用细胞原位杂交方法检测NPY mRNA在PC12细胞中的表达
作者：张亮林 杨贵贞
单位：白求恩医科大学免疫教研室，长春130021
关键词：神经肽Y；细胞原位杂交；mRNA
中国免疫学杂志990207 中国图书分类号 R392.11 Q516
摘 要 目的：建立NPY mRNA的细胞原位杂交检测方法，并以NGF为诱导因子研究Dex对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中NPY mRNA表达的影响。方法：采用细胞原位杂交方法。结果：NGF具有诱导NPY基因表达的生物学效应且呈剂量效应关系；Dex对NPY mRNA表达具有双相调节效应，即早期(<8 h)可促进NGF的诱导作用，而晚期(>16 h)则具有抑制作用(P<0.01)，但单独Dex对NPY mRNA表达无显著影响。结论：可以用细胞原位杂交方法检测NPY mRNA在细胞中的表达。
, 百拇医药
The expression of Neuropeptide Y mRNA in PC12 cell lines detected by in situ hybridization
ZHANG Liang-Lin,YANG Gui-Zhen.
Department of Immunology,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun130021
Abstract Objective:The expression of Neuropeptide Y(NPY) mRNA was detected in PC12.Method: Cellular in situ hybridization.Results:NGF can induce the expression of NPY mRNA in PC12 cells with the relationships of dosage-effect and time-effect.Dexamethasone(Dex) potentiated significantly(P<0.01) the stimulation by NGF at early times(<8 h),but strongly suppressed(P<0.01)it at later times(16 h).The results also appeared that NPY mRNA abundance couldnt be effected by Dex alone.Conclusion:The detection of expression NPY mRNA can use method of cellular in situ hybridization.
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Key words Neuropeptide Y In situ hybridization mRNA
NPY具有广泛的生物学活性并参与机体的多种病理生理过程，其在体内表达异常与许多疾病关系密切，但机制未明，因此开展NPY基因表达调控的研究对深入地认识其在疾病发生、发展和转归过程中的作用具有较重要的理论和临床意义。在本室系列工作的基础上[1-4]，本文建立了NPY基因表达的细胞原位杂交检测方法，并初步开展NPY基因的表达调控研究。
1 材料与方法
1.1 材料 PC12细胞(中科院上海细胞所细胞库)。随机引物标记试剂盒(Promega公司)；〔α-35S〕dATP(杜邦公司)；rhNGF(邦定生物医学公司)，蛋白酶K、RNase A(Sigma公司)，核4乳胶(北京原子能研究所)，地塞米松(Dex)、去离子甲酰胺、APES和多聚甲醛(华美公司)，小牛血清(杭州四季青)，马血清(解放军农牧大学)，IMDM(GIBCO公司)。OlympusPM-10AD显微镜。TA-NPY质粒由本室保存。
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1.2 探针制备 常规方法扩增质粒后回收NPY cDNA片段，按随机引物标记试剂盒说明制备35S-NPY cDNA探针，纯化后-20℃保存备用。
1.3 细胞培养 PC12细胞置含5%小牛血清、10%马血清的IMDM中培养后，接种于24孔培养板(1×106/孔)，加不同刺激物作用不同时间后，收集细胞用于标本制备。
1.4 细胞内mRNA原位杂交
1.4.1 载玻片和盖玻片的预处理 载玻片经清洗洁净后于180℃烤4 h以上，涂APES(按1∶49比例用丙酮配制)，室温凉干后置-20℃保存备用。盖玻片经硅化液浸泡10 min，95%乙醇冲洗，180℃烘烤4 h以上备用。
1.4.2 细胞标本制备 用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗细胞悬液2次，调细胞数至1×105 ml-1，混匀后取0.1 ml用Cytospin离心涂片，室温自然凉干后于4%多聚甲醛固定10 min，转移至0.01 mol/L PBS(pH 7.4)10 min，经系列酒精脱水，-20℃保存备用。
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1.4.3 原位杂交 标本过95%、80%、70%序列乙醇，DEPC处理过后用ddH2O冲洗，然后依次加入0.2 mol/L HCl室温20 min、2×SSC 70℃ 30 min、蛋白酶K混合液(1 μg/ml蛋白酶K、200 mmol/L Tris HCl pH 7.4、20 mmol/L CaCl2)37℃ 15 min，序列乙醇脱水凉干。将杂交液〔50%甲酰胺、100 mmol/L Tris HCl(pH 7.5)、1 mmol/L EDTA、600 mmol/L NaCl、10×Denharts溶液、变性鱼精DNA(10 μg/ml)和tRNA(250 μg/ml)、标记探针(1×105 cpm)〕30 μl滴于标本上，盖上硅化的盖玻片或用新的parafilm于湿盒中37℃保温16～18 h。杂交结束后用2×SSC洗盖玻片，在50%甲酰胺和2×SSC混合液中于37℃洗3次，每次10 min；换50%甲酰胺和1×SSC于37℃洗3次，每次10 min；1×SSC室温洗3次，每次10 min，经序列乙醇脱水凉干。
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1.4.4 放射自显影 将标本涂核4乳胶，待干后于4℃自显影5～7 d，经D19显影F5定影。流水冲洗后做HE染色，显微镜下镜检计数。
1.5 结果判定及统计学处理 结果判定以计数20个细胞内的银粒数计算平均值，进行t检验。
2 结果
2.1 细胞原位杂交方法的特异性 为确定本方法检测NPY mRNA的特异性，特设立不同对照组包括未加刺激物的空白对照组、RNase A消化组和无探针对照组(见图1)。结果表明，未加任何刺激物的细胞内银粒数较低(4.87±1.45)，而经NGF(50 ng/ml)刺激(24 h)后银粒数显著增高(38.61±7.76)(与对照组比P<0.01，n=20)；后者经RNase A酶(25 μg/ml)处理30 min后发现银粒数(16.88±5.26)显著低于未经RNase A消化组(P<0.01，n=20)；而虽然NGF刺激但未加NPY cDNA探针组则只有少数细胞出现了1～3个乳胶非特异显影形成的银粒(1.41±1.09)。
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2.2 NGF剂量与NPY mRNA表达的相关性 PC12细胞经不同剂量NGF刺激24 h后，杂交结果显示：随着剂量增高细胞质中的银粒数相应增加，具有明显的剂量效应关系(r=0.995 0，P<0.01)，见图2。提示NGF具有诱导PC12细胞NPY基因表达的生物学效应。另外亦观察到随着NGF浓度增加，PC12细胞轴突长出的长度增加。
2.3 NGF诱导NPY基因表达的时间效应及Dex对NGF刺激的调节作用 PC12细胞达50%融合度时用NGF(60 ng/ml)和/或Dex(1 μmol/L)处理不同时间，包括长时程(1、2、3、4、5、6 d)和短时程(1、2、4、8、16、32 h)，原位杂交结果显示短时程时，NGF的刺激作用与NPY mRNA表达具有明显的时间效应关系：Dex单独作用不明显，但对NGF的诱导作用具有双相调节效应，即早期(<8 h)具有显著促进作用(P<0.01)，而晚期(>16 h)则抑制NGF的刺激作用(P<0.01)，见图3。长时程时，NGF的刺激作用仍具有时间效应关系，在第4天后出现“平台”；Dex与NGF联合作用时可下调NGF的诱导作用，而单独Dex则提高NPY mRNA表达水平，但并无显著差异，见图4。
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图1 NPY mRNA在PC12细胞中的表达
Fig.1 In situ hybridization of 35 S-NPY cDNA probe in PC12
Note:a.negative control;b.stimulated by NGF;c.stimulated by NGF and digested by RNase A;d.unhybridized
图2 NGF诱导PC12细胞中NPY mRNA表达的量效关系
Fig.2 The relationship of dose-effect between NGF and abundance of NPY mRNA in PC12 cells by in situ hyridization analysis
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图3 Dex对NPY mRNA表达的影响(短时程)
Fig.3 Short term time course of the effects of NGF and dexametnasone(Dex) on the NPY mRNA abundance by in situ hybridization analysis
图4 Dex对NPY mRNA表达的影响(长时程)
Fig.4 Long term time course of the effects of NGF and dexametnasone(Dex)on the NPY mRNA abundance by in situ hybridization analysis
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3 讨论
细胞原位杂交方法涉及细胞生物学和分子生物学两方面技术，在保持细胞形态完整情况下与待检细胞内特定的未知核酸序列相结合，直接观察单个细胞内特定基因表达水平，所需样品量少(104细胞即可)，mRNA表达相对较低时更为实用，故该方法用于体外较难培养的细胞(如神经细胞)中基因表达的研究则更实用。本文建立的NPY mRNA表达的细胞原位杂交检测方法，通过建立阳性、阴性对照及RNase A加NGF作用组，结果显示这一方法的准确性和可靠性。目前检测原位杂交结果(包括细胞和组织原位杂交)国外已较普遍使用图像扫描分析进行定量；国内目前尚未普及，大多仍采用显微镜(油镜)下计数银粒的半定量方式统计原位杂交检测结果。本文在研究过程中采用盲法以三人计数结果的平均值为准，每份标本计数20个细胞内的银粒数，求均值后进行统计学分析，以排除主观因素的干扰。
机体内NPY基因表达异常与多种疾病有关，如近年研究显示NPY参与肥胖基因表达调控，提示对NPY基因表达调控研究具有重要的理论和临床意义。本文建立NPY mRNA原位杂交检测方法为进一步基因表达调控研究打下了基础。
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用细胞原位杂交方法检测NPY mRNA在PC12细胞中的表达 本课题受国家自然科学基金资助(39370622)
张亮林 通信地址：中科院上海生化所55号信箱，上海200031
作者简介：张亮林，男，33岁，医学博士，现为中科院上海生化所博士后
4 参考文献
1 麻彤晖，于永利，杨贵贞.大鼠NPY前体融合蛋白在大肠杆菌中的超表达.中国免疫学杂志，1994；10(5)：298
2 张亮林，杨贵贞.大鼠神经肽Y cDNA克隆、测序及哺乳动物细胞表达载体的构建.中国免疫学杂志，1996；12(2)：1
3 张亮林，杨贵贞.截肢应激大鼠HPAA-脾靶器官中NPY阳性细胞数的变化.中国神经免疫学和神经病学杂志，1996；1(1)：23
4 张亮林，杨贵贞.大鼠神经肽Y基因在COS-7细胞中的表达.中国免疫学杂志，1996；12(6)：331
〔收稿1997-06-12 修回1998-03-01〕, 百拇医药
单位：白求恩医科大学免疫教研室，长春130021
关键词：神经肽Y；细胞原位杂交；mRNA
中国免疫学杂志990207 中国图书分类号 R392.11 Q516
摘 要 目的：建立NPY mRNA的细胞原位杂交检测方法，并以NGF为诱导因子研究Dex对大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞中NPY mRNA表达的影响。方法：采用细胞原位杂交方法。结果：NGF具有诱导NPY基因表达的生物学效应且呈剂量效应关系；Dex对NPY mRNA表达具有双相调节效应，即早期(<8 h)可促进NGF的诱导作用，而晚期(>16 h)则具有抑制作用(P<0.01)，但单独Dex对NPY mRNA表达无显著影响。结论：可以用细胞原位杂交方法检测NPY mRNA在细胞中的表达。
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The expression of Neuropeptide Y mRNA in PC12 cell lines detected by in situ hybridization
ZHANG Liang-Lin,YANG Gui-Zhen.
Department of Immunology,Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun130021
Abstract Objective:The expression of Neuropeptide Y(NPY) mRNA was detected in PC12.Method: Cellular in situ hybridization.Results:NGF can induce the expression of NPY mRNA in PC12 cells with the relationships of dosage-effect and time-effect.Dexamethasone(Dex) potentiated significantly(P<0.01) the stimulation by NGF at early times(<8 h),but strongly suppressed(P<0.01)it at later times(16 h).The results also appeared that NPY mRNA abundance couldnt be effected by Dex alone.Conclusion:The detection of expression NPY mRNA can use method of cellular in situ hybridization.
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Key words Neuropeptide Y In situ hybridization mRNA
NPY具有广泛的生物学活性并参与机体的多种病理生理过程，其在体内表达异常与许多疾病关系密切，但机制未明，因此开展NPY基因表达调控的研究对深入地认识其在疾病发生、发展和转归过程中的作用具有较重要的理论和临床意义。在本室系列工作的基础上[1-4]，本文建立了NPY基因表达的细胞原位杂交检测方法，并初步开展NPY基因的表达调控研究。
1 材料与方法
1.1 材料 PC12细胞(中科院上海细胞所细胞库)。随机引物标记试剂盒(Promega公司)；〔α-35S〕dATP(杜邦公司)；rhNGF(邦定生物医学公司)，蛋白酶K、RNase A(Sigma公司)，核4乳胶(北京原子能研究所)，地塞米松(Dex)、去离子甲酰胺、APES和多聚甲醛(华美公司)，小牛血清(杭州四季青)，马血清(解放军农牧大学)，IMDM(GIBCO公司)。OlympusPM-10AD显微镜。TA-NPY质粒由本室保存。
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1.2 探针制备 常规方法扩增质粒后回收NPY cDNA片段，按随机引物标记试剂盒说明制备35S-NPY cDNA探针，纯化后-20℃保存备用。
1.3 细胞培养 PC12细胞置含5%小牛血清、10%马血清的IMDM中培养后，接种于24孔培养板(1×106/孔)，加不同刺激物作用不同时间后，收集细胞用于标本制备。
1.4 细胞内mRNA原位杂交
1.4.1 载玻片和盖玻片的预处理 载玻片经清洗洁净后于180℃烤4 h以上，涂APES(按1∶49比例用丙酮配制)，室温凉干后置-20℃保存备用。盖玻片经硅化液浸泡10 min，95%乙醇冲洗，180℃烘烤4 h以上备用。
1.4.2 细胞标本制备 用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗细胞悬液2次，调细胞数至1×105 ml-1，混匀后取0.1 ml用Cytospin离心涂片，室温自然凉干后于4%多聚甲醛固定10 min，转移至0.01 mol/L PBS(pH 7.4)10 min，经系列酒精脱水，-20℃保存备用。
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1.4.3 原位杂交 标本过95%、80%、70%序列乙醇，DEPC处理过后用ddH2O冲洗，然后依次加入0.2 mol/L HCl室温20 min、2×SSC 70℃ 30 min、蛋白酶K混合液(1 μg/ml蛋白酶K、200 mmol/L Tris HCl pH 7.4、20 mmol/L CaCl2)37℃ 15 min，序列乙醇脱水凉干。将杂交液〔50%甲酰胺、100 mmol/L Tris HCl(pH 7.5)、1 mmol/L EDTA、600 mmol/L NaCl、10×Denharts溶液、变性鱼精DNA(10 μg/ml)和tRNA(250 μg/ml)、标记探针(1×105 cpm)〕30 μl滴于标本上，盖上硅化的盖玻片或用新的parafilm于湿盒中37℃保温16～18 h。杂交结束后用2×SSC洗盖玻片，在50%甲酰胺和2×SSC混合液中于37℃洗3次，每次10 min；换50%甲酰胺和1×SSC于37℃洗3次，每次10 min；1×SSC室温洗3次，每次10 min，经序列乙醇脱水凉干。
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1.4.4 放射自显影 将标本涂核4乳胶，待干后于4℃自显影5～7 d，经D19显影F5定影。流水冲洗后做HE染色，显微镜下镜检计数。
1.5 结果判定及统计学处理 结果判定以计数20个细胞内的银粒数计算平均值，进行t检验。
2 结果
2.1 细胞原位杂交方法的特异性 为确定本方法检测NPY mRNA的特异性，特设立不同对照组包括未加刺激物的空白对照组、RNase A消化组和无探针对照组(见图1)。结果表明，未加任何刺激物的细胞内银粒数较低(4.87±1.45)，而经NGF(50 ng/ml)刺激(24 h)后银粒数显著增高(38.61±7.76)(与对照组比P<0.01，n=20)；后者经RNase A酶(25 μg/ml)处理30 min后发现银粒数(16.88±5.26)显著低于未经RNase A消化组(P<0.01，n=20)；而虽然NGF刺激但未加NPY cDNA探针组则只有少数细胞出现了1～3个乳胶非特异显影形成的银粒(1.41±1.09)。
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2.2 NGF剂量与NPY mRNA表达的相关性 PC12细胞经不同剂量NGF刺激24 h后，杂交结果显示：随着剂量增高细胞质中的银粒数相应增加，具有明显的剂量效应关系(r=0.995 0，P<0.01)，见图2。提示NGF具有诱导PC12细胞NPY基因表达的生物学效应。另外亦观察到随着NGF浓度增加，PC12细胞轴突长出的长度增加。
2.3 NGF诱导NPY基因表达的时间效应及Dex对NGF刺激的调节作用 PC12细胞达50%融合度时用NGF(60 ng/ml)和/或Dex(1 μmol/L)处理不同时间，包括长时程(1、2、3、4、5、6 d)和短时程(1、2、4、8、16、32 h)，原位杂交结果显示短时程时，NGF的刺激作用与NPY mRNA表达具有明显的时间效应关系：Dex单独作用不明显，但对NGF的诱导作用具有双相调节效应，即早期(<8 h)具有显著促进作用(P<0.01)，而晚期(>16 h)则抑制NGF的刺激作用(P<0.01)，见图3。长时程时，NGF的刺激作用仍具有时间效应关系，在第4天后出现“平台”；Dex与NGF联合作用时可下调NGF的诱导作用，而单独Dex则提高NPY mRNA表达水平，但并无显著差异，见图4。
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图1 NPY mRNA在PC12细胞中的表达
Fig.1 In situ hybridization of 35 S-NPY cDNA probe in PC12
Note:a.negative control;b.stimulated by NGF;c.stimulated by NGF and digested by RNase A;d.unhybridized
图2 NGF诱导PC12细胞中NPY mRNA表达的量效关系
Fig.2 The relationship of dose-effect between NGF and abundance of NPY mRNA in PC12 cells by in situ hyridization analysis
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图3 Dex对NPY mRNA表达的影响(短时程)
Fig.3 Short term time course of the effects of NGF and dexametnasone(Dex) on the NPY mRNA abundance by in situ hybridization analysis
图4 Dex对NPY mRNA表达的影响(长时程)
Fig.4 Long term time course of the effects of NGF and dexametnasone(Dex)on the NPY mRNA abundance by in situ hybridization analysis
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3 讨论
细胞原位杂交方法涉及细胞生物学和分子生物学两方面技术，在保持细胞形态完整情况下与待检细胞内特定的未知核酸序列相结合，直接观察单个细胞内特定基因表达水平，所需样品量少(104细胞即可)，mRNA表达相对较低时更为实用，故该方法用于体外较难培养的细胞(如神经细胞)中基因表达的研究则更实用。本文建立的NPY mRNA表达的细胞原位杂交检测方法，通过建立阳性、阴性对照及RNase A加NGF作用组，结果显示这一方法的准确性和可靠性。目前检测原位杂交结果(包括细胞和组织原位杂交)国外已较普遍使用图像扫描分析进行定量；国内目前尚未普及，大多仍采用显微镜(油镜)下计数银粒的半定量方式统计原位杂交检测结果。本文在研究过程中采用盲法以三人计数结果的平均值为准，每份标本计数20个细胞内的银粒数，求均值后进行统计学分析，以排除主观因素的干扰。
机体内NPY基因表达异常与多种疾病有关，如近年研究显示NPY参与肥胖基因表达调控，提示对NPY基因表达调控研究具有重要的理论和临床意义。本文建立NPY mRNA原位杂交检测方法为进一步基因表达调控研究打下了基础。
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用细胞原位杂交方法检测NPY mRNA在PC12细胞中的表达 本课题受国家自然科学基金资助(39370622)
张亮林 通信地址：中科院上海生化所55号信箱，上海200031
作者简介：张亮林，男，33岁，医学博士，现为中科院上海生化所博士后
4 参考文献
1 麻彤晖，于永利，杨贵贞.大鼠NPY前体融合蛋白在大肠杆菌中的超表达.中国免疫学杂志，1994；10(5)：298
2 张亮林，杨贵贞.大鼠神经肽Y cDNA克隆、测序及哺乳动物细胞表达载体的构建.中国免疫学杂志，1996；12(2)：1
3 张亮林，杨贵贞.截肢应激大鼠HPAA-脾靶器官中NPY阳性细胞数的变化.中国神经免疫学和神经病学杂志，1996；1(1)：23
4 张亮林，杨贵贞.大鼠神经肽Y基因在COS-7细胞中的表达.中国免疫学杂志，1996；12(6)：331
〔收稿1997-06-12 修回1998-03-01〕, 百拇医药