改变半抗原与载体蛋白的连接桥对提高水杨酸ELISA灵敏度的影响
作者：王树才 周 燮
单位：南京农业大学农学系，南京210095
关键词：水杨酸；半抗原载体连接桥；多克隆抗体；酶联免疫检测法
中国免疫学杂志990112 中国图书分类号 R446.61
摘 要 目的：探讨水杨酸(SA)与载体蛋白间连接桥的改变对识别SA抗体的产生及SA ELISA灵敏度的影响。方法：将SA、4-氨基水杨酸、5-氨基水杨酸分别用不同的方法与载体蛋白相偶联，从而在SA苯环的C4、C5两个不同位点合成了3种免疫原：SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B)和SA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C)及4种包被物：SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-NH-CH2-NH-OVA。免疫新西兰白兔制备抗体，用ELISA法检测。结果：获得针对A和C的两种多克隆抗体，后一种能专一识别游离态水杨酸，改变包被物中连接桥的结构可提高SA ELISA的检测灵敏度，故选用SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA建立了SA ELISA。结论：SA与载体蛋白间连接桥的改变对识别SA抗体的产生和SA ELISA的灵敏度有很大影响。
, 百拇医药
Effect of changing conjugation bridge between hapten and carrier protein on the sensitivity of salicylate elisa
WANG Shu-Cai,ZHOU Xie.
Department of Agronomy,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095
Abstract Objective：To study the effect of changing conjugation bridge between hapten and carrier protein on the raising of antibodies against salicylic acid and the sensitivity of salicylate ELISA.Methods:Three kinds of salicylic acid (SA) immunogens:SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B) and SA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C) and four kinds of SA coating conjugates:SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA and SA(C5)-NH-CH2-NH-OVA were synthesized by linking SA、4-aminosalicylic acid and 5-aminosalicylic acid respectively to bovine serum albumin(BSA) and ovalbumin(OVA) through different conjugation methods.Raising of antibodies in rabbits and effect of changing conjugation bridge on the sensitivity of saliaylate ELISA were detected by ELISA.Results:Two kinds of polyclonal antibodies were raised in rabbits against immunogens A and C respectively.The antibodies against immunogen C possessed a high specificity .Using these antibodies and choosing SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA as a coating conjugate,a kind of ELISA was developed which displayed a linearity range from 0.064 to 200.000 nmol of SA.Conclusion:Conjngation bridge changing has a great effect on the raising of antibodies against salicylic acid and the sensitivity of salicylate ELISA.
, 百拇医药
Key words Salicylic acid Conjugation bridage Polyclonal antibodies ELISA
定量检测半抗原的ELISA在植物学研究中已得到广泛应用[1]，但其建立比较困难，因为半抗原与载体蛋白相偶联的人工免疫原所诱导产生的往往是特异性不同的抗体群，制备单克隆抗体时，可以通过筛选得到专一识别半抗原的抗体[2]，而基于多克隆抗体的ELISA往往因多种抗体并存，非特异结合率较高。通过改变包被物中载体蛋白种类可以提高检测灵敏度[3]，但反应体系中仍存在识别连接桥抗体的干扰。能否通过改变连接桥的结构以消除或减少这一类干扰呢?作者对此进行了探索。
1 材料与方法
1.1 化学试剂 4-氨基水杨酸(p-aminosalicylic ac-id,p-ASA)、4-氨基马尿酸(p-aminohippuric acid,p-AHA)、碳化二亚胺(EDC)、5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid,5-ASA)购自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)购自上海生化试剂采购站；福氏不完全佐剂自制；其它试剂均为分析纯。
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1.2 免疫原的合成
1.2.1 SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)的合成 通过重氮化氨基马尿酸法[4]。
1.2.2 SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B)的合成 按Bennett的方法[5]。
1.2.3 SA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C)的合成 用Mannich反应[4]：100 mg BSA溶于2 ml蒸馏水，加入3 mol/L乙酸钠0.67 ml,7.5%(W/V)甲醛1.2 ml，最后加入5-ASA溶液(50 mg溶于2.5 ml 1 mol/L NaOH)，调节pH至8.5，室温下搅拌过夜。将反应物装入透析袋，4℃下先对0.1 mol/L NaHCO3，后对蒸馏水充分透析，冷冻保存。
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1.3 包被物的合成
1.3.1 SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA的合成 合成程序与A相同，仅以OVA代替BSA。
1.3.2 SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA和SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA的合成 合成程序与B的相同，以OVA代替BSA合成SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA。同时以5-ASA与OVA偶联合成SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA。
1.3.3 SA(C5)-NH-CH2-NH-OVA的合成 合成方法与C的相同，仅以OVA代替BSA。
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1.4 抗血清的制备和纯化 参照Weiler的方法，每种免疫原免疫3只新西兰白兔[6]。第4(或5)次免疫后9 d行颈动脉全放血。血样置37℃ 2 h后移入4℃冰箱过夜，4 000 r/min，离心20 min，取上清。用饱和硫酸铵法纯化抗血清。
1.5 SA ELISA操作程序 非竞争性ELISA程序参见Zheng等，用于抗体的产生和效价的检测[7]。竞争性ELISA程序参见张能刚等，用于SA对抗体与包被物结合的抑制率及抗体对SA类似物的交叉反应率的测定[8]。
2 结果
2.1 抗体的产生 4次免疫后，用连接桥相同的包被物的非竞争ELISA检测，发现免疫原A和C诱导产生了高效价的抗体即PAbs(A)和PAbs(C)，其最高效价分别为12 800和25 600(以OD值为1.0时的抗血清稀释倍数表示)。而以戊二醛法合成的免疫原B，经5次免疫也未能检测到抗体的产生。
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2.2 连接桥不同的免疫原诱导产生的抗体对SA的特异性 竞争性ELISA检测表明，PAbs(A)对SA的识别能力较低(基于连接桥相同的包被物，SA浓度高达400 nmol/50 μl时，其抑制率仅为31.05%)，而PAbs(C)在用同型连接桥的包被物时已表现出对SA较高识别力，而改用异型连接桥的包被物，其抑制率又有明显提高(表1)。
在继续使用异型连接桥包被物的条件下，我们检测了PAbs(C)对13种SA类似物的交叉反应率，结果表明：PAbs(C)除对5-ASA的交叉反应率高达141.2%、对5-磺基水杨酸和4-氨基水杨酸的交叉反应率也较高，分别为15.9%和3.7%，对乙酰水杨酸、对羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸、N-苯基邻氨基苯甲酸、3，5-二硝基水杨酸、苯羟乙酸、水杨醛肟、2，4-二硝基酚、水杨酸钠和2，4-二氯酚10种类似物的交叉反应率均不高于2.1%，甚至表现为不识别，表明PAbs(C)对SA具有相当高的特异性。
2.3 SA ELISA的建立 基于上述结果，以PAbs(C)为第一抗体，SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA为包被物建立了SA ELISA，其灵敏度为0.030 nmol，线性检测范围为0.064～200.000 nmol。
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表1 包被物连接桥结构的改变对PAbs(C)与SA特异结合的影响
Tab.1 Effects of changing bridge of coating conjugate on the binding specificity of SA to PAbs(C) Coating conjugate
Inhibitory rate(1-B/B0,%)
SA(nmol/50 μl)
0.128
0.640
3.200
16.000
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80.000
400.000
SA-NH-CH2-NH-OVA
6.78
10.17
17.80
24.58
48.31
80.34
SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA
2.13
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6.94
24.35
39.81
64.52
92.56
Note:B.binding of tracer to antibody in the presence of SA;B0.binding of tracer to antibody in the absence of SA
3 讨论
3.1 半抗原的偶联位点以及和载体之间连接桥的结构对产生抗体的影响 SA的分子量仅138.1，与载体偶联后才能具备免疫原性。作者在SA苯环的C4和C5位分别偶联载体蛋白合成了3种结构不同的免疫原。结果C4位偶联合成的免疫原未能诱导产生抗体，而Bennett等用同样方法将SA与KLH偶联却制成了识别SA的羊抗体(但未见其建立ELISA的报道)[5]，这可能与KLH异源性比BSA强和不同物种的免疫应答不同有关。C5位偶联合成的免疫原C和A都诱导产生了高效价的抗体，而前一种能较强地识别SA。提示偶联位点及连接桥的结构对特异性抗体的产生有很大的影响。同时前一种抗体对SA类似物的交叉反应率较低，从而可以排除样品中SA衍生物的干扰，确保ELISA的可靠性。
, 百拇医药
3.2 包被物中连接桥结构的改变对SA ELISA灵敏度的影响 改变包被物中的蛋白种类可以消除识别载体蛋白抗体的干扰，部分地提高了ELISA的灵敏度，但反应体系中仍存在识别连接桥抗体的干扰，使抗体与包被物的非特异结合偏高。因此，作者在建立SA ELISA时，针对免疫原C诱导产生的抗体，不仅通过改变载体蛋白的种类(OVA代替BSA)，而且尝试改变连接桥的结构即-N=CH-(CH2)3-CH=N-代替-NH-CH2-NH-来合成包被物，使SA对抗体与包被物结合的抑制率明显提高(表1)，从而提高了SA ELISA的灵敏度。
同样，在检测吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)等的固相抗原型ELISA中也存在着非特异结合率偏高的问题，是否也可通过改变连接桥的结构来提高检测的灵敏度呢?有待进一步探索。
作者简介：王树才，男，30岁，硕士；
, 百拇医药
指导教师，周 燮，男，教授,博士生导师，主要从事植物激素及其免疫检测技术的研究
4 参考文献
1 Caruso J L,Pence V C,Leslie A.Immunoassay methods of plant hormone analysis.In:Davies P J ed.Plant Hormones.Netherland:Kluwer Academic Publisher,1995:433-447
2 Zheng Z F,Zhou X,Chen J G.Preparation of monoclonal antibodies specific for methyl esters of gibberellins A7 and A4.Chinese Journal of Biotechnology,1996;11(4):221
, http://www.100md.com
3 陈金桂，周 燮.在吲哚乙酸不同位点偶联载体蛋白对其抗体特异性的影响.生物技术，1996；6(6)：21
4 Robins R J.The measurement of low-molecular-weight,non-immunogenic compounds by immunoassay.In:Linskens H F,Jackson J F eds.Immunology in Plant Sciences.Germany:Springer-verlag,1986:86-144
5 Bennett A P,Gallacher G,Landon J.The raising and characterisation of antibodies to salicylate.Ann Cli Biochem,1987;24:374
6 Weiler E W.Plant hormone immunoassay based on monoclonal and polyclonal antibodies.In:Linskens HF and Jackson JF eds.Immunology in Plant Sciences.Germany:Springer-verlag,1986:1-17
7 Zheng Z F,Zhou X. A monoclonal antibody recognizing non-derivative 13-hydroxy gibberellins and their glucosides.Acta Botanica Sinica,1995;37(10):761
8 张能刚，周 燮，吴颂如.吲哚乙酸间接酶联免疫法的建立.南京农业大学学报，1990；13(1)：116
〔收稿1997-03-30 二次修回1998-03-05〕, http://www.100md.com
单位：南京农业大学农学系，南京210095
关键词：水杨酸；半抗原载体连接桥；多克隆抗体；酶联免疫检测法
中国免疫学杂志990112 中国图书分类号 R446.61
摘 要 目的：探讨水杨酸(SA)与载体蛋白间连接桥的改变对识别SA抗体的产生及SA ELISA灵敏度的影响。方法：将SA、4-氨基水杨酸、5-氨基水杨酸分别用不同的方法与载体蛋白相偶联，从而在SA苯环的C4、C5两个不同位点合成了3种免疫原：SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B)和SA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C)及4种包被物：SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-NH-CH2-NH-OVA。免疫新西兰白兔制备抗体，用ELISA法检测。结果：获得针对A和C的两种多克隆抗体，后一种能专一识别游离态水杨酸，改变包被物中连接桥的结构可提高SA ELISA的检测灵敏度，故选用SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA建立了SA ELISA。结论：SA与载体蛋白间连接桥的改变对识别SA抗体的产生和SA ELISA的灵敏度有很大影响。
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Effect of changing conjugation bridge between hapten and carrier protein on the sensitivity of salicylate elisa
WANG Shu-Cai,ZHOU Xie.
Department of Agronomy,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095
Abstract Objective：To study the effect of changing conjugation bridge between hapten and carrier protein on the raising of antibodies against salicylic acid and the sensitivity of salicylate ELISA.Methods:Three kinds of salicylic acid (SA) immunogens:SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B) and SA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C) and four kinds of SA coating conjugates:SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA、SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA、SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA and SA(C5)-NH-CH2-NH-OVA were synthesized by linking SA、4-aminosalicylic acid and 5-aminosalicylic acid respectively to bovine serum albumin(BSA) and ovalbumin(OVA) through different conjugation methods.Raising of antibodies in rabbits and effect of changing conjugation bridge on the sensitivity of saliaylate ELISA were detected by ELISA.Results:Two kinds of polyclonal antibodies were raised in rabbits against immunogens A and C respectively.The antibodies against immunogen C possessed a high specificity .Using these antibodies and choosing SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA as a coating conjugate,a kind of ELISA was developed which displayed a linearity range from 0.064 to 200.000 nmol of SA.Conclusion:Conjngation bridge changing has a great effect on the raising of antibodies against salicylic acid and the sensitivity of salicylate ELISA.
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Key words Salicylic acid Conjugation bridage Polyclonal antibodies ELISA
定量检测半抗原的ELISA在植物学研究中已得到广泛应用[1]，但其建立比较困难，因为半抗原与载体蛋白相偶联的人工免疫原所诱导产生的往往是特异性不同的抗体群，制备单克隆抗体时，可以通过筛选得到专一识别半抗原的抗体[2]，而基于多克隆抗体的ELISA往往因多种抗体并存，非特异结合率较高。通过改变包被物中载体蛋白种类可以提高检测灵敏度[3]，但反应体系中仍存在识别连接桥抗体的干扰。能否通过改变连接桥的结构以消除或减少这一类干扰呢?作者对此进行了探索。
1 材料与方法
1.1 化学试剂 4-氨基水杨酸(p-aminosalicylic ac-id,p-ASA)、4-氨基马尿酸(p-aminohippuric acid,p-AHA)、碳化二亚胺(EDC)、5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid,5-ASA)购自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)购自上海生化试剂采购站；福氏不完全佐剂自制；其它试剂均为分析纯。
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1.2 免疫原的合成
1.2.1 SA(C5)-N=N-p-AHA-BSA(A)的合成 通过重氮化氨基马尿酸法[4]。
1.2.2 SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-BSA(B)的合成 按Bennett的方法[5]。
1.2.3 SA(C5)-NH-CH2-NH-BSA(C)的合成 用Mannich反应[4]：100 mg BSA溶于2 ml蒸馏水，加入3 mol/L乙酸钠0.67 ml,7.5%(W/V)甲醛1.2 ml，最后加入5-ASA溶液(50 mg溶于2.5 ml 1 mol/L NaOH)，调节pH至8.5，室温下搅拌过夜。将反应物装入透析袋，4℃下先对0.1 mol/L NaHCO3，后对蒸馏水充分透析，冷冻保存。
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1.3 包被物的合成
1.3.1 SA(C5)-N=N-p-AHA-OVA的合成 合成程序与A相同，仅以OVA代替BSA。
1.3.2 SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA和SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA的合成 合成程序与B的相同，以OVA代替BSA合成SA(C4)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA。同时以5-ASA与OVA偶联合成SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA。
1.3.3 SA(C5)-NH-CH2-NH-OVA的合成 合成方法与C的相同，仅以OVA代替BSA。
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1.4 抗血清的制备和纯化 参照Weiler的方法，每种免疫原免疫3只新西兰白兔[6]。第4(或5)次免疫后9 d行颈动脉全放血。血样置37℃ 2 h后移入4℃冰箱过夜，4 000 r/min，离心20 min，取上清。用饱和硫酸铵法纯化抗血清。
1.5 SA ELISA操作程序 非竞争性ELISA程序参见Zheng等，用于抗体的产生和效价的检测[7]。竞争性ELISA程序参见张能刚等，用于SA对抗体与包被物结合的抑制率及抗体对SA类似物的交叉反应率的测定[8]。
2 结果
2.1 抗体的产生 4次免疫后，用连接桥相同的包被物的非竞争ELISA检测，发现免疫原A和C诱导产生了高效价的抗体即PAbs(A)和PAbs(C)，其最高效价分别为12 800和25 600(以OD值为1.0时的抗血清稀释倍数表示)。而以戊二醛法合成的免疫原B，经5次免疫也未能检测到抗体的产生。
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2.2 连接桥不同的免疫原诱导产生的抗体对SA的特异性 竞争性ELISA检测表明，PAbs(A)对SA的识别能力较低(基于连接桥相同的包被物，SA浓度高达400 nmol/50 μl时，其抑制率仅为31.05%)，而PAbs(C)在用同型连接桥的包被物时已表现出对SA较高识别力，而改用异型连接桥的包被物，其抑制率又有明显提高(表1)。
在继续使用异型连接桥包被物的条件下，我们检测了PAbs(C)对13种SA类似物的交叉反应率，结果表明：PAbs(C)除对5-ASA的交叉反应率高达141.2%、对5-磺基水杨酸和4-氨基水杨酸的交叉反应率也较高，分别为15.9%和3.7%，对乙酰水杨酸、对羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸、N-苯基邻氨基苯甲酸、3，5-二硝基水杨酸、苯羟乙酸、水杨醛肟、2，4-二硝基酚、水杨酸钠和2，4-二氯酚10种类似物的交叉反应率均不高于2.1%，甚至表现为不识别，表明PAbs(C)对SA具有相当高的特异性。
2.3 SA ELISA的建立 基于上述结果，以PAbs(C)为第一抗体，SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA为包被物建立了SA ELISA，其灵敏度为0.030 nmol，线性检测范围为0.064～200.000 nmol。
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表1 包被物连接桥结构的改变对PAbs(C)与SA特异结合的影响
Tab.1 Effects of changing bridge of coating conjugate on the binding specificity of SA to PAbs(C) Coating conjugate
Inhibitory rate(1-B/B0,%)
SA(nmol/50 μl)
0.128
0.640
3.200
16.000
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80.000
400.000
SA-NH-CH2-NH-OVA
6.78
10.17
17.80
24.58
48.31
80.34
SA(C5)-N=CH-(CH2)3-CH=N-OVA
2.13
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6.94
24.35
39.81
64.52
92.56
Note:B.binding of tracer to antibody in the presence of SA;B0.binding of tracer to antibody in the absence of SA
3 讨论
3.1 半抗原的偶联位点以及和载体之间连接桥的结构对产生抗体的影响 SA的分子量仅138.1，与载体偶联后才能具备免疫原性。作者在SA苯环的C4和C5位分别偶联载体蛋白合成了3种结构不同的免疫原。结果C4位偶联合成的免疫原未能诱导产生抗体，而Bennett等用同样方法将SA与KLH偶联却制成了识别SA的羊抗体(但未见其建立ELISA的报道)[5]，这可能与KLH异源性比BSA强和不同物种的免疫应答不同有关。C5位偶联合成的免疫原C和A都诱导产生了高效价的抗体，而前一种能较强地识别SA。提示偶联位点及连接桥的结构对特异性抗体的产生有很大的影响。同时前一种抗体对SA类似物的交叉反应率较低，从而可以排除样品中SA衍生物的干扰，确保ELISA的可靠性。
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3.2 包被物中连接桥结构的改变对SA ELISA灵敏度的影响 改变包被物中的蛋白种类可以消除识别载体蛋白抗体的干扰，部分地提高了ELISA的灵敏度，但反应体系中仍存在识别连接桥抗体的干扰，使抗体与包被物的非特异结合偏高。因此，作者在建立SA ELISA时，针对免疫原C诱导产生的抗体，不仅通过改变载体蛋白的种类(OVA代替BSA)，而且尝试改变连接桥的结构即-N=CH-(CH2)3-CH=N-代替-NH-CH2-NH-来合成包被物，使SA对抗体与包被物结合的抑制率明显提高(表1)，从而提高了SA ELISA的灵敏度。
同样，在检测吲哚乙酸(IAA)和脱落酸(ABA)等的固相抗原型ELISA中也存在着非特异结合率偏高的问题，是否也可通过改变连接桥的结构来提高检测的灵敏度呢?有待进一步探索。
作者简介：王树才，男，30岁，硕士；
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指导教师，周 燮，男，教授,博士生导师，主要从事植物激素及其免疫检测技术的研究
4 参考文献
1 Caruso J L,Pence V C,Leslie A.Immunoassay methods of plant hormone analysis.In:Davies P J ed.Plant Hormones.Netherland:Kluwer Academic Publisher,1995:433-447
2 Zheng Z F,Zhou X,Chen J G.Preparation of monoclonal antibodies specific for methyl esters of gibberellins A7 and A4.Chinese Journal of Biotechnology,1996;11(4):221
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3 陈金桂，周 燮.在吲哚乙酸不同位点偶联载体蛋白对其抗体特异性的影响.生物技术，1996；6(6)：21
4 Robins R J.The measurement of low-molecular-weight,non-immunogenic compounds by immunoassay.In:Linskens H F,Jackson J F eds.Immunology in Plant Sciences.Germany:Springer-verlag,1986:86-144
5 Bennett A P,Gallacher G,Landon J.The raising and characterisation of antibodies to salicylate.Ann Cli Biochem,1987;24:374
6 Weiler E W.Plant hormone immunoassay based on monoclonal and polyclonal antibodies.In:Linskens HF and Jackson JF eds.Immunology in Plant Sciences.Germany:Springer-verlag,1986:1-17
7 Zheng Z F,Zhou X. A monoclonal antibody recognizing non-derivative 13-hydroxy gibberellins and their glucosides.Acta Botanica Sinica,1995;37(10):761
8 张能刚，周 燮，吴颂如.吲哚乙酸间接酶联免疫法的建立.南京农业大学学报，1990；13(1)：116
〔收稿1997-03-30 二次修回1998-03-05〕, http://www.100md.com