MHC基因反义RNA导入造血干/祖细胞的研究
作者：邓宇斌 李树浓 梁天文 王斌
单位：中山医科大学病理生理学教研室，广州510089
关键词：造血干/祖细胞；基因转移；反义RNA；MHC-Ⅱ类基因
中国免疫学杂志990107 中国图书分类号 R392.4
摘 要 目的：将HLA-DRB1基因cDNA片段反向插入逆转录病毒质粒ZIP-neoSV(×)Bam HI位点中，构建了HLA-DRB1基因的逆转录病毒反义RNA重组表达载体，用脂质体法导入PA317细胞。方法：用免疫磁珠法分离，富集CD34+脐血造血干/祖细胞。含编码人HLA-DRB1基因的pcDV1质粒，用Bam HI酶解，回收HLA-DRB1 cDNA片段，将cDNA片段反向插入pZIP-neoSV(×)逆转录病毒载体，经扩增、抽提、酶切鉴定，用脂质体将反义RNA重组体导入到PA317细胞，用含G418 300 μg/ml培养液筛选，获抗性克隆，流式细胞仪检测HLA-DR抗原阳性细胞数。结果：重组质粒转染PA317细胞后，其病毒滴度达1×105CFU/ml，脐血造血干/祖细胞经免疫磁珠富集后，CD34+细胞高达85.0%～90.0%，导入反义RNA的脐血干细胞，其HLA-DR抗原表达从导入前的45.0%降至28.0%，抑制率达38.2%，而导入空载体后从56.0%降至45.0%，差异不显著。结论：HLA-DR的反义RNA能导入脐血干细胞，降低HLA-DR抗原的表达。
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Antisense RNA of MHC gene were transducted into CD34+ cord blood stem/progenitor cells
DENG Yu-Bin,LI Shu-Nong,LIANG Tian-Wen et al.
Sun Yat-Sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510089
Abstract Objective：To construct the retroviral vector encoding antisense RNA of HLA-DR gene and to transduct into packaging cell line PA317 by lipofectin.Methods:pcDV1 plasmid containing HLA-DRB1 gene (a gift from Dr long,NIH,USA) was distracted by alkaline lysation,and then digested by BamHI.pZIP-neoSV(X)vector digested by BamHI and T4 ligase were mixed with cDNA fragment at 18℃ for 16 h. Mononuclear cells of cord blood were incubated in CD34 monoclonal antibody (Milternyi Biotec,Germany) labeled micromagenetic balls for 12 min.After passing of the solution through the mini MACS column,the CD34 positive cells were collected.Results:A high titer(1×105 CFU/ml) helper-free virus producing cell PA317 was obtained .The CD34+ hematopoietic stem/progenitors cells were sorted and enriched by MACS.The percentage of CD34+ stem cell was increased to 85.0%～90.0%.The CD34+ cells were infected by the viral supernatant.The G418-resistant clone was demonstrated to be able to express the antisense RNA of HLA-DR gene by PCR technique. The expression rate of HLA -DR antigen of cord blood cell detected by FACS was 28.0%,which was apparently lower than that of control(45.0%)with inhibition rate of 38.2%.Conclusion:These results suggested that transduction of antisense RNA of HLA-DR gene into cord blood hematopoietic stem cells can successfully inhibited the expression of HLA-DR antigen.These would provide evidences for the prevention and treatment of transplantation immune reaction in clinic cord blood transplantation.
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Key words Hematopoietic stem/progenitor cell Gene transfer Antisense RNA MHC-Ⅱ gene
研究已知供受体HLA不完全相合脐血细胞移植可引起明显的移植免疫反应(免疫排斥反应和移植物抗宿主反应)。国内外研究资料证实造血细胞MHC-Ⅱ类抗原基因(HLA-DR)的成熟表达是引起移植免疫反应的关键所在[1]。研究表明HLA-DR抗原为膜糖蛋白，由α、β链构成，其中组成β链的HLA-DRB基因对HLA-DR抗原的表达和稳定起重要作用[2]。反义RNA可特异阻断目的基因的表达，目前已广泛应用于肿瘤、病毒的基因治疗[3]。而运用反义RNA技术下调脐造血细胞HLA-DR的表达的研究少见报道。本文应用逆转录病毒介导的反义RNA导入造血干细胞特异阻抑HLA-DR抗原的表达，为临床进行造血干细胞移植时降低移植免疫反应的发生及克服组织相容性障碍提供新的思路和理论依据。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒 pcDV1质粒含编码人HLA-DRB1(DR-B0101，45.1DR-β008)cDNA的全部序列由美国NIH的Long博士惠赠，逆转录病毒载体pZIP-neoSV(x)由本校免疫教研室王斌教授惠赠，宿主菌JM109由中山大学罗进贤教授提供。
1.1.2 酶和试剂 工具酶购自BRL公司，琼脂糖、低溶点琼脂糖购自Promega公司。rhEPO GM-CSF、IL-3购于GLBCO公司，抗CD34单抗、抗HLA-DR单抗购于DAKO公司，设计引物Ⅰ：5-GAATGGAGATTGGACCTTCC-3，引物Ⅱ：5-CCAAGCCGTTGACGTCTTTT-3(扩增产物为407 bp)，由中科院上海细胞生物所根据DR-B1基因序列设计合成含第二外显子的HLA-DRB1基因特异引物。
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1.1.3 仪器 流式细胞仪(FACS)型号EpICS ELITE，美国Coulter公司产品，Mini MACS为德国Miltenyi Biotec公司产品。
1.2 方法
1.2.1 逆转录病毒重组体导入包装细胞和病毒上清制备 pZIP-neoSV(x)为带有neo基因的逆转录病毒载体，将HLA-DRB1基因cDNA片段反向插入载体BamHI单酶切点，经扩增、抽提、酶切鉴定[4]。用脂质体法将反义RNA重组体导入到PA317细胞，通过含G418 300 μg/ml培养液选择筛选，经4 w筛选获得抗性克隆，取分泌逆转录病毒的传代培养上清感染NIH3T3细胞，进行病毒滴度的测定[5]。
1.2.2 脐血CD34+细胞的分离、病毒上清感染 脐血(血清型DR1，10)CD34+造血干/祖细胞分离采用免疫磁珠法，先分离单个核细胞，以IMDM调整细胞浓度，洗涤后加磁珠标记的单抗于10℃，孵育15 min，过Mini MACS细胞分离柱，脱离磁场，加压洗脱结合的阳性细胞，取适量细胞作FACS分析纯度。
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按文献[6]方法进行。取2×105 ml-1 CD34+细胞种入培养瓶中，加IMDM培养液含20% FCS和EPO(1 U/ml,GLBCO),SCF(50 ng/ml,GLBCO),IL-3(200 U/ml,GLBCO) ，GM-CSF(200 U/ml,GLBCO)37℃,5% CO2 40 h后半量换液，加适量病毒上清和8 μg/ml Polyprene(Sigma，美国)，加含20%FCS IMDM和同上细胞因子培养48 h后，加G418使终浓度达300 μg/ml。48 h后分瓶，补加含G418 300 μg/ml新培养液和同上细胞因子培养7～14 d，筛选抗G418抗性集落，收集悬浮细胞接种于甲基纤维素半固体培养基扩增培养。对照组用IMDM代替病毒上清。
1.2.3 造血祖细胞CFU-GM的检测 CFU-GM体外培养体系[7]，在IMDM体系中含甲基纤维素0.5%，FBS 30%，二巯基乙醇5×10-5 mol/L，脐血CD34+细胞(2×103 ml-1)，加SCF+IL-3+EPO，加同上浓度的G418，加IMDM至总体积2 ml，混匀后加入到6孔培养板内，置37℃，5% CO2培养14 d后计数集落数。经瑞氏姬姆萨染色证实为粒单系细胞。
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1.2.4 PCR检测脐血CD34+细胞反义RNA重组体 从甲基纤维素半固体培养基中挑取单个克隆，加适量PBS沸水煮5 min，加入100 μg/ml蛋白酶K，20 μl样本加入PCR缓冲液，各引物50 pmol,4×dNTP 200 μmol/L,Taq酶约2 U，至终体积60 μl。加引物进行PCR扩增，反应参数为94℃ 1 min，45℃ 1 min,72℃ 2 min，35个循环，取20 μl的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
1.2.5 FACS测定脐造血细胞HLA-DR抗原阳性细胞率 体外培养已导入反义RNA的脐血干细胞7 d、14 d，用PBS洗2次后，计数按2×106 ml-1分别加入荧光单抗(抗HLA-DR细胞的单抗)，用PBS稀释，4℃ 30 min，用0.05% Tween 20 PBS洗涤后离心，加戊二醛至浓度0.05%，固定后FACS SCan测定。测定前细胞离心1 200 r/min，6 min,PBS洗涤上机测定。未导入反义RNA空载体逆病毒质粒的脐血细胞作对照。
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2 结果
2.1 反义RNA重组体导入PA317细胞和病毒滴度 重组质粒经脂质体转染PA317细胞后，在含300 μg/ml G418的选择性培养基10 d后，大量细胞被杀死，仅见散在的抗G418细胞团，3～4 w后逐渐形成肉眼可见的细胞克隆，见图1。经NIH3T3细胞测定病毒滴度为1×105 CFU/ml。
图1 分泌逆转录病毒pZIP/HLA-DR的抗G418细胞克隆
Fig.1 The G418-resistant clone capable of secreting recombinant retrovirus2.2 MACS分离脐血CD34+细胞 以Ficoll密度梯度离心分离脐血单个核细胞，再以Mini MACS免疫磁珠系统进一步纯化，用FACS分析其纯度，CD34+脐血细胞比例高达85.0%～90.0%，见图2。
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图2 免疫磁珠仪分离脐血CD34+细胞阳性率
Fig.2 Percentage of positive CD34+ cell in CB sorted by MACS
2.3 PCR检测脐血细胞反义RNA重组体 根据实验设计，用引物扩增应得到407 bp的DNA片段，电泳显示CFU-GM克隆经扩增后可得到407 bp电泳条带，证实脐造血细胞在体外半固体培养，经G418选择作用下产生的抗性克隆已转染有反义RNA的造血细胞增殖而成，而对照组含空载体的逆转录病毒质粒为阴性。CFU-GM培养及PCR结果见图3、4。计数6例脐血细胞培养CFU-GM为314±62/2×103，较骨髓对照组184±37/2×103明显增加。
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图3 脐血CD34+细胞CFU-GM(10×10)
Fig.3 CB CD34+ CFU-GM (10×10)
图4 重组体导入CD34+细胞后PCR产物电泳结果
Fig.4 Electrophoresis of the PCR product of G418 resistant CFU-GM
Note:A.pcDV1 positive control clone;B.infected recombined plasmid clone 1;C.infected recombined plasmid clone 2;D.mark λDNA/Hind Ⅲ；E.infected pZIP vector negative control clone
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图5 重组体导入CD34+细胞后HLA-DR抗原分子表达的测定结果
Fig.5 Expression of HLA-DR antigen on CD34+ cells after transduction of the recombinant vector
2.4 FACS测定脐血CD34+细胞HLA-DR抗原的表达 收集体外培养7、14 d转染的脐血干细胞作FACS，结果可见培养2 w的脐血干细胞HLA-DR抗原表达从导入前的45.0%降低至28.0%，抑制率达38.2%。而导入逆转录病毒质粒空载体的对照组HLA-DR抗原表达不受大的影响，从56.0%降至45.0%，结果见图5。
3 讨论
HLA基因位于第6对染色体，是人类最为复杂的遗传复合体。在介导免疫应答、免疫调节过程中发挥重要作用。属于HLA-Ⅱ类抗原的HLA-DR由第6号染色体上1个DRA和多个DRB基因编码组成，DR抗原的多态性主要由DRB基因第二个高度多变的外显子决定。DR分子参与抗原递呈和同种异体移植的识别，造血干细胞移植供体和受体间HLA-DR抗原不相容可引起严重的移植免疫反应。脐血细胞的HLA-DR抗原的成熟表达与移植免疫反应密切相关。逐步成熟表达HLA-DR抗原的脐血细胞为受体免疫系统提供抗原刺激，而且又是排斥过程的靶细胞。将HLA-DRB1基因的cDNA反向插入逆转录病毒质粒ZIP-neoSV(x) BamHI位点中，构成HLA-DRB1基因的反义RNA逆转录病毒表达载体，经过细胞机制转录出来反义mRNA，在一定程度上可与DRB各等位基因的靶mRNA互补，而下调脐血细胞HLA-DR抗原的表达。脐血造血干细胞具有易得、易扩增、少污染等特点，是进行基因治疗的理想靶细胞[8]，已有研究者成功地把葡萄糖脑苷酶基因、纠正范可尼贫血的cDNA等转导进脐血CD34+细胞，展现了脐血干细胞在基因治疗领域的前景。
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逆转录病毒是目前造血细胞基因转移最有效的载体系统，逆转录病毒载体以其转移的高效率及整合稳定性适合用于造血干细胞的基因转移，但逆转录病毒介导的基因转移只能将外源基因整合到处于增殖期的靶细胞染色体中，而要提高转染效率，必须用多种细胞因子刺激造血细胞增殖[9]。已知重组IL-3作用于早期祖细胞，是促进多向造血祖细胞增殖所必需的生长因子。GM-CFU作用于晚期造血细胞，SCF为一种多系刺激因子，直接作用于造血干细胞和多向造血祖细胞，促进其增殖，还与上述造血细胞生长因子具有协同作用。本室和国内外研究者都证明用IL-3+SCF+CSF-GM三种细胞因子可明显刺激造血细胞增殖，在脐血干细胞加入上述细胞因子2 w后检测发现造血细胞数量明显增加，早期的造血干/祖细胞增殖为造血祖细胞，这可用造血祖细胞集落培养取得较好结果来说明。
目前已知CD34+抗原是造血干细胞分选的主要标志，利用吸附免疫微球的单抗进行磁性分离，可获得高纯度CD34+细胞，实验结果表明通过免疫磁珠分离、富集后其纯度可达85.0%，如再进行第二次过柱，还可提高富集纯度，此结果与文献报道相近。用FACS测定转染的脐血细胞HLA-DR+抗原细胞阳性率，对CD34+细胞进行分析。结果表明反义RNA重组体可使CD34+脐血干细胞HLA-DR+的细胞阳性率从45.0%降低为28.0%，抑制率达38.2%。实际上由于HLA-DR抗原分子在免疫应答中的中心作用，也不能全部封闭造血细胞的HLA-DR抗原的表达，这将会导致严重的免疫缺陷。有文献报道应用反义RNA抑制人黑色素细胞表面粘附分子CD44的表达，其抑制率可达34.0%～61.0%[10]，应用腺病毒载体表达反义RNA抑制HIV病毒达70.0%～90.0%，本文结果与文献报道相近。但为什么反义RNA抑制脐血细胞HLA-DR抗原表达并没有象阻抑癌基因表达那样可达60.0%～90.0%的抑制效果，分析这可能与脐血干细胞分化的异质性、基因转染效率不高以及导入的基因表达调控的问题有关。这些问题是目前基因转移、基因治疗中普遍存在的难题，有待今后进一步的研究探索。本研究结果提示导入脐血干细胞的MHC-Ⅱ类基因(DRB1)反义RNA重组体可下调脐血细胞HLA-DR抗原的表达，分析其作用机制可能是因为反义RNA与HLA-DRB基因mRNA结合互补，可进一步阻断和影响HLA-DRB基因的转录表达，降低脐血细胞的HLA-DR抗原分子的表达。本文结果为临床上用反义核酸降低脐血细胞移植免疫反应的解决提供了理论依据和实验基础。
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MHC基因反义RNA导入造血干/祖细胞的研究 本课题为国家自然科学基金资助项目(No.9600156)和广东省自然科学基金资助课题(No.960120)
王斌 中山医科大学免疫学教研室，广州510089
作者简介：邓宇斌，男，36岁，博士后，副教授，主要从事移植免疫、实验血液学研究
4 参考文献
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2 Tonnelle C,DeMars R,Long E O et al.Do a new B chain gene in HLA-D with a distanct regulations of expression.EMBO J,1985;4(11):2839
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〔收稿1998-01-08 修回1998-04-05〕, http://www.100md.com
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关键词：造血干/祖细胞；基因转移；反义RNA；MHC-Ⅱ类基因
中国免疫学杂志990107 中国图书分类号 R392.4
摘 要 目的：将HLA-DRB1基因cDNA片段反向插入逆转录病毒质粒ZIP-neoSV(×)Bam HI位点中，构建了HLA-DRB1基因的逆转录病毒反义RNA重组表达载体，用脂质体法导入PA317细胞。方法：用免疫磁珠法分离，富集CD34+脐血造血干/祖细胞。含编码人HLA-DRB1基因的pcDV1质粒，用Bam HI酶解，回收HLA-DRB1 cDNA片段，将cDNA片段反向插入pZIP-neoSV(×)逆转录病毒载体，经扩增、抽提、酶切鉴定，用脂质体将反义RNA重组体导入到PA317细胞，用含G418 300 μg/ml培养液筛选，获抗性克隆，流式细胞仪检测HLA-DR抗原阳性细胞数。结果：重组质粒转染PA317细胞后，其病毒滴度达1×105CFU/ml，脐血造血干/祖细胞经免疫磁珠富集后，CD34+细胞高达85.0%～90.0%，导入反义RNA的脐血干细胞，其HLA-DR抗原表达从导入前的45.0%降至28.0%，抑制率达38.2%，而导入空载体后从56.0%降至45.0%，差异不显著。结论：HLA-DR的反义RNA能导入脐血干细胞，降低HLA-DR抗原的表达。
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Antisense RNA of MHC gene were transducted into CD34+ cord blood stem/progenitor cells
DENG Yu-Bin,LI Shu-Nong,LIANG Tian-Wen et al.
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Abstract Objective：To construct the retroviral vector encoding antisense RNA of HLA-DR gene and to transduct into packaging cell line PA317 by lipofectin.Methods:pcDV1 plasmid containing HLA-DRB1 gene (a gift from Dr long,NIH,USA) was distracted by alkaline lysation,and then digested by BamHI.pZIP-neoSV(X)vector digested by BamHI and T4 ligase were mixed with cDNA fragment at 18℃ for 16 h. Mononuclear cells of cord blood were incubated in CD34 monoclonal antibody (Milternyi Biotec,Germany) labeled micromagenetic balls for 12 min.After passing of the solution through the mini MACS column,the CD34 positive cells were collected.Results:A high titer(1×105 CFU/ml) helper-free virus producing cell PA317 was obtained .The CD34+ hematopoietic stem/progenitors cells were sorted and enriched by MACS.The percentage of CD34+ stem cell was increased to 85.0%～90.0%.The CD34+ cells were infected by the viral supernatant.The G418-resistant clone was demonstrated to be able to express the antisense RNA of HLA-DR gene by PCR technique. The expression rate of HLA -DR antigen of cord blood cell detected by FACS was 28.0%,which was apparently lower than that of control(45.0%)with inhibition rate of 38.2%.Conclusion:These results suggested that transduction of antisense RNA of HLA-DR gene into cord blood hematopoietic stem cells can successfully inhibited the expression of HLA-DR antigen.These would provide evidences for the prevention and treatment of transplantation immune reaction in clinic cord blood transplantation.
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Key words Hematopoietic stem/progenitor cell Gene transfer Antisense RNA MHC-Ⅱ gene
研究已知供受体HLA不完全相合脐血细胞移植可引起明显的移植免疫反应(免疫排斥反应和移植物抗宿主反应)。国内外研究资料证实造血细胞MHC-Ⅱ类抗原基因(HLA-DR)的成熟表达是引起移植免疫反应的关键所在[1]。研究表明HLA-DR抗原为膜糖蛋白，由α、β链构成，其中组成β链的HLA-DRB基因对HLA-DR抗原的表达和稳定起重要作用[2]。反义RNA可特异阻断目的基因的表达，目前已广泛应用于肿瘤、病毒的基因治疗[3]。而运用反义RNA技术下调脐造血细胞HLA-DR的表达的研究少见报道。本文应用逆转录病毒介导的反义RNA导入造血干细胞特异阻抑HLA-DR抗原的表达，为临床进行造血干细胞移植时降低移植免疫反应的发生及克服组织相容性障碍提供新的思路和理论依据。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种和质粒 pcDV1质粒含编码人HLA-DRB1(DR-B0101，45.1DR-β008)cDNA的全部序列由美国NIH的Long博士惠赠，逆转录病毒载体pZIP-neoSV(x)由本校免疫教研室王斌教授惠赠，宿主菌JM109由中山大学罗进贤教授提供。
1.1.2 酶和试剂 工具酶购自BRL公司，琼脂糖、低溶点琼脂糖购自Promega公司。rhEPO GM-CSF、IL-3购于GLBCO公司，抗CD34单抗、抗HLA-DR单抗购于DAKO公司，设计引物Ⅰ：5-GAATGGAGATTGGACCTTCC-3，引物Ⅱ：5-CCAAGCCGTTGACGTCTTTT-3(扩增产物为407 bp)，由中科院上海细胞生物所根据DR-B1基因序列设计合成含第二外显子的HLA-DRB1基因特异引物。
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1.1.3 仪器 流式细胞仪(FACS)型号EpICS ELITE，美国Coulter公司产品，Mini MACS为德国Miltenyi Biotec公司产品。
1.2 方法
1.2.1 逆转录病毒重组体导入包装细胞和病毒上清制备 pZIP-neoSV(x)为带有neo基因的逆转录病毒载体，将HLA-DRB1基因cDNA片段反向插入载体BamHI单酶切点，经扩增、抽提、酶切鉴定[4]。用脂质体法将反义RNA重组体导入到PA317细胞，通过含G418 300 μg/ml培养液选择筛选，经4 w筛选获得抗性克隆，取分泌逆转录病毒的传代培养上清感染NIH3T3细胞，进行病毒滴度的测定[5]。
1.2.2 脐血CD34+细胞的分离、病毒上清感染 脐血(血清型DR1，10)CD34+造血干/祖细胞分离采用免疫磁珠法，先分离单个核细胞，以IMDM调整细胞浓度，洗涤后加磁珠标记的单抗于10℃，孵育15 min，过Mini MACS细胞分离柱，脱离磁场，加压洗脱结合的阳性细胞，取适量细胞作FACS分析纯度。
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按文献[6]方法进行。取2×105 ml-1 CD34+细胞种入培养瓶中，加IMDM培养液含20% FCS和EPO(1 U/ml,GLBCO),SCF(50 ng/ml,GLBCO),IL-3(200 U/ml,GLBCO) ，GM-CSF(200 U/ml,GLBCO)37℃,5% CO2 40 h后半量换液，加适量病毒上清和8 μg/ml Polyprene(Sigma，美国)，加含20%FCS IMDM和同上细胞因子培养48 h后，加G418使终浓度达300 μg/ml。48 h后分瓶，补加含G418 300 μg/ml新培养液和同上细胞因子培养7～14 d，筛选抗G418抗性集落，收集悬浮细胞接种于甲基纤维素半固体培养基扩增培养。对照组用IMDM代替病毒上清。
1.2.3 造血祖细胞CFU-GM的检测 CFU-GM体外培养体系[7]，在IMDM体系中含甲基纤维素0.5%，FBS 30%，二巯基乙醇5×10-5 mol/L，脐血CD34+细胞(2×103 ml-1)，加SCF+IL-3+EPO，加同上浓度的G418，加IMDM至总体积2 ml，混匀后加入到6孔培养板内，置37℃，5% CO2培养14 d后计数集落数。经瑞氏姬姆萨染色证实为粒单系细胞。
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1.2.5 FACS测定脐造血细胞HLA-DR抗原阳性细胞率 体外培养已导入反义RNA的脐血干细胞7 d、14 d，用PBS洗2次后，计数按2×106 ml-1分别加入荧光单抗(抗HLA-DR细胞的单抗)，用PBS稀释，4℃ 30 min，用0.05% Tween 20 PBS洗涤后离心，加戊二醛至浓度0.05%，固定后FACS SCan测定。测定前细胞离心1 200 r/min，6 min,PBS洗涤上机测定。未导入反义RNA空载体逆病毒质粒的脐血细胞作对照。
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2 结果
2.1 反义RNA重组体导入PA317细胞和病毒滴度 重组质粒经脂质体转染PA317细胞后，在含300 μg/ml G418的选择性培养基10 d后，大量细胞被杀死，仅见散在的抗G418细胞团，3～4 w后逐渐形成肉眼可见的细胞克隆，见图1。经NIH3T3细胞测定病毒滴度为1×105 CFU/ml。
图1 分泌逆转录病毒pZIP/HLA-DR的抗G418细胞克隆
Fig.1 The G418-resistant clone capable of secreting recombinant retrovirus2.2 MACS分离脐血CD34+细胞 以Ficoll密度梯度离心分离脐血单个核细胞，再以Mini MACS免疫磁珠系统进一步纯化，用FACS分析其纯度，CD34+脐血细胞比例高达85.0%～90.0%，见图2。
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图2 免疫磁珠仪分离脐血CD34+细胞阳性率
Fig.2 Percentage of positive CD34+ cell in CB sorted by MACS
2.3 PCR检测脐血细胞反义RNA重组体 根据实验设计，用引物扩增应得到407 bp的DNA片段，电泳显示CFU-GM克隆经扩增后可得到407 bp电泳条带，证实脐造血细胞在体外半固体培养，经G418选择作用下产生的抗性克隆已转染有反义RNA的造血细胞增殖而成，而对照组含空载体的逆转录病毒质粒为阴性。CFU-GM培养及PCR结果见图3、4。计数6例脐血细胞培养CFU-GM为314±62/2×103，较骨髓对照组184±37/2×103明显增加。
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图3 脐血CD34+细胞CFU-GM(10×10)
Fig.3 CB CD34+ CFU-GM (10×10)
图4 重组体导入CD34+细胞后PCR产物电泳结果
Fig.4 Electrophoresis of the PCR product of G418 resistant CFU-GM
Note:A.pcDV1 positive control clone;B.infected recombined plasmid clone 1;C.infected recombined plasmid clone 2;D.mark λDNA/Hind Ⅲ；E.infected pZIP vector negative control clone
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图5 重组体导入CD34+细胞后HLA-DR抗原分子表达的测定结果
Fig.5 Expression of HLA-DR antigen on CD34+ cells after transduction of the recombinant vector
2.4 FACS测定脐血CD34+细胞HLA-DR抗原的表达 收集体外培养7、14 d转染的脐血干细胞作FACS，结果可见培养2 w的脐血干细胞HLA-DR抗原表达从导入前的45.0%降低至28.0%，抑制率达38.2%。而导入逆转录病毒质粒空载体的对照组HLA-DR抗原表达不受大的影响，从56.0%降至45.0%，结果见图5。
3 讨论
HLA基因位于第6对染色体，是人类最为复杂的遗传复合体。在介导免疫应答、免疫调节过程中发挥重要作用。属于HLA-Ⅱ类抗原的HLA-DR由第6号染色体上1个DRA和多个DRB基因编码组成，DR抗原的多态性主要由DRB基因第二个高度多变的外显子决定。DR分子参与抗原递呈和同种异体移植的识别，造血干细胞移植供体和受体间HLA-DR抗原不相容可引起严重的移植免疫反应。脐血细胞的HLA-DR抗原的成熟表达与移植免疫反应密切相关。逐步成熟表达HLA-DR抗原的脐血细胞为受体免疫系统提供抗原刺激，而且又是排斥过程的靶细胞。将HLA-DRB1基因的cDNA反向插入逆转录病毒质粒ZIP-neoSV(x) BamHI位点中，构成HLA-DRB1基因的反义RNA逆转录病毒表达载体，经过细胞机制转录出来反义mRNA，在一定程度上可与DRB各等位基因的靶mRNA互补，而下调脐血细胞HLA-DR抗原的表达。脐血造血干细胞具有易得、易扩增、少污染等特点，是进行基因治疗的理想靶细胞[8]，已有研究者成功地把葡萄糖脑苷酶基因、纠正范可尼贫血的cDNA等转导进脐血CD34+细胞，展现了脐血干细胞在基因治疗领域的前景。
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逆转录病毒是目前造血细胞基因转移最有效的载体系统，逆转录病毒载体以其转移的高效率及整合稳定性适合用于造血干细胞的基因转移，但逆转录病毒介导的基因转移只能将外源基因整合到处于增殖期的靶细胞染色体中，而要提高转染效率，必须用多种细胞因子刺激造血细胞增殖[9]。已知重组IL-3作用于早期祖细胞，是促进多向造血祖细胞增殖所必需的生长因子。GM-CFU作用于晚期造血细胞，SCF为一种多系刺激因子，直接作用于造血干细胞和多向造血祖细胞，促进其增殖，还与上述造血细胞生长因子具有协同作用。本室和国内外研究者都证明用IL-3+SCF+CSF-GM三种细胞因子可明显刺激造血细胞增殖，在脐血干细胞加入上述细胞因子2 w后检测发现造血细胞数量明显增加，早期的造血干/祖细胞增殖为造血祖细胞，这可用造血祖细胞集落培养取得较好结果来说明。
目前已知CD34+抗原是造血干细胞分选的主要标志，利用吸附免疫微球的单抗进行磁性分离，可获得高纯度CD34+细胞，实验结果表明通过免疫磁珠分离、富集后其纯度可达85.0%，如再进行第二次过柱，还可提高富集纯度，此结果与文献报道相近。用FACS测定转染的脐血细胞HLA-DR+抗原细胞阳性率，对CD34+细胞进行分析。结果表明反义RNA重组体可使CD34+脐血干细胞HLA-DR+的细胞阳性率从45.0%降低为28.0%，抑制率达38.2%。实际上由于HLA-DR抗原分子在免疫应答中的中心作用，也不能全部封闭造血细胞的HLA-DR抗原的表达，这将会导致严重的免疫缺陷。有文献报道应用反义RNA抑制人黑色素细胞表面粘附分子CD44的表达，其抑制率可达34.0%～61.0%[10]，应用腺病毒载体表达反义RNA抑制HIV病毒达70.0%～90.0%，本文结果与文献报道相近。但为什么反义RNA抑制脐血细胞HLA-DR抗原表达并没有象阻抑癌基因表达那样可达60.0%～90.0%的抑制效果，分析这可能与脐血干细胞分化的异质性、基因转染效率不高以及导入的基因表达调控的问题有关。这些问题是目前基因转移、基因治疗中普遍存在的难题，有待今后进一步的研究探索。本研究结果提示导入脐血干细胞的MHC-Ⅱ类基因(DRB1)反义RNA重组体可下调脐血细胞HLA-DR抗原的表达，分析其作用机制可能是因为反义RNA与HLA-DRB基因mRNA结合互补，可进一步阻断和影响HLA-DRB基因的转录表达，降低脐血细胞的HLA-DR抗原分子的表达。本文结果为临床上用反义核酸降低脐血细胞移植免疫反应的解决提供了理论依据和实验基础。
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MHC基因反义RNA导入造血干/祖细胞的研究 本课题为国家自然科学基金资助项目(No.9600156)和广东省自然科学基金资助课题(No.960120)
王斌 中山医科大学免疫学教研室，广州510089
作者简介：邓宇斌，男，36岁，博士后，副教授，主要从事移植免疫、实验血液学研究
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〔收稿1998-01-08 修回1998-04-05〕, http://www.100md.com