用L－hCAR细胞选择性地分离柯萨奇B组病毒
作者：田炳均 徐闻 吴燕 罗梅 清水博之 吉田弘 米山彻夫 吉井久美子 和田纯子 宫村达男
单位：田炳均 徐闻 吴燕 罗梅(云南省卫生防疫站，昆明 650022)；清水博之 吉田弘 米山彻夫 吉井久美子 和田纯子 宫村达男(日本国立感染症研究所，日本)
关键词：柯萨奇B组病毒；L-hCAR细胞；病毒分离
中国计划免疫000502 摘要：为研究L-hCAR细胞对柯萨奇B组病毒(Coxsackievirus type B，Cox.B)的敏感性和特异性，以及用L-hCAR细胞从粪便标本中分离Cox.B的情况，将43个肠道病毒标准株同时接种于Hep-2和L-hCAR细胞，在L-hCAR细胞上只有Cox.B增殖。分别用Hep-2及L-hCAR细胞对Cox.B 1～6型标准株进行滴定，两种细胞上的病毒滴度无显著性差异。在病毒分离试验中，用94个已知为非脊髓灰质炎肠道病毒的粪便标本分别接种于Hep-2和L-hCAR细胞，在14天的观察期间内，共有8份粪便标本在L-hCAR细胞上产生细胞病变效应。经鉴定，8份均为Cox.B。结果表明L-hCAR细胞对Cox.B敏感且特异，能用L-hCAR细胞选择性地从粪便标本中分离Cox.B。
, 百拇医药
中图分类号：R373.2+3 文献标识码：A
文章编号：1006-916X(2000)05-0260-03
Selective Isolation of Coxsackie Group B Viruses by L-hCAR Cell
TIAN Bing-jun，XU Wen，WU Yan
(Yunnan Provincial Epidemic Prevention Station, Yunnan, Kunming 650022, China.)
Abstract: The sensitivity and specificity of L-hCAR cell to group B Coxsackie viruses were studied. 43 prototype enteroviruses were at the same time separately inoculated onto the Hep-2 and L-hCAR cells. On L-hCAR cell, only group B Coxsackie viruses (Cox.B) propagated. These Cox.B prototype viruses were titrated on both Hep-2 and L-hCAR cells and their titers were similar. In virus isolation, 94 stool suspensions, known as non-polio enteroviruses, were reinoculated onto both the Hep-2 and L-hCAR cells. Within 14-day observation, 8 samples showed cytopathic effects(CPE) on L-hCAR cell. All these 8 isolates were identified to be Cox.B. The results showed that L-hCAR cell are sensitive and specific to Cox.B and it can be used to selectively isolate Cox.B from stool samples.
, 百拇医药
Key words: Virus isolation; Coxsackie group B viruses (Cox.B); L-hCAR cell
人类肠道病毒(Enteric Virus，EV)，包括脊髓灰质炎(脊灰)病毒(Poliovirus，PV)、埃柯病毒(Enteric Cytopathic Human Orphan Virus，ECHO)、柯萨奇A组和B组病毒(Coxsackie virus type A and B，Cox.A，Cox.B)，以及后来以数字命名的EV68、69、70、71型等[1]，是能引起人类发病的病毒性致病因子。除大部分Cox.A只能用乳鼠分离外，大多数EV都能用细胞培养法分离。然而，EV种类繁多，对各种细胞系的敏感性也不一样。比如，Cox.B一般是用Hep-2细胞分离，而ECHO则对RD细胞较为敏感。但多数ECHO也能在Hep-2细胞上繁殖，亦即这些病毒既能用Hep-2细胞又能用RD细胞分离。由于EV对各细胞系感受性的差异性，要正确地从粪便标本中分离EV，通常是用各种细胞系同时进行分离。这样能提高病毒分离率，但也同时增大了对阳性标本的定型工作量和组合血清量。正如Lα及后来取而代之的L20B细胞[2]能选择性地分离PV一样，最近日本国立感染症研究所(NIID)病毒第二部的清水博之先生把人类Cox.B的受体hCAR[3]重组到小鼠L细胞中，并使该受体在细胞传代过程中稳定表达，使得用单一细胞系选择性地分离Cox.B成为可能。该细胞系对Cox.B的敏感性和特异性以及在用于粪便标本中分离病毒做了研究，现将结果报告如下。
, 百拇医药
材料和方法
1 细胞传代及培养 Hep-2和L-hCAR细胞的培养、传代按1992年世界卫生组织(WHO)扩大免疫规划和传染性疾病部《脊灰病毒检验手册》的方法进行。L-hCAR细胞的生长液中加最终浓度为6μg/ml的Blasticidin S Hydrochloride液。
2 EV标准株 来源于American Tissue Culture Collection(ATCC)，-20℃保存于NIID病毒第二部。
3 粪便标本病毒分离和定型 粪便标本共94份，为1998年柬埔寨送检，于-20℃保存于NIID。NIID已用常规细胞系(Hep-2、RD、L20B)进行病毒分离并鉴定为非脊灰肠道病毒(NPEV)。本次用Hep-2及L-hCAR细胞对Cox.B进行分离，一代阴性的标本均盲传2代，总的观察期间为14天。Hep-2上的阳性分离物再接种于L-hCAR细胞，Hep-2及L-hCAR细胞的阳性标本分别定型。
, 百拇医药
结果
1 L-hCAR细胞对Cox.B的敏感性
用L-hCAR细胞测定了Cox.B 1～6型标准株的滴度，并与Hep-2细胞上的滴度作比较。虽然L-hCAR细胞上的细胞病变效应(CPE)出现较早(比Hep-2细胞早1～2天)，但7天时2种细胞上的病毒最终滴度无显著性差异(单测t检验，P>0.05)。说明L-hCAR细胞对Cox.B的敏感性和Hep-2细胞一样(表1)。
表1 Cox.B标准株在Hep-2及L-hCAR
细胞上的滴度(Log10TCID50/0.05ml) Cox.B型别
Hep-2
L-hCAR
, 百拇医药
滴度差异
1
6.00
6.50
-0.50
2
4.50
5.25
-0.75
3
7.00
6.50
0.50
, 百拇医药
4
4.90
4.25
0.65
5
6.50
7.25
-0.75
6
6.25
6.75
-0.50
2 L-hCAR细胞对Cox.B的特异性
, 百拇医药
43个EV标准株(滴度范围3.50～8.00log10TCID50/0.05ml)分别接种于长成单层的Hep-2和L-hCAR细胞(24孔板)，在14天的观察期间内，在L-hCAR细胞上只有Cox.B 1～6型产生CPE，其它病毒均不增殖(表2)。说明L-hCAR细胞对Cox.B有较好的特异性。表2 EV标准株在两种细胞上的CPE EV标准株
Hep-2
L-hCAR
Cox.B
1型
+
+
2型
, 百拇医药 +
+
3型
+
+
4型
+
+
5型
+
+
6型
+
+
, 百拇医药
PV(Sabin株)
1型
+
-
2型
+
-
3型
+
-
Cox.A
9型
+
-
, http://www.100md.com
16型
+
-
EV
68型
+
-
69型
+
-
70型
-
-
71型
, 百拇医药
+
-
ECHO
1、2、4、6～11、13、17、19、20、24～27、30、33型
+
-
ECHO3、5、12、15、16、18、21、29、31、32型
-
-
3 粪便标本的病毒分离
94份粪便标本同时接种于Hep-2及L-hCAR细胞，在14天的观察期限内，Hep-2细胞上共有65份阳性，L-hCAR细胞上共有8份阳性。65份Hep-2阳性分离物再接种于L-hCAR细胞，共有8份阳性。这8份阳性的标本号与用L-hCAR细胞第1次分离时的标本号完全一致。对这8份阳性标本分别用Hep-2细胞和L-hCAR细胞进行定型。两种细胞的定型结果一致，即Cox.B 3型4株，Cox.B 6型4株。为了检查L-hCAR细胞是否漏检Cox.B，对所有65份Hep-2细胞阳性分离物进行了定型，除8份为Cox.B外，其余57份均为ECHO病毒。说明L-hCAR细胞未漏检Cox.B，两种细胞分离Cox.B的敏感性一致。
, http://www.100md.com
讨论
Cox.B由6个血清型组成，是人类重要的致病因子。它们可引起急慢性心肌炎、脑炎和自动免疫性糖尿病等[4]。Cox.B的分离通常是用Hep-2细胞，但Hep-2细胞对多数ECHO、部分Cox.A及EV68、69型等也敏感。本文对具有人类Cox.B受体的重组细胞系L-hCAR细胞用于选择性分离Cox.B的特性作了研究。结果表明L-hCAR细胞对Cox.B的敏感性和特异性均较好，用来分离Cox.B可以减少工作量和定型血清量，提高工作效率，值得推广使用。
(本工作在日本国立感染症研究所完成，得到该所病毒第二部肠道病毒室的清水博之博士的精心指导，并免费提供L-hCAR细胞和肠道病毒标准株，在此一并深表感谢!)
基金项目：日本
川医学奖学金制度(第22期)
, 百拇医药
作者简介：田炳均(1965-)，男(白族)，云南省鹤庆县人，云南省卫生防疫站主管技师，医学学士，主要从事肠道病毒的实验室诊断工作。
参考文献：
[1]Melnick J L. Enteroviruses: Polioviruses, coxsackieviruses, echoviruses and newer enteroviruses [A]. Fields B N, Knipe D. M. and Howley P M(ed), Fields Virology [M], 3rd ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, Pa, 1996, 655-712.
[2]Wood D J, Hull B. L20B cells simplify culture of polioviruses from clinical samples [J]. J Med Virol, 1999, 58: 188-192.
[3]Tomko R P, Xu R L, Philipson L. HCAR and MCAR: The human and mouse cellular receptors for subgroup C adenoviruses and group B coxsackieviruses [J]. Proc Natl Acad Sci. USA, 1997, 94: 3 352-3 356.
[4]Abelman W H. Viral myocarditis and sequelae [J]. Annu Rev Med, 24: 145-152.
收稿日期：2000-06-05, 百拇医药
单位：田炳均 徐闻 吴燕 罗梅(云南省卫生防疫站，昆明 650022)；清水博之 吉田弘 米山彻夫 吉井久美子 和田纯子 宫村达男(日本国立感染症研究所，日本)
关键词：柯萨奇B组病毒；L-hCAR细胞；病毒分离
中国计划免疫000502 摘要：为研究L-hCAR细胞对柯萨奇B组病毒(Coxsackievirus type B，Cox.B)的敏感性和特异性，以及用L-hCAR细胞从粪便标本中分离Cox.B的情况，将43个肠道病毒标准株同时接种于Hep-2和L-hCAR细胞，在L-hCAR细胞上只有Cox.B增殖。分别用Hep-2及L-hCAR细胞对Cox.B 1～6型标准株进行滴定，两种细胞上的病毒滴度无显著性差异。在病毒分离试验中，用94个已知为非脊髓灰质炎肠道病毒的粪便标本分别接种于Hep-2和L-hCAR细胞，在14天的观察期间内，共有8份粪便标本在L-hCAR细胞上产生细胞病变效应。经鉴定，8份均为Cox.B。结果表明L-hCAR细胞对Cox.B敏感且特异，能用L-hCAR细胞选择性地从粪便标本中分离Cox.B。
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中图分类号：R373.2+3 文献标识码：A
文章编号：1006-916X(2000)05-0260-03
Selective Isolation of Coxsackie Group B Viruses by L-hCAR Cell
TIAN Bing-jun，XU Wen，WU Yan
(Yunnan Provincial Epidemic Prevention Station, Yunnan, Kunming 650022, China.)
Abstract: The sensitivity and specificity of L-hCAR cell to group B Coxsackie viruses were studied. 43 prototype enteroviruses were at the same time separately inoculated onto the Hep-2 and L-hCAR cells. On L-hCAR cell, only group B Coxsackie viruses (Cox.B) propagated. These Cox.B prototype viruses were titrated on both Hep-2 and L-hCAR cells and their titers were similar. In virus isolation, 94 stool suspensions, known as non-polio enteroviruses, were reinoculated onto both the Hep-2 and L-hCAR cells. Within 14-day observation, 8 samples showed cytopathic effects(CPE) on L-hCAR cell. All these 8 isolates were identified to be Cox.B. The results showed that L-hCAR cell are sensitive and specific to Cox.B and it can be used to selectively isolate Cox.B from stool samples.
, 百拇医药
Key words: Virus isolation; Coxsackie group B viruses (Cox.B); L-hCAR cell
人类肠道病毒(Enteric Virus，EV)，包括脊髓灰质炎(脊灰)病毒(Poliovirus，PV)、埃柯病毒(Enteric Cytopathic Human Orphan Virus，ECHO)、柯萨奇A组和B组病毒(Coxsackie virus type A and B，Cox.A，Cox.B)，以及后来以数字命名的EV68、69、70、71型等[1]，是能引起人类发病的病毒性致病因子。除大部分Cox.A只能用乳鼠分离外，大多数EV都能用细胞培养法分离。然而，EV种类繁多，对各种细胞系的敏感性也不一样。比如，Cox.B一般是用Hep-2细胞分离，而ECHO则对RD细胞较为敏感。但多数ECHO也能在Hep-2细胞上繁殖，亦即这些病毒既能用Hep-2细胞又能用RD细胞分离。由于EV对各细胞系感受性的差异性，要正确地从粪便标本中分离EV，通常是用各种细胞系同时进行分离。这样能提高病毒分离率，但也同时增大了对阳性标本的定型工作量和组合血清量。正如Lα及后来取而代之的L20B细胞[2]能选择性地分离PV一样，最近日本国立感染症研究所(NIID)病毒第二部的清水博之先生把人类Cox.B的受体hCAR[3]重组到小鼠L细胞中，并使该受体在细胞传代过程中稳定表达，使得用单一细胞系选择性地分离Cox.B成为可能。该细胞系对Cox.B的敏感性和特异性以及在用于粪便标本中分离病毒做了研究，现将结果报告如下。
, 百拇医药
材料和方法
1 细胞传代及培养 Hep-2和L-hCAR细胞的培养、传代按1992年世界卫生组织(WHO)扩大免疫规划和传染性疾病部《脊灰病毒检验手册》的方法进行。L-hCAR细胞的生长液中加最终浓度为6μg/ml的Blasticidin S Hydrochloride液。
2 EV标准株 来源于American Tissue Culture Collection(ATCC)，-20℃保存于NIID病毒第二部。
3 粪便标本病毒分离和定型 粪便标本共94份，为1998年柬埔寨送检，于-20℃保存于NIID。NIID已用常规细胞系(Hep-2、RD、L20B)进行病毒分离并鉴定为非脊灰肠道病毒(NPEV)。本次用Hep-2及L-hCAR细胞对Cox.B进行分离，一代阴性的标本均盲传2代，总的观察期间为14天。Hep-2上的阳性分离物再接种于L-hCAR细胞，Hep-2及L-hCAR细胞的阳性标本分别定型。
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结果
1 L-hCAR细胞对Cox.B的敏感性
用L-hCAR细胞测定了Cox.B 1～6型标准株的滴度，并与Hep-2细胞上的滴度作比较。虽然L-hCAR细胞上的细胞病变效应(CPE)出现较早(比Hep-2细胞早1～2天)，但7天时2种细胞上的病毒最终滴度无显著性差异(单测t检验，P>0.05)。说明L-hCAR细胞对Cox.B的敏感性和Hep-2细胞一样(表1)。
表1 Cox.B标准株在Hep-2及L-hCAR
细胞上的滴度(Log10TCID50/0.05ml) Cox.B型别
Hep-2
L-hCAR
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滴度差异
1
6.00
6.50
-0.50
2
4.50
5.25
-0.75
3
7.00
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2 L-hCAR细胞对Cox.B的特异性
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43个EV标准株(滴度范围3.50～8.00log10TCID50/0.05ml)分别接种于长成单层的Hep-2和L-hCAR细胞(24孔板)，在14天的观察期间内，在L-hCAR细胞上只有Cox.B 1～6型产生CPE，其它病毒均不增殖(表2)。说明L-hCAR细胞对Cox.B有较好的特异性。表2 EV标准株在两种细胞上的CPE EV标准株
Hep-2
L-hCAR
Cox.B
1型
+
+
2型
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+
3型
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+
4型
+
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5型
+
+
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PV(Sabin株)
1型
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Cox.A
9型
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16型
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EV
68型
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69型
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70型
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71型
, 百拇医药
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ECHO
1、2、4、6～11、13、17、19、20、24～27、30、33型
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ECHO3、5、12、15、16、18、21、29、31、32型
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3 粪便标本的病毒分离
94份粪便标本同时接种于Hep-2及L-hCAR细胞，在14天的观察期限内，Hep-2细胞上共有65份阳性，L-hCAR细胞上共有8份阳性。65份Hep-2阳性分离物再接种于L-hCAR细胞，共有8份阳性。这8份阳性的标本号与用L-hCAR细胞第1次分离时的标本号完全一致。对这8份阳性标本分别用Hep-2细胞和L-hCAR细胞进行定型。两种细胞的定型结果一致，即Cox.B 3型4株，Cox.B 6型4株。为了检查L-hCAR细胞是否漏检Cox.B，对所有65份Hep-2细胞阳性分离物进行了定型，除8份为Cox.B外，其余57份均为ECHO病毒。说明L-hCAR细胞未漏检Cox.B，两种细胞分离Cox.B的敏感性一致。
, http://www.100md.com
讨论
Cox.B由6个血清型组成，是人类重要的致病因子。它们可引起急慢性心肌炎、脑炎和自动免疫性糖尿病等[4]。Cox.B的分离通常是用Hep-2细胞，但Hep-2细胞对多数ECHO、部分Cox.A及EV68、69型等也敏感。本文对具有人类Cox.B受体的重组细胞系L-hCAR细胞用于选择性分离Cox.B的特性作了研究。结果表明L-hCAR细胞对Cox.B的敏感性和特异性均较好，用来分离Cox.B可以减少工作量和定型血清量，提高工作效率，值得推广使用。
(本工作在日本国立感染症研究所完成，得到该所病毒第二部肠道病毒室的清水博之博士的精心指导，并免费提供L-hCAR细胞和肠道病毒标准株，在此一并深表感谢!)
基金项目：日本
川医学奖学金制度(第22期), 百拇医药
作者简介：田炳均(1965-)，男(白族)，云南省鹤庆县人，云南省卫生防疫站主管技师，医学学士，主要从事肠道病毒的实验室诊断工作。
参考文献：
[1]Melnick J L. Enteroviruses: Polioviruses, coxsackieviruses, echoviruses and newer enteroviruses [A]. Fields B N, Knipe D. M. and Howley P M(ed), Fields Virology [M], 3rd ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, Pa, 1996, 655-712.
[2]Wood D J, Hull B. L20B cells simplify culture of polioviruses from clinical samples [J]. J Med Virol, 1999, 58: 188-192.
[3]Tomko R P, Xu R L, Philipson L. HCAR and MCAR: The human and mouse cellular receptors for subgroup C adenoviruses and group B coxsackieviruses [J]. Proc Natl Acad Sci. USA, 1997, 94: 3 352-3 356.
[4]Abelman W H. Viral myocarditis and sequelae [J]. Annu Rev Med, 24: 145-152.
收稿日期：2000-06-05, 百拇医药