sequence data of VP1 coding region by computer with the Neighbor Join and Bootstrap methods. The homology with the indigenous wild strains ranges from 77.6% to 82.27%, but it is more than 85% compared with that of the isolates from South Asia. It is acknowledged that the viruses will belong to different subgenetic groups if their homology is less than 85 percent〔9,10〕. The result thus shows that PV1/QH3274/CHN99 and C3275c have a farther genetic relationship with type Ⅰ wild polioviruses epidemic during 1989-1994 in China than with those during 1998-1999 in outh Asia, so this indicates that they are very likely the imported viruses. Although the homology with PV1/99031804/MMR99 is up to 93.38%, PV1/QH3274/CHN99 has the closest relations hips with the PV1/99010389/IND98 and PV1/99010408/IND98 in the dendrogram.
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Key words: Type Ⅰ wild poliovirus; Sequence; Homology; Neighbor Join and Bootstrap methods
自从Sabin活疫苗问世以来，世界范围内的脊髓灰质炎(脊灰)大流行得到了有效的控制，美洲及日本等国家和地区已经率先实现了本地区范围内无脊灰的目标。世界卫生大会(WHA)1988年决定全球在2000年消灭脊灰。在中国流行的脊灰野病毒以Ⅰ型为主，大致可分为4种基因型〔3～5〕，但1993年在新疆维吾尔自治区分离、鉴定出1株脊灰Ⅲ型野病毒〔6〕。我国政府和各级卫生行政部门对消灭脊灰高度重视，不仅组建了遍布全国的急性弛缓性麻痹(AFP)病例监测网络，而且在常规免疫的基础上，从1993年开始每年增加了2轮强化免疫活动，有效地控制和阻断了脊灰野病毒的流行。近年来脊灰病例大幅度下降，野病毒发现地区不断减少，1994年10月以来全国未再发现有本土野病毒。但鉴于中国地域辽阔，人口众多，而且周边国家仍有脊灰野病毒的流行，所以我们从来没有放松过实验室脊灰病毒监测，于1995年在云南省分离出Ⅰ型野病毒，1996年分离出Ⅰ型和Ⅲ型野病毒，证明病毒是由境外传入国内。本文报道从青海省循化撒拉族自治县1999年1例AFP病例粪便标本中分离到1株脊灰病毒，经过细胞传代，中和定型，PCR-RFLP分析〔7、8〕，编码病毒VP1片段基因序列测定，该毒株被鉴定为脊灰Ⅰ型野毒株。通过与周边国家流行脊灰Ⅰ型野病毒相同区段序列的比较，发现该病毒与国内曾经流行的脊灰Ⅰ型野毒株在所分析的序列区段上同源性有较大差异，同源性为77.6%～82.27%；而与我国一些周边国家近年流行株有较大的同源性，同源性在87.67%～93.38%。这提示该毒株从境外传入的可能性较大。这对及时掌握我国脊灰动态，研究对策，采取措施，进一步控制和阻断脊灰病毒的传播有重大意义。
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材料与方法
1 病毒标本 PV1/QH3274/CHN99病毒标本来自青海省循化撒拉族自治县1名16月龄从未服用脊灰活疫苗的男性AFP病例；C3275c病毒标本来自于其密切接触者，1名4岁的女性儿童。毒株由青海省卫生防疫站分离并初步鉴定后，中国预防医学科学院国家脊灰实验室做进一步的鉴定并用分子生物学方法分析。
2 参考病毒基因序列 1989～1993年国内脊灰病毒序列取自本室前期工作。标准疫苗SabinⅠ序列来自GeneBank。印度、柬埔寨、孟加拉、巴基斯坦、阿富汗和伊朗部分毒株序列由美国疾病控制和预防中心(CDC)Dr.Olen Kew提供。
3 引物 UG1： 5′-TTTGTGTCAGCGTGTAATGA-
3′； UC1： 5′-GAATTCCATGTCAAATCTAGA-3′。
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UG1为上游引物，对应于SabinⅠ序列的第2 402～2 421位核苷，UC1为下游引物，对应于SabinⅠ序列的第2 881～2 861位核苷。引物设计参照Balanant方法〔7〕，在上海生工生物公司合成。
4 PCR-RFLP 500μl细胞培养病毒悬液用酚-氯仿法提取病毒核酸，所得病毒RNA先由引物UC1进行逆转录反应，再加入上游引物UG1，在Perkin Elmer公司的GeneAMP PCR System9600上进行扩增反应，条件是：94℃20秒，45℃20秒，72℃30秒，共30个循环。所得产物cDNA长度为480bp。产物分别用DdeⅠ、HpaⅡ和HaeⅢ3种限制性内切酶做限制性片段长度多形性(RELP)分析。
5 自动测序 测序采用Sanger末端双脱氧终止法。扩增后的PCR产物经QIA quick kits纯化后，用Taq DyedeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit(Biosystem，INC，USA)进行标记反应，所用引物与PCR所用引物相同。样品经过4.75%聚丙烯酰胺和含8.3mol/L尿素的凝胶电泳分析，在377-18A Sequencer System(PE Corporation，USA)自动测序仪中测序。参考ABI操作方法(Prism Ready Reaction Dideoxy Termination Cycle Sequencing Kit，Applied Biosystem，Inc，USA)从两个方向进行测序，所得两段互补测序结果可以相互校正，以提高核酸序列的准确性。
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结 果
1 PCR-RFLP分析
扩增后的480bp核苷酸片段分别用3种限制性内切酶切割后经电泳分析，480bp的SabinⅠ被DdeⅠ切割为两段，长度分别为360bp和120bp；被HpaⅡ切割为两段，长度分别为278bp和202bp；被HaeⅡ切割为3段，长度分别为229bp、140bp和111bp。PV1/QH3274/CHN99被HaeⅡ切割为两段，长度分别为364bp和116bp；而在DdeⅠ和HpaⅡ酶切图谱上无酶切位点，均表现为480bp片段长度。其图形全部不同于SabinⅠ疫苗对照株的片段特征，故PV1/QH3274/CHN99及C3275c均为Ⅰ型脊灰野毒株，且PV1/QH3274/CHN99及C3275c酶切图谱完全相同(图1)。
图1 PCR-RFLP 3种酶切图谱
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A：HpaⅡ；B：DdeⅠ；C：HaeⅢ 1： DNA分子量对照(Φ×174/HaeⅢ)；
2～10： 依次为Sabin Ⅰ，Sabin Ⅱ，Sabin Ⅲ，QH174/CHN93，QH175/CHN93，QH176/CHN93，QH177/CHN93，PV1/QH3274/CHN99，C3275c。
QH： Qinghai； C/CHN：China； c： Contact(接触者)。地区后的两位数字代表毒株流行年份。
2 测序
通过比较双向cDNA产物的测序结果，可以得到PV1/QH3274/CHN99VPI和C3275c 2株病毒VP1区300个核苷基因序列。发现2株病毒序列完全相同，以下讨论仅以PV1/QH3274/CHN99为例。该序列从VP编码区起始点至第300位止(5′-3′)。
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GGTTTGGGGCAAATGCTCGAGAATATGATCGACAACAC
AGTCCGCGAGACGGTAGGGGCTTCAACCTCCAGGGACG
CTCTTCCAAACACCGAATACAGCGGTCCAGCACACTCC
AAAGAAATCCCTGCGCTTACCGCAGTGGAAACGGGAGC
CACGAATCCGTTGGTTCCCTCGGATACTGTACAGCTAG
ACATGTTATTCAACATAGATCACGGTCGGAGTCCAGCA
TTGAGTCCTTTTTCGCGCGTGGAGCGTGCGTAACCATA
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ATGACTGTGGACAATTCGGCCTCCACTACGTCA
3 PV1/QH3274/CHN99与国内及周边国家部分脊灰Ⅰ型野毒株同源性比较
PVI/QH3274/CHN99与疫苗对照株SabinⅠ、青海省1993年曾流行的脊灰Ⅰ型野毒株QH174/93、国内1989～1994年曾流行的脊灰Ⅰ型野病毒代表株、中国周边国家部分脊灰Ⅰ型野毒株VP1序列的同源性(%)比较见图2。
图2 PV1/QH3274/CHN99VPI株与SabinⅠ、青海QH174/CHN93、国内1989～1994年曾流行的脊灰Ⅰ型野病毒代表株以及中国周边国家部分脊灰Ⅰ型野毒株VPI序列的同源性比较(%)
注：C/CHN：CHINA； QH：Qinghai； JX：Jiangxi； XJ：Xinjiang； GX：Guangxi； GD：Guangdong； HaN：Hainan； YN：Yunnan； IRA：Iran； IND：India； PAK：Pakistan； AFG：Afghanistan。
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BAN：Bangladeshi； MMR：Myanmar。地区后的两位数字代表毒株流行年份。
4 系统树分析 用Neighbor Join和Bootstrap Test方法作基因序列亲源关系系统树如图3。
图3 基因序列亲源关系系统树
注：C/CHN：CHINA； QH：Qinghai； IRA：Iran；
IND：India； PAK：Pakistan； AFG：Afghanistan； BAN：Bangladeshi；
MMR：Myanmar； HaN：HaiNan； GX：GuangXi； SD：ShangDong；
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HeN：HeNan； HuB：HuBei； SC：SiChuan； XJ：
XingJiang。地区后的两位数字代表毒株流行年份。 由图3可见，PV1/QH3274/CHN99株明显不在国内流行株的分枝上，而是更加接近于印度1998年、缅甸1999年和孟加拉国1999年分离到的Ⅰ型野病毒的分枝。PV1/QH3274/CHN99与缅甸PV1/99031804/MMR99的同源性为93.38%，核苷差异有20个；与孟加拉国PV1/99031573/BAN99的同源性为92.33%，核苷差异有23个；与印度PV1/99010389/IND98的同源性为92.33%，核苷差异有23个；与印度PV1/99010408/IND98的同源性为92.33%，核苷差异有23个；与印度PV1/99010392/IND98的同源性为87.67%，核苷差异有37个。而在众多的国内株中，与之序列同源性最大的本土毒株是新疆C111/XJ90，同源性为82.27%，核苷差异有53个。虽然从核苷酸同源性分析上看，PV1/QH3274/CHN99与缅甸PV1/99031804/MMR99同源性值为最大，但是从树枝图上分析，与之亲源关系最为接近的却是印度的PV1/99010389/IND98和PV1/99010408/IND98。由此可以看出，PV1/QH3274/CHN99与印度1998年、缅甸1999年和孟加拉国1999年毒株有极为亲密的亲源关系，说明PV1/QH3274/CHN99极有可能是由南亚地区经过某种途径传入我国。
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讨 论
PV1/QH3274/CHN99与C3275c 2株病毒能在L20B细胞上分离与传代，经过特异血清的中和试验定型和PCR-RFLP型内鉴定，最终由序列分析结果确认为脊灰Ⅰ型野病毒。2株病毒的性状及核苷酸序列完全相同(以下讨论仅以PV1/QH3274/CHN99为例)。病人的临床诊断为脊灰，可以判定该AFP患者为脊灰野病毒病例。病人所在青海省循化撒拉族自治县在1993年前有过Ⅰ型野病毒的流行，但近5年来未再发现过野病毒病例。
通过分子生物学技术可揭示病毒基因型之间的关系，揭示病毒流行链的模式，是近年来病毒学研究的进展。序列分析不仅可以准确测定病毒的核苷酸序列，从理论上解释PCR-RFLP图谱，而且可以从系统树图上分析出该毒株与其它毒株亲源关系的远近，从而有助于判断毒株的来源，是本土病毒还是由境外传入的病毒。本文讨论的脊灰毒株PV1/QH3274/CHN99在编码VP1区的基因序列与SabinⅠ的同源性只有78.45%，有65个核苷的差异；与国内既往流行株的同源性为77.6%～82.27%，而与缅甸PV1/99031804/MMR99的同源性为93.38%，核苷差异仅有20个；与印度PV1/99010389/IND98的同源性为92.33%，核苷差异也只有23个。一般认为同源性差异超过15%就可以确定为不同的基因亚型〔9，10〕，毒株PV1/QH3274/CHN99与国内株的同源性差异均大于15%，与1995年缅甸输入株的同源性为78.93%，而与其它大部分南亚株的同源性差异均超过了15%，并且自1994年以后，每年经我国AFP病例和接触者分离的脊灰毒株为300～400株，除1995、1996年在云南发现4例由境外传入病例外，未发现过本土野病毒。由此可认为，PV1/QH3274/CHN99是由我国其它省份传入的可能性不大，而是由境外传入的可能性得到了许多证据的支持。从系统树上看，PV1/QH3274/CHN99枝是介于印度1998年流行株以及缅甸和孟加拉国1999年流行株之间，属于南亚地区流行的毒株，而与国内曾经流行的脊灰Ⅰ型野病毒相距较远。从而提示我们，PV1/QH3274/CHN99株极有可能是从南亚，特别是印度及其周边地区传入我国。同时从序列上我们也发现，尽管PV1/QH3274/CHN99株与印度1998年和缅甸1999年株相近，但是仍有6.6%的差异，可能是该毒株传入我国后已有一些改变。
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中国大陆地区的脊灰疫情和野病毒株基因型的分布和流行，从原来遍布全国到1993、1994年逐步被控制在人口流动性较大的南方省，目前已连续有5年未发现本土野病毒病例，但中国的中
西部地区由于经济的发展，人员的流动显著加快，再加上少数民族众多，信仰与内地有所不同，而与境外一些国家相似，与国外的交流也日益频繁，毒株以这种方式传入的危险性逐渐突显出
来。目前需要采取的紧急措施是严格监控循化撒拉族自治县及其附近地区，开展“扫荡”式免
疫，使每一个儿童都得到免疫，大力阻断病毒的扩散，防止出现疫情的暴发，要把病毒的传播扑
灭在它的萌芽状态。
(致谢：对美国CDC Dr.Olen Kew提供部分国外毒株序列资料表示感谢。)
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基金项目：国家自然科学基金；卫生部疾病控制司资助。
作者简介：侯晓辉(1970-)，男，广西壮族自治区柳州市人，中国预防医学科学院病毒学研究所助理研究员，理学学士，主要研究肠道病毒分子生物学。
参考文献
〔1〕 李杰，郑红，徐闻，等.云南省两例输入性脊髓灰质炎Ⅰ型野病毒病例的分子病毒学检测[J].中国计划免疫，1997，3(2)：58～61.
〔2〕 张礼璧，李杰，原稔，等.1996年输入病例Ⅲ型脊髓灰质炎野毒的分子病毒学检测[J].中国计划免疫，1997，3(5)：195～198.
〔3〕 郑渡平，张礼璧，侯晓辉等.1989～1994年中国脊髓灰质炎病毒的分子流行病学[J].病毒学报，1995，11(4)：289～297.
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〔4〕 J Li, T Yoneyama, H Yoshida, et al. Genetic analysis of wild type Ⅰ poliovirus isolates in China, 1985～1993 [J]. Res Virol, 1995, 146: 415～422.
〔5〕 Du-ping Zheng, Li-Bi Zhang, Zhao-Yin Fang, et al. Distribution of wild type Ⅰ poliovirus genotypes in China [J]. The Journal of Infectious Disease, 1993, 168: 001～007.
〔6〕 侯晓辉，郑红，方勇，等.中国新疆地区发现脊髓灰质炎Ⅲ型野毒株[J].疾病监测，1995，10(8)：229～233.
〔7〕 Balanant J, Guillot S, Candrea A, et al. The natural genomic variability of poliovirus analyzed by a restriction fragment length polymorphism assay [J]. Virology, 1991, 184: 645～654.
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〔8〕 张礼璧，李杰，原稔，等.中国脊髓灰质炎Ⅰ型病毒野毒株的PCR-RFLP法分析[J].病毒学报，1994，10(2)：145～153.
〔9〕 Olen M Kew, et al. Molecular epidemiology of wild poliovirus [J]. Applied Virology Research, 1990, 2: 199～221.
〔10〕 Olen M Kew, et al. Genotypic relationship among wild polioviruses from different regions of the world [A]. Brinton M A, New American Society for Microbiology (C), 1990, 357～365.
收稿日期：2000-01-21, http://www.100md.com
单位：侯晓辉 张礼璧 方勇 张勇 祝双利(中国预防医学科学院国家脊髓灰质炎实验室，北京 100050)；赵生仓(青海省卫生防疫站，西宁 810000)
关键词：脊髓灰质炎Ⅰ型野病毒；基因测序；同源性；Neighbor Joining；Bootstrap Test
中国计划免疫000202 摘要：自中国脊髓灰质炎(脊灰)监测网络建立以来，有报告的脊灰暴发和流行主要由脊灰Ⅰ型野病毒引起。1993年在新疆维吾尔自治区分离到1株Ⅲ型野病毒，但未发现Ⅱ型野病毒。此外，1995年、1996年在云南省发现2例Ⅰ型〔1〕、2例Ⅲ型境外输入野毒病例〔2〕。1994年10月以来我国本土未发现脊灰野病毒。但是，1999年10月从青海省循化撒拉族自治县分离到2株脊灰Ⅰ型野病毒，1株来自1位16月龄的病例，另1株来自该病例的接触者。应用基因测序法对该毒株做了VP1片段序列的测定，并与疫苗株SabinⅠ型参考株、国内曾经流行的脊灰Ⅰ型野病毒代表株、我国周边国家部分脊灰Ⅰ型野毒株的序列作了基因同源性比较，并由计算机用Neighbor Joining和Bootstrap Test方法分析处理，构建出它们之间的关系树，初步揭示了该毒株很可能是由境外传入我国。
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中图分类号：R373.2+2 文献标识码：A
文章编号：1006-916X(2000)02-0067-05
Molecular Analysis of the Wild TypeⅠPolioviruses Isolated in Qinghai Province，1999
HOU Xiao-hui, ZHANG Li-bi, FANG Yong, et al.
National Laboratory for Poliomyelitis, CAPM, Beijing 100050, China.
Abstract: Most poliomyelitis cases and heavy outbreaks in China before Oct. 1994 were caused by wild type Ⅰ poliovirus〔3-5〕. No wild type Ⅱ poliovirus but only one wild type Ⅲ poliovirus was reported in China〔6〕. In the years of 1995 and 1996, two wild type Ⅰ polioviruses〔1〕 and two wild type Ⅲ polioviruses〔2〕 imported from Myanmar were reported in Yunnan Province respectively. It has been five years that no indigenous wild poliovirus was isolated in China since the end of year 1994. However, two wild type Ⅰ polioviruses (PV1/QH3274/CHN99 and C3275c) were isolated recently from Xunhua county, Qinghai Province of China. PV1/QH3274/CHN99 was from an AFP case, a sixteen-month-old boy. Another isolate, C3275c, was from his close contact. The sequence of VP1 coding region (300nt) had been identified. No nucleotide difference was found between the two viruses in the 300nt length of VP1 coding region. We compared the homology and analyzed the sequence data of VP1 coding region by computer with the Neighbor Join and Bootstrap methods. The homology with the indigenous wild strains ranges from 77.6% to 82.27%, but it is more than 85% compared with that of the isolates from South Asia. It is acknowledged that the viruses will belong to different subgenetic groups if their homology is less than 85 percent〔9,10〕. The result thus shows that PV1/QH3274/CHN99 and C3275c have a farther genetic relationship with type Ⅰ wild polioviruses epidemic during 1989-1994 in China than with those during 1998-1999 in outh Asia, so this indicates that they are very likely the imported viruses. Although the homology with PV1/99031804/MMR99 is up to 93.38%, PV1/QH3274/CHN99 has the closest relations hips with the PV1/99010389/IND98 and PV1/99010408/IND98 in the dendrogram.
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Key words: Type Ⅰ wild poliovirus; Sequence; Homology; Neighbor Join and Bootstrap methods
自从Sabin活疫苗问世以来，世界范围内的脊髓灰质炎(脊灰)大流行得到了有效的控制，美洲及日本等国家和地区已经率先实现了本地区范围内无脊灰的目标。世界卫生大会(WHA)1988年决定全球在2000年消灭脊灰。在中国流行的脊灰野病毒以Ⅰ型为主，大致可分为4种基因型〔3～5〕，但1993年在新疆维吾尔自治区分离、鉴定出1株脊灰Ⅲ型野病毒〔6〕。我国政府和各级卫生行政部门对消灭脊灰高度重视，不仅组建了遍布全国的急性弛缓性麻痹(AFP)病例监测网络，而且在常规免疫的基础上，从1993年开始每年增加了2轮强化免疫活动，有效地控制和阻断了脊灰野病毒的流行。近年来脊灰病例大幅度下降，野病毒发现地区不断减少，1994年10月以来全国未再发现有本土野病毒。但鉴于中国地域辽阔，人口众多，而且周边国家仍有脊灰野病毒的流行，所以我们从来没有放松过实验室脊灰病毒监测，于1995年在云南省分离出Ⅰ型野病毒，1996年分离出Ⅰ型和Ⅲ型野病毒，证明病毒是由境外传入国内。本文报道从青海省循化撒拉族自治县1999年1例AFP病例粪便标本中分离到1株脊灰病毒，经过细胞传代，中和定型，PCR-RFLP分析〔7、8〕，编码病毒VP1片段基因序列测定，该毒株被鉴定为脊灰Ⅰ型野毒株。通过与周边国家流行脊灰Ⅰ型野病毒相同区段序列的比较，发现该病毒与国内曾经流行的脊灰Ⅰ型野毒株在所分析的序列区段上同源性有较大差异，同源性为77.6%～82.27%；而与我国一些周边国家近年流行株有较大的同源性，同源性在87.67%～93.38%。这提示该毒株从境外传入的可能性较大。这对及时掌握我国脊灰动态，研究对策，采取措施，进一步控制和阻断脊灰病毒的传播有重大意义。
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1 病毒标本 PV1/QH3274/CHN99病毒标本来自青海省循化撒拉族自治县1名16月龄从未服用脊灰活疫苗的男性AFP病例；C3275c病毒标本来自于其密切接触者，1名4岁的女性儿童。毒株由青海省卫生防疫站分离并初步鉴定后，中国预防医学科学院国家脊灰实验室做进一步的鉴定并用分子生物学方法分析。
2 参考病毒基因序列 1989～1993年国内脊灰病毒序列取自本室前期工作。标准疫苗SabinⅠ序列来自GeneBank。印度、柬埔寨、孟加拉、巴基斯坦、阿富汗和伊朗部分毒株序列由美国疾病控制和预防中心(CDC)Dr.Olen Kew提供。
3 引物 UG1： 5′-TTTGTGTCAGCGTGTAATGA-
3′； UC1： 5′-GAATTCCATGTCAAATCTAGA-3′。
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UG1为上游引物，对应于SabinⅠ序列的第2 402～2 421位核苷，UC1为下游引物，对应于SabinⅠ序列的第2 881～2 861位核苷。引物设计参照Balanant方法〔7〕，在上海生工生物公司合成。
4 PCR-RFLP 500μl细胞培养病毒悬液用酚-氯仿法提取病毒核酸，所得病毒RNA先由引物UC1进行逆转录反应，再加入上游引物UG1，在Perkin Elmer公司的GeneAMP PCR System9600上进行扩增反应，条件是：94℃20秒，45℃20秒，72℃30秒，共30个循环。所得产物cDNA长度为480bp。产物分别用DdeⅠ、HpaⅡ和HaeⅢ3种限制性内切酶做限制性片段长度多形性(RELP)分析。
5 自动测序 测序采用Sanger末端双脱氧终止法。扩增后的PCR产物经QIA quick kits纯化后，用Taq DyedeoxyTM Terminator Cycle Sequencing Kit(Biosystem，INC，USA)进行标记反应，所用引物与PCR所用引物相同。样品经过4.75%聚丙烯酰胺和含8.3mol/L尿素的凝胶电泳分析，在377-18A Sequencer System(PE Corporation，USA)自动测序仪中测序。参考ABI操作方法(Prism Ready Reaction Dideoxy Termination Cycle Sequencing Kit，Applied Biosystem，Inc，USA)从两个方向进行测序，所得两段互补测序结果可以相互校正，以提高核酸序列的准确性。
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结 果
1 PCR-RFLP分析
扩增后的480bp核苷酸片段分别用3种限制性内切酶切割后经电泳分析，480bp的SabinⅠ被DdeⅠ切割为两段，长度分别为360bp和120bp；被HpaⅡ切割为两段，长度分别为278bp和202bp；被HaeⅡ切割为3段，长度分别为229bp、140bp和111bp。PV1/QH3274/CHN99被HaeⅡ切割为两段，长度分别为364bp和116bp；而在DdeⅠ和HpaⅡ酶切图谱上无酶切位点，均表现为480bp片段长度。其图形全部不同于SabinⅠ疫苗对照株的片段特征，故PV1/QH3274/CHN99及C3275c均为Ⅰ型脊灰野毒株，且PV1/QH3274/CHN99及C3275c酶切图谱完全相同(图1)。
图1 PCR-RFLP 3种酶切图谱
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A：HpaⅡ；B：DdeⅠ；C：HaeⅢ 1： DNA分子量对照(Φ×174/HaeⅢ)；
2～10： 依次为Sabin Ⅰ，Sabin Ⅱ，Sabin Ⅲ，QH174/CHN93，QH175/CHN93，QH176/CHN93，QH177/CHN93，PV1/QH3274/CHN99，C3275c。
QH： Qinghai； C/CHN：China； c： Contact(接触者)。地区后的两位数字代表毒株流行年份。
2 测序
通过比较双向cDNA产物的测序结果，可以得到PV1/QH3274/CHN99VPI和C3275c 2株病毒VP1区300个核苷基因序列。发现2株病毒序列完全相同，以下讨论仅以PV1/QH3274/CHN99为例。该序列从VP编码区起始点至第300位止(5′-3′)。
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GGTTTGGGGCAAATGCTCGAGAATATGATCGACAACAC
AGTCCGCGAGACGGTAGGGGCTTCAACCTCCAGGGACG
CTCTTCCAAACACCGAATACAGCGGTCCAGCACACTCC
AAAGAAATCCCTGCGCTTACCGCAGTGGAAACGGGAGC
CACGAATCCGTTGGTTCCCTCGGATACTGTACAGCTAG
ACATGTTATTCAACATAGATCACGGTCGGAGTCCAGCA
TTGAGTCCTTTTTCGCGCGTGGAGCGTGCGTAACCATA
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ATGACTGTGGACAATTCGGCCTCCACTACGTCA
3 PV1/QH3274/CHN99与国内及周边国家部分脊灰Ⅰ型野毒株同源性比较
PVI/QH3274/CHN99与疫苗对照株SabinⅠ、青海省1993年曾流行的脊灰Ⅰ型野毒株QH174/93、国内1989～1994年曾流行的脊灰Ⅰ型野病毒代表株、中国周边国家部分脊灰Ⅰ型野毒株VP1序列的同源性(%)比较见图2。
图2 PV1/QH3274/CHN99VPI株与SabinⅠ、青海QH174/CHN93、国内1989～1994年曾流行的脊灰Ⅰ型野病毒代表株以及中国周边国家部分脊灰Ⅰ型野毒株VPI序列的同源性比较(%)
注：C/CHN：CHINA； QH：Qinghai； JX：Jiangxi； XJ：Xinjiang； GX：Guangxi； GD：Guangdong； HaN：Hainan； YN：Yunnan； IRA：Iran； IND：India； PAK：Pakistan； AFG：Afghanistan。
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BAN：Bangladeshi； MMR：Myanmar。地区后的两位数字代表毒株流行年份。
4 系统树分析 用Neighbor Join和Bootstrap Test方法作基因序列亲源关系系统树如图3。
图3 基因序列亲源关系系统树
注：C/CHN：CHINA； QH：Qinghai； IRA：Iran；
IND：India； PAK：Pakistan； AFG：Afghanistan； BAN：Bangladeshi；
MMR：Myanmar； HaN：HaiNan； GX：GuangXi； SD：ShangDong；
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HeN：HeNan； HuB：HuBei； SC：SiChuan； XJ：
XingJiang。地区后的两位数字代表毒株流行年份。 由图3可见，PV1/QH3274/CHN99株明显不在国内流行株的分枝上，而是更加接近于印度1998年、缅甸1999年和孟加拉国1999年分离到的Ⅰ型野病毒的分枝。PV1/QH3274/CHN99与缅甸PV1/99031804/MMR99的同源性为93.38%，核苷差异有20个；与孟加拉国PV1/99031573/BAN99的同源性为92.33%，核苷差异有23个；与印度PV1/99010389/IND98的同源性为92.33%，核苷差异有23个；与印度PV1/99010408/IND98的同源性为92.33%，核苷差异有23个；与印度PV1/99010392/IND98的同源性为87.67%，核苷差异有37个。而在众多的国内株中，与之序列同源性最大的本土毒株是新疆C111/XJ90，同源性为82.27%，核苷差异有53个。虽然从核苷酸同源性分析上看，PV1/QH3274/CHN99与缅甸PV1/99031804/MMR99同源性值为最大，但是从树枝图上分析，与之亲源关系最为接近的却是印度的PV1/99010389/IND98和PV1/99010408/IND98。由此可以看出，PV1/QH3274/CHN99与印度1998年、缅甸1999年和孟加拉国1999年毒株有极为亲密的亲源关系，说明PV1/QH3274/CHN99极有可能是由南亚地区经过某种途径传入我国。
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讨 论
PV1/QH3274/CHN99与C3275c 2株病毒能在L20B细胞上分离与传代，经过特异血清的中和试验定型和PCR-RFLP型内鉴定，最终由序列分析结果确认为脊灰Ⅰ型野病毒。2株病毒的性状及核苷酸序列完全相同(以下讨论仅以PV1/QH3274/CHN99为例)。病人的临床诊断为脊灰，可以判定该AFP患者为脊灰野病毒病例。病人所在青海省循化撒拉族自治县在1993年前有过Ⅰ型野病毒的流行，但近5年来未再发现过野病毒病例。
通过分子生物学技术可揭示病毒基因型之间的关系，揭示病毒流行链的模式，是近年来病毒学研究的进展。序列分析不仅可以准确测定病毒的核苷酸序列，从理论上解释PCR-RFLP图谱，而且可以从系统树图上分析出该毒株与其它毒株亲源关系的远近，从而有助于判断毒株的来源，是本土病毒还是由境外传入的病毒。本文讨论的脊灰毒株PV1/QH3274/CHN99在编码VP1区的基因序列与SabinⅠ的同源性只有78.45%，有65个核苷的差异；与国内既往流行株的同源性为77.6%～82.27%，而与缅甸PV1/99031804/MMR99的同源性为93.38%，核苷差异仅有20个；与印度PV1/99010389/IND98的同源性为92.33%，核苷差异也只有23个。一般认为同源性差异超过15%就可以确定为不同的基因亚型〔9，10〕，毒株PV1/QH3274/CHN99与国内株的同源性差异均大于15%，与1995年缅甸输入株的同源性为78.93%，而与其它大部分南亚株的同源性差异均超过了15%，并且自1994年以后，每年经我国AFP病例和接触者分离的脊灰毒株为300～400株，除1995、1996年在云南发现4例由境外传入病例外，未发现过本土野病毒。由此可认为，PV1/QH3274/CHN99是由我国其它省份传入的可能性不大，而是由境外传入的可能性得到了许多证据的支持。从系统树上看，PV1/QH3274/CHN99枝是介于印度1998年流行株以及缅甸和孟加拉国1999年流行株之间，属于南亚地区流行的毒株，而与国内曾经流行的脊灰Ⅰ型野病毒相距较远。从而提示我们，PV1/QH3274/CHN99株极有可能是从南亚，特别是印度及其周边地区传入我国。同时从序列上我们也发现，尽管PV1/QH3274/CHN99株与印度1998年和缅甸1999年株相近，但是仍有6.6%的差异，可能是该毒株传入我国后已有一些改变。
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中国大陆地区的脊灰疫情和野病毒株基因型的分布和流行，从原来遍布全国到1993、1994年逐步被控制在人口流动性较大的南方省，目前已连续有5年未发现本土野病毒病例，但中国的中
西部地区由于经济的发展，人员的流动显著加快，再加上少数民族众多，信仰与内地有所不同，而与境外一些国家相似，与国外的交流也日益频繁，毒株以这种方式传入的危险性逐渐突显出
来。目前需要采取的紧急措施是严格监控循化撒拉族自治县及其附近地区，开展“扫荡”式免
疫，使每一个儿童都得到免疫，大力阻断病毒的扩散，防止出现疫情的暴发，要把病毒的传播扑
灭在它的萌芽状态。
(致谢：对美国CDC Dr.Olen Kew提供部分国外毒株序列资料表示感谢。)
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基金项目：国家自然科学基金；卫生部疾病控制司资助。
作者简介：侯晓辉(1970-)，男，广西壮族自治区柳州市人，中国预防医学科学院病毒学研究所助理研究员，理学学士，主要研究肠道病毒分子生物学。
参考文献
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〔2〕 张礼璧，李杰，原稔，等.1996年输入病例Ⅲ型脊髓灰质炎野毒的分子病毒学检测[J].中国计划免疫，1997，3(5)：195～198.
〔3〕 郑渡平，张礼璧，侯晓辉等.1989～1994年中国脊髓灰质炎病毒的分子流行病学[J].病毒学报，1995，11(4)：289～297.
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〔4〕 J Li, T Yoneyama, H Yoshida, et al. Genetic analysis of wild type Ⅰ poliovirus isolates in China, 1985～1993 [J]. Res Virol, 1995, 146: 415～422.
〔5〕 Du-ping Zheng, Li-Bi Zhang, Zhao-Yin Fang, et al. Distribution of wild type Ⅰ poliovirus genotypes in China [J]. The Journal of Infectious Disease, 1993, 168: 001～007.
〔6〕 侯晓辉，郑红，方勇，等.中国新疆地区发现脊髓灰质炎Ⅲ型野毒株[J].疾病监测，1995，10(8)：229～233.
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〔8〕 张礼璧，李杰，原稔，等.中国脊髓灰质炎Ⅰ型病毒野毒株的PCR-RFLP法分析[J].病毒学报，1994，10(2)：145～153.
〔9〕 Olen M Kew, et al. Molecular epidemiology of wild poliovirus [J]. Applied Virology Research, 1990, 2: 199～221.
〔10〕 Olen M Kew, et al. Genotypic relationship among wild polioviruses from different regions of the world [A]. Brinton M A, New American Society for Microbiology (C), 1990, 357～365.
收稿日期：2000-01-21, http://www.100md.com