应用酶联免疫吸附试验快速定量检测狂犬病疫苗免疫人体后的抗体水平
作者：刘瑜瑄 黄浩 李淑云 星海 唐巧英
单位：北京生物制品研究所，北京 100024
关键词：狂犬病疫苗；抗体；酶联免疫吸附试验；小鼠中和试验
中国计划免疫000311 摘要：用酶联免疫吸附试验(ELISA)间接法检测狂犬病疫苗免疫人体后的抗体含量，共检测93份人血清，结果表明：敏感度为0.51 IU/0.1ml，特异性强，重复性好，变异系数为9.82%。与小鼠中和试验(MNT)比较，二者具有平行关系，敏感性优于MNT，符合率为98.9%。本方法改变了以往ELISA法有滴度无国际单位的情形，对快速定量检测狂犬病疫苗免疫人体后的抗体水平、流行病学调查等项工作具有一定的应用价值。
中图分类号：R512.99 文献标识码：A
文章编号：1006-916X(2000)03-0160-03
, http://www.100md.com
Papid Quantitative Assay of Rabies Post-vaccination Antibody by ELISA
LIU Yu-xuan，HUANG Hao，LI Shu-yun
(Beijing Institute of Biological Products, Beijing 100024,China.)
Abstract: An indirect ELISA for rabies post-vaccination antibody determination has been developed. A total of 93 human serum samples were tested, the results showed strong specificity and good reproducibility. The sensitivity could reach 0.51 IU/0.1ml and the coefficient of variation was 9.82%. The sera were also tested by mice neutralization test(MNT), the results were parallel with ELISA method and their coincidence rate was 98.9%. The sensitivity of indirect ELISA assay was higher than MNT. The results of ELISA thus can be reported as international units per 0.1 milliliter (IU/0.1ml). It can be recommended as a rapid, sensitive and reliable technique for quantitative assay of rabies post-vaccination antibody.
, 百拇医药
Key words: Rabies vaccine; Post-vaccination antibody; ELISA; MNT
为检测狂犬病疫苗免疫人体后抗体的产生情况，快速、敏感的检测方法是非常必要的。传统方法采用小鼠中和试验(MNT)测定，但该方法周期长，不适于免疫过程中抗体的随时检测。朱家鸿[1]、文洁[2]建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人血清抗体，但该方法仅测出血清抗体滴度，无国际单位，使其在实际应用中有一定局限性。本文报告利用ELISA间接法定量检测狂犬病疫苗免疫人体后的血清抗体滴度，自备人血清工作标准，解决了以往ELISA检测抗体无国际单位的缺点，特异性、敏感性强；在疫苗质量控制、流行病学调查等项工作具有一定应用价值，现报告如下。
材料和方法
1 抗原 狂犬病病毒固定毒CVS株。将CVS毒种接种小鼠脑部，发病后取脑，进行脑组织悬液低速离心，结合10%～50%蔗糖密度梯度离心方法提纯病毒[3]。病毒蛋白浓度为2.9mg/ml，以3.6μg/ml为最佳抗原包被量。
, 百拇医药
2 健康人血清和免疫血清 经证实无犬咬伤史、无狂犬病疫苗注射史的成人血清38份。此38人用狂犬病疫苗进行全程免疫(0、3、7、14、30天)注射，有5人采到7、14、30、60天血清，33人采到60天血清(共93份血清)。
3 人血清工作标准 注射过狂犬病疫苗的人群高价免疫血清，用中国药品生物制品检定所提供的国家标准抗狂犬病兔血清标定，经MNT6次试验，效价为6.74IU/0.1ml。
4 ELISA法 用pH9.6碳酸缓冲液1∶800倍稀释抗原至3.6μg/ml，包被于96孔微量酶标板，每孔100μl。置4℃过夜后，用pH7.4PBS-Tween20洗板4次，甩干。用含20%牛血清PBS-Tween20稀释液稀释待检血清和人血清工作标准至1∶100，加入微量板中各2孔，100μl/孔，放37℃1小时后同上法洗板。每孔加入羊抗人IgG酶标记物100μl，放37℃1小时，同上法洗板6次。每孔加入OPD底物溶液100μl，37℃暗处放20分钟显色，用2mol/L H2SO4终止反应。用492nm、630nm双波长测光密度值(OD值)。
, 百拇医药
判定标准：以P/N值≥2.1为阳性，P/N值<2.1为阴性。
效价(IU/0.1ml)根据公式A/B×6.74计算。这里的A是2孔待检血清OD平均值，B是2孔人血清工作标准OD平均值，6.74是人血清工作标准效价。
5 小鼠中和试验(MNT) 采用常规的小鼠脑内中和试验[4]。将待测血清和国家标准抗狂犬病兔血清(中国药品生物制品检定所提供)分别用2%牛血清PBS稀释，加入等量的CVS(32～320LD50)，置37℃水浴1小时，注射11g～13g小鼠脑部，每组6只，每只注射0.03ml，注射后连续观察14天。用Reed-Muench法计算国际单位，用IU/0.1ml表示。以≥0.05 IU/0.1ml为阳性标准[5]。
结 果
1 滴定方法的技术指标
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1.1 灵敏度 ELISA检测灵敏度的下限为0.51 IU/0.1ml(以健康人血清中最低OD值计算)。
1.2 特异性 CVS病毒抗原只与阳性血清反应，不与阴性血情反应，无非特异性反应。
1.3 精密度 CV在3%～16%，平均9.82%。
2 健康人血清ELISA检测结果
38份健康人血清3次检测平均OD值0.143(表1)。根据判定标准(P/N值≥2.1为阳性，<2.1为阴性)可知，待检血清OD值在0.3(2.1×0.143)以下为阴性，表中最大OD值为0.241，属于阴性，38人均属于阴性范围。MNT测得此38份血清均为0?IU/0.1ml，两种方法完全一致。3次检测抗体的平均效价是1.15?IU/0.1ml，根据判定标准得出待检血清抗体效价≥2.4?IU/0.1ml(2.1×1.15)为阳性，<2.4?IU/0.1ml为阴性。
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表1 ELISA检测38份健康人血清结果 实验次数
OD值
*平均效价*
(IU/0.1ml)
最高值
最低值
平均值
工作标准
1
0.226
0.075
0.136
, 百拇医药
0.870 3
-
2
0.241
0.093
0.151
0.823
-
3
0.218
0.062
0.142
0.818
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-
x
0.228
0.077
0.143
0 .837
1.15
*平均效价＝0.143/0.837×6.74。
3 5人全程免疫后ELISA及MNT检测抗体滴度结果
5位全程接种狂犬病疫苗者，分别4次ELISA检测其抗体滴度(表2)。其平均抗体效价(MT)随注射针数的增加而增加，至30天时MT明显升高，与MNT实验结果一致。两者虽未有对应比值，但明显具有平行关系。从表2还可以看出，用MNT只能检测到14天以后的抗体滴度，7天的抗体滴度未检出；而ELISA却能检出，其7天的MT仅比0天略高，可见ELISA具有更高的敏感性，4次实验结果的变异系数(CV)为3%～16%，平均9.82%。
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表2 ELISA和MNT检测5人全程免疫血清抗体滴度 志愿者
采血天数
ELISA(IU/0.1ml)
MNT(IU/0.1ml)
平均效价
CV(%)
1
0
1.13
14
0
7
, 百拇医药
1.2
7
0
14
1.27
13
0.01
30
2.31
14
0.06
60
2.89
, 百拇医药 6
0.13
2
0
1.03
16
0
7
1.08
15
0
14
1.26
13
, 百拇医药
0.02
30
2.72
8
0.17
60
2.81
5
1.07
3
0
1.47
7
, 百拇医药 0
7
1.51
15
0.03
14
2.75
8
0.11
30
3.09
9
0.15
4
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0
1.55
12
0
7
1.75
6
0
14
1.80
13
0.01
30
2.95
, http://www.100md.com
3
0.28
5
0
1.36
4
0
7
1.43
7
0
14
1.69
13
, 百拇医药
0.01
30
2.85
8
0.08
4 93份血清ELISA和MNT的抗体滴度比较
根据本ELISA标准，抗体滴度≥2.4IU/0.1ml为阳性，<2.4IU/0.1ml为阴性；MNT则为抗体滴度≥0.05IU/0.1ml为阳性，两方法的符合率(92/93)为98.9%(表3)。其中不相符的一份样品MNT定为阳性，经ELISA 4次检测均在临界值2.4IU/0.1ml上下，4次平均结果为2.31IU/0.1ml。表3 93份血清ELISA和MNT的抗体滴度比较 ELISA
MNT
, 百拇医药
血清份数
%
符合率(%)
+
+
40
43.0
-
-
52
55.9
98.9
-
, http://www.100md.com +
1
1.1
讨 论
狂犬病是一种病死率极高、人兽共患的自然疫源性疾病，我国是世界上狂犬病高发国家之一。目前尚无有效药物治疗，一旦发病，几乎百分之百死亡。人群对狂犬病病毒有普遍易感性。随着民众生活水平的提高，养犬等宠物热日益升温，而“健康犬”等的带毒率为3.92%～17.9%[6，7]，因此患狂犬病的可能性亦随之增加。注射狂犬病疫苗乃是目前预防狂犬病的唯一有效措施，而快速、敏感的检测免疫者抗体的产生情况是非常必要的。
MNT早在60多年以前就建立了[8]，并一直沿用至今，它主要用于人和动物疫苗免疫中和抗体的测定，以及被动免疫治疗用国际单位的标定。但它却需要有完善的动物饲养房、大量的小白鼠、至少0.3ml人血清，而且耗时14天之久才能出结果，不适合进行流行病学调查。
, 百拇医药
国内建立的ELISA多采用系列稀释人血清确定抗体滴度，虽然亦快速、敏感、特异，但无国际单位，未体现抗体的最终含量，与MNT的最终结果无法比较。文洁等报道血清1∶50稀释呈阳性反应时，同一稀释度血清在MNT中呈75%～100%的保护率[2]。用本方法仅将人血清稀释一个稀释度(1∶100)即可确定抗体含量，可以减少血清用量(仅需3μl)，一次实验可检测更多血清样品。与MNT符合率达98.9%，4次实验结果的CV在3%～16%，低于Karamany[9]报道的用同法ELISA检测CV为15.2%～37%。免疫过程中，如果早期抗体(7天之内抗体)过低，MNT未检出，而ELISA却能检出，更适合于早期抗体监测。
ELISA快速、定量检测狂犬病疫苗免疫后的抗体，能及时有效地监控接种者是否免疫成功，可减少免疫失败的病例发生，是一种实用、快速、敏感、特异的方法。
(感谢本所中试一室赵建英同志在提纯抗原时给予的大力支持。)
, 百拇医药
作者简介：刘瑜瑄(1967-)，女，北京市人，北京生物制品研究所医学生物工程工程师，理科学士，主要从事生物制品检定方法的研究。
参考文献：
[1] 朱家鸿，曾毅.应用酶联免疫吸附实验(ELISA)快速检测狂犬病病毒抗体的研究[J].病毒学报，1985，1(2)：133.
[2] 文洁，任雅萍，周学良.ELISA用于人血清抗狂犬病毒抗体的检测[J].中国人兽共患病杂志，1989，5(6)：7—9.
[3] 林放涛，于恩庶.狂犬病学[M].福州：福建科学技术出版社，1992，161—162.
[4] 卫生部.中国生物制品规程(一部)[S].中国人口出版社，1995，200—204.
, 百拇医药 [5] WHO.Expert Committee on Rabies，7th Report[R].Technical Report Series 709，1984.
[6] 朱维正.狂犬病防制工作的几点建议[J].中国人兽共患病杂志，1999，15(5)：94—95.
[7] 徐葛林，吴杰，吴泰才，等.多种方法对广西地区健康犬带狂犬病毒的调查[J].中国人兽共患病杂志，1999，5(3)：108～109.
[8] Smith J S, Yager P A,Baer G M.Rapid reproducible test for determining rabies neutralizing antibody[J].Bulletin of the World Health Organization, 1973,48,535—541.
[9] Kaamany R M, Kazar J ,Malik S A, et al.Rapid quantitative assay of rabies post-vaccination antibody by ELISA[J].Apmis Sapplementum, 1988,3:40—43.
收稿日期：1999-11-29； 修回日期：2000-01-18, 百拇医药
单位：北京生物制品研究所，北京 100024
关键词：狂犬病疫苗；抗体；酶联免疫吸附试验；小鼠中和试验
中国计划免疫000311 摘要：用酶联免疫吸附试验(ELISA)间接法检测狂犬病疫苗免疫人体后的抗体含量，共检测93份人血清，结果表明：敏感度为0.51 IU/0.1ml，特异性强，重复性好，变异系数为9.82%。与小鼠中和试验(MNT)比较，二者具有平行关系，敏感性优于MNT，符合率为98.9%。本方法改变了以往ELISA法有滴度无国际单位的情形，对快速定量检测狂犬病疫苗免疫人体后的抗体水平、流行病学调查等项工作具有一定的应用价值。
中图分类号：R512.99 文献标识码：A
文章编号：1006-916X(2000)03-0160-03
, http://www.100md.com
Papid Quantitative Assay of Rabies Post-vaccination Antibody by ELISA
LIU Yu-xuan，HUANG Hao，LI Shu-yun
(Beijing Institute of Biological Products, Beijing 100024,China.)
Abstract: An indirect ELISA for rabies post-vaccination antibody determination has been developed. A total of 93 human serum samples were tested, the results showed strong specificity and good reproducibility. The sensitivity could reach 0.51 IU/0.1ml and the coefficient of variation was 9.82%. The sera were also tested by mice neutralization test(MNT), the results were parallel with ELISA method and their coincidence rate was 98.9%. The sensitivity of indirect ELISA assay was higher than MNT. The results of ELISA thus can be reported as international units per 0.1 milliliter (IU/0.1ml). It can be recommended as a rapid, sensitive and reliable technique for quantitative assay of rabies post-vaccination antibody.
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Key words: Rabies vaccine; Post-vaccination antibody; ELISA; MNT
为检测狂犬病疫苗免疫人体后抗体的产生情况，快速、敏感的检测方法是非常必要的。传统方法采用小鼠中和试验(MNT)测定，但该方法周期长，不适于免疫过程中抗体的随时检测。朱家鸿[1]、文洁[2]建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人血清抗体，但该方法仅测出血清抗体滴度，无国际单位，使其在实际应用中有一定局限性。本文报告利用ELISA间接法定量检测狂犬病疫苗免疫人体后的血清抗体滴度，自备人血清工作标准，解决了以往ELISA检测抗体无国际单位的缺点，特异性、敏感性强；在疫苗质量控制、流行病学调查等项工作具有一定应用价值，现报告如下。
材料和方法
1 抗原 狂犬病病毒固定毒CVS株。将CVS毒种接种小鼠脑部，发病后取脑，进行脑组织悬液低速离心，结合10%～50%蔗糖密度梯度离心方法提纯病毒[3]。病毒蛋白浓度为2.9mg/ml，以3.6μg/ml为最佳抗原包被量。
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2 健康人血清和免疫血清 经证实无犬咬伤史、无狂犬病疫苗注射史的成人血清38份。此38人用狂犬病疫苗进行全程免疫(0、3、7、14、30天)注射，有5人采到7、14、30、60天血清，33人采到60天血清(共93份血清)。
3 人血清工作标准 注射过狂犬病疫苗的人群高价免疫血清，用中国药品生物制品检定所提供的国家标准抗狂犬病兔血清标定，经MNT6次试验，效价为6.74IU/0.1ml。
4 ELISA法 用pH9.6碳酸缓冲液1∶800倍稀释抗原至3.6μg/ml，包被于96孔微量酶标板，每孔100μl。置4℃过夜后，用pH7.4PBS-Tween20洗板4次，甩干。用含20%牛血清PBS-Tween20稀释液稀释待检血清和人血清工作标准至1∶100，加入微量板中各2孔，100μl/孔，放37℃1小时后同上法洗板。每孔加入羊抗人IgG酶标记物100μl，放37℃1小时，同上法洗板6次。每孔加入OPD底物溶液100μl，37℃暗处放20分钟显色，用2mol/L H2SO4终止反应。用492nm、630nm双波长测光密度值(OD值)。
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判定标准：以P/N值≥2.1为阳性，P/N值<2.1为阴性。
效价(IU/0.1ml)根据公式A/B×6.74计算。这里的A是2孔待检血清OD平均值，B是2孔人血清工作标准OD平均值，6.74是人血清工作标准效价。
5 小鼠中和试验(MNT) 采用常规的小鼠脑内中和试验[4]。将待测血清和国家标准抗狂犬病兔血清(中国药品生物制品检定所提供)分别用2%牛血清PBS稀释，加入等量的CVS(32～320LD50)，置37℃水浴1小时，注射11g～13g小鼠脑部，每组6只，每只注射0.03ml，注射后连续观察14天。用Reed-Muench法计算国际单位，用IU/0.1ml表示。以≥0.05 IU/0.1ml为阳性标准[5]。
结 果
1 滴定方法的技术指标
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1.1 灵敏度 ELISA检测灵敏度的下限为0.51 IU/0.1ml(以健康人血清中最低OD值计算)。
1.2 特异性 CVS病毒抗原只与阳性血清反应，不与阴性血情反应，无非特异性反应。
1.3 精密度 CV在3%～16%，平均9.82%。
2 健康人血清ELISA检测结果
38份健康人血清3次检测平均OD值0.143(表1)。根据判定标准(P/N值≥2.1为阳性，<2.1为阴性)可知，待检血清OD值在0.3(2.1×0.143)以下为阴性，表中最大OD值为0.241，属于阴性，38人均属于阴性范围。MNT测得此38份血清均为0?IU/0.1ml，两种方法完全一致。3次检测抗体的平均效价是1.15?IU/0.1ml，根据判定标准得出待检血清抗体效价≥2.4?IU/0.1ml(2.1×1.15)为阳性，<2.4?IU/0.1ml为阴性。
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表1 ELISA检测38份健康人血清结果 实验次数
OD值
*平均效价*
(IU/0.1ml)
最高值
最低值
平均值
工作标准
1
0.226
0.075
0.136
, 百拇医药
0.870 3
-
2
0.241
0.093
0.151
0.823
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3
0.218
0.062
0.142
0.818
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-
x
0.228
0.077
0.143
0 .837
1.15
*平均效价＝0.143/0.837×6.74。
3 5人全程免疫后ELISA及MNT检测抗体滴度结果
5位全程接种狂犬病疫苗者，分别4次ELISA检测其抗体滴度(表2)。其平均抗体效价(MT)随注射针数的增加而增加，至30天时MT明显升高，与MNT实验结果一致。两者虽未有对应比值，但明显具有平行关系。从表2还可以看出，用MNT只能检测到14天以后的抗体滴度，7天的抗体滴度未检出；而ELISA却能检出，其7天的MT仅比0天略高，可见ELISA具有更高的敏感性，4次实验结果的变异系数(CV)为3%～16%，平均9.82%。
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表2 ELISA和MNT检测5人全程免疫血清抗体滴度 志愿者
采血天数
ELISA(IU/0.1ml)
MNT(IU/0.1ml)
平均效价
CV(%)
1
0
1.13
14
0
7
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1.2
7
0
14
1.27
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14
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15
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14
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13
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0.02
30
2.72
8
0.17
60
2.81
5
1.07
3
0
1.47
7
, 百拇医药 0
7
1.51
15
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14
2.75
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1.55
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7
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0.28
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0.01
30
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0.08
4 93份血清ELISA和MNT的抗体滴度比较
根据本ELISA标准，抗体滴度≥2.4IU/0.1ml为阳性，<2.4IU/0.1ml为阴性；MNT则为抗体滴度≥0.05IU/0.1ml为阳性，两方法的符合率(92/93)为98.9%(表3)。其中不相符的一份样品MNT定为阳性，经ELISA 4次检测均在临界值2.4IU/0.1ml上下，4次平均结果为2.31IU/0.1ml。表3 93份血清ELISA和MNT的抗体滴度比较 ELISA
MNT
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血清份数
%
符合率(%)
+
+
40
43.0
-
-
52
55.9
98.9
-
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1
1.1
讨 论
狂犬病是一种病死率极高、人兽共患的自然疫源性疾病，我国是世界上狂犬病高发国家之一。目前尚无有效药物治疗，一旦发病，几乎百分之百死亡。人群对狂犬病病毒有普遍易感性。随着民众生活水平的提高，养犬等宠物热日益升温，而“健康犬”等的带毒率为3.92%～17.9%[6，7]，因此患狂犬病的可能性亦随之增加。注射狂犬病疫苗乃是目前预防狂犬病的唯一有效措施，而快速、敏感的检测免疫者抗体的产生情况是非常必要的。
MNT早在60多年以前就建立了[8]，并一直沿用至今，它主要用于人和动物疫苗免疫中和抗体的测定，以及被动免疫治疗用国际单位的标定。但它却需要有完善的动物饲养房、大量的小白鼠、至少0.3ml人血清，而且耗时14天之久才能出结果，不适合进行流行病学调查。
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国内建立的ELISA多采用系列稀释人血清确定抗体滴度，虽然亦快速、敏感、特异，但无国际单位，未体现抗体的最终含量，与MNT的最终结果无法比较。文洁等报道血清1∶50稀释呈阳性反应时，同一稀释度血清在MNT中呈75%～100%的保护率[2]。用本方法仅将人血清稀释一个稀释度(1∶100)即可确定抗体含量，可以减少血清用量(仅需3μl)，一次实验可检测更多血清样品。与MNT符合率达98.9%，4次实验结果的CV在3%～16%，低于Karamany[9]报道的用同法ELISA检测CV为15.2%～37%。免疫过程中，如果早期抗体(7天之内抗体)过低，MNT未检出，而ELISA却能检出，更适合于早期抗体监测。
ELISA快速、定量检测狂犬病疫苗免疫后的抗体，能及时有效地监控接种者是否免疫成功，可减少免疫失败的病例发生，是一种实用、快速、敏感、特异的方法。
(感谢本所中试一室赵建英同志在提纯抗原时给予的大力支持。)
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作者简介：刘瑜瑄(1967-)，女，北京市人，北京生物制品研究所医学生物工程工程师，理科学士，主要从事生物制品检定方法的研究。
参考文献：
[1] 朱家鸿，曾毅.应用酶联免疫吸附实验(ELISA)快速检测狂犬病病毒抗体的研究[J].病毒学报，1985，1(2)：133.
[2] 文洁，任雅萍，周学良.ELISA用于人血清抗狂犬病毒抗体的检测[J].中国人兽共患病杂志，1989，5(6)：7—9.
[3] 林放涛，于恩庶.狂犬病学[M].福州：福建科学技术出版社，1992，161—162.
[4] 卫生部.中国生物制品规程(一部)[S].中国人口出版社，1995，200—204.
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收稿日期：1999-11-29； 修回日期：2000-01-18, 百拇医药