系统性红斑狼疮病人血T、B淋巴细胞Bcl-2的表达
作者：刘亚光 赵湘茹 尹培达 石成钢 孔庆瑜
单位：中山医科大学附属一院肾脏研究所风湿科，广州510080
关键词：系统性红斑狼疮；细胞凋亡；Bcl-2
中国免疫学杂志990214 中国图书分类号 R593.241
摘 要 目的：探讨Bcl-2在系统性红斑狼疮(SLE)发病机制中作用。方法：采用流式细胞仪双标记法检测31例SLE病人外周血T、B细胞Bcl-2蛋白表达。结果：发现活动期SLE病人CD3+、CD4+和CD8+T细胞Bcl-2蛋白表达明显高于非活动期SLE病人、其他疾病组和正常对照组。CD19+B细胞Bcl-2蛋白表达在各组之间并无统计学差异。CD3+T细胞Bcl-2蛋白表达的平均荧光强度(MFI)与SLE疾病活动指数(SLEDAI)成正相关关系(r=0.819 5，P<0.01)，而与血沉、补体C3、C4水平及自身抗体(ANA、抗ds-DNA、抗Sm)无相关。结论：提示T细胞Bcl-2异常表达在SLE疾病活动的过程中起着重要作用。
, http://www.100md.com
Expression of Bcl-2 of peripheral blood T，B lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus
LIU Ya-Guang,ZHAO Xiang-Ru，YIN Pei-Da et al.
Division of Rheumatology,First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen Univerisity of Medical Sciences,Guangzhou 510080
Abstract Objective:In order to investigate Bcl-2 expression in the pathogenesis of Systemic lupus erythematosus(SLE).Methods:Tested Bcl-2 protein levels in T,B cells of 31 patients with SLE by two-colourcytofluorography.Results:Compared with inactive SLE patients,normal controls and other non-SLE patients,a proposition of T cells (including CD3+,CD4+ and CD8+ subgroups) expressed Bcl-2 protein increased significantly in active SLE patients.However,Bcl-2 protein levels did not statistically differentiate in CD19+ B cells among all groups.Mean fluorescence intensity(MFI) of Bcl-2 protein on CD3+ T cells,which wasn't related to serological indices,was positively related to the SLE disease activity index(SLEDA) among SLE patients.Conclusion:Abnormal expression of Bcl-2 in T cells might play an important role in the active stage of SLE patients.
, 百拇医药
Key words Systemic lupus erythematosus(SLE) Apoptosis Bcl-2
Bcl-2基因(B cell lymphoma/leukemia-2 gene)是人们在研究B细胞淋巴瘤中发现的一种异常表达的原癌基因，位于第18号染色体短臂21.3(18 q21.3)[1]。近年发现，Bcl-2为一种细胞凋亡抑制基因。Bcl-2转基因鼠自身反应性B细胞克隆消除功能抑制，B细胞记忆和生存期均延长，可产生许多自身抗体，形成SLE样病损，因而有人称之为自身免疫基因[2]。我们检测了SLE病人外周血淋巴细胞Bcl-2表达水平，探讨其临床意义。
1 病例与方法
1.1 对象 31例病例均符合1982年美国风湿病协会SLE分类修订标准。其中女性26例，平均年龄31±8岁(18～58岁)。几乎所有病人在受检时均用过强的松10～30 mg/d。参照唐氏标准活动期病人18例，非活动期病人13例[3]。以SLE疾病活动指数(SLE Disease Activity Index,SLEDAI)对SLE病情活动性进行评分[4]。设其他疾病组9例(类风湿性关节炎和慢性肾炎各3例，强直性脊柱炎、多发性肌炎和白塞氏病各1例)。正常对照组14例系健康人员，女性10例，平均年龄33±9岁(21～59岁)。
, 百拇医药
1.2 方法 采用分层液密度梯度离心获取PBMC；以流式细胞仪双标记免疫荧光方法测定外周血T、B淋巴细胞Bcl-2蛋白的表达[5，6]。PBMC加入多聚甲醛使其终浓度为0.5%，4℃过夜后离心弃上清，加入0.1%的Triton100 5 min，离心弃上清，每管分别加入FITC标记的鼠抗人CD3+、CD4+、CD8+和CD19+单抗(Immunotech)10 μl，再加入兔抗人Bcl-2单抗(Dako)5 μl，混合后4℃ 60 min，PBS洗两遍，所有管都加入若丹明标记的单抗兔IgG(Immunotech)5 μl，混合后4℃60 min，以流式细胞仪(Coulter)分析每管样品中10 000个细胞，得出表达Bcl-2蛋白阳性的百分率，并测定CD3+T细胞Bcl-2蛋白表达的平均荧光强度(Mean fluorescence intensity,MFI)。
1.3 统计分析 应用美国SPSS6.0对实验数据进行Mann-Whitney U检验和Duncan秩和检验(Duncan's multiple range test)及双变量相关分析。
, 百拇医药
2 结果
活动期SLE病人CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群Bcl-2蛋白表达明显高于非活动期SLE病人、其他疾病组和正常对照组，CD19+B细胞Bcl-2蛋白的表达在各组之间无统计学差异(见表1)。进一步分析发现，活动期SLE病人外周血CD3+T细胞Bcl-2蛋白表达的平均荧光强度(MFI)明显高于非活动期SLE病人、其他疾病组和正常对照组(0.535 7±0.264 0对比0.164 2±0.031 0、0.158 1±0.029 0及0.138 9±0.022 0，P<0.05)。且与SLE疾病活动指数(SLEDAI)成正相关(r=0.819 5，P<0.01)，而与ESR、C3和C4水平无相关关系，与自身抗体ANA、抗ds-DNA及抗Sm抗体阳性率也无相关关系。
表1 SLE病人外周血T、B淋巴细胞Bcl-2的表达(x±s,%)
, 百拇医药
Tab.1 Expression of Bcl-2 protein peripheral blood T subgroups and B cells in SLE patients (x±s，%)
CD3+
CD4+
CD8+
CD19+
Active SLE
63.49±16.771)
64.32±16.291)
, 百拇医药
60.76±16.921)
78.23±11.5
Inactive SLE
14.52±10.93
14.07±11.70
15.93±11.56
80.56±10.48
Other diseases
11.47±4.97
12.44±5.77
11.00±4.98
, 百拇医药
78.59±7.52
Healthy control
9.94±4.96
14.99±20.92
10.53±4.89
81.9±6.97
Note:1)compared with healthy controls，other diseases and inactive SLE，P<0.01
3 讨论
SLE是一种全身性多器官受累的自身免疫病，免疫学特征是B细胞多克隆活化，T细胞活化增加，产生许多自身抗体，其发病机制尚不清楚。有人报道活动期SLE病人T细胞Bcl-2蛋白表达明显增高[5，6]，且PBMC Bcl-2 mRNA表达水平明显升高[7]。我们也证实活动期SLE病人CD3+、CD4+和CD8+ T细胞Bcl-2蛋白与非活动期SLE病人有显著差异。Strasser等观察到细胞凋亡抑制基因Bcl-2对成熟T细胞具有明显效应[8]，可表达Bcl-2的外周血T细胞在培养中不仅生存期较长，而且也产生持续时间长而剧烈的抗原反应，这种抗原反应的变化可能是活化T细胞凋亡被抑制的结果。此外，Bcl-2表达使得CD3+抑制性自身反应性胸腺细胞出现，提示Bcl-2表达确实对胸腺内克隆性删除具有抑制效应[8]。再者，我们发现CD4+T细胞(T辅助细胞)和CD8+T细胞(T抑制细胞)亚群Bcl-2表达异常，这可导致T细胞亚群凋亡的异常，从而引起SLE病人T细胞的免疫调节功能紊乱，而SLE病人B细胞的活化是T细胞依赖性的，在B细胞多克隆化过程中，T细胞调节功能紊乱是一个重要因素。表明了T细胞Bcl-2异常表达在SLE疾病活动的过程中起着重要作用。
, 百拇医药
Aringer报道SLE病人PBMC Bcl-2蛋白表达的MFI与疾病活动性(SIS)成正相关[5]，我们发现SLE病人外周血CD3+T细胞Bcl-2蛋白表达的MFI与SLEDAI也成正相关关系，故检测SLE病人血T淋巴细胞Bcl-2蛋白的表达水平可作为SLE的活动性指标，但CD3+T细胞Bcl-2蛋白表达的MFI与血沉、补体C3、C4水平及抗ds-DNA、抗Sm、ANA阳性率并无相关关系，提示T细胞Bcl-2蛋白表达是反映疾病活动性的独立指标。SLE病人淋巴细胞Bcl-2基因及蛋白的高表达原因未明了。研究显示，Bcl-2基因易位于14号染色体上免疫球蛋白重链基因区(JH)的基因重排可使Bcl-2蛋白高表达。Aringer等报道具有Bcl-2蛋白及mRNA高表达的活动期SLE病人未见Bcl-2基因重排[5]。说明尚有其他机制调节SLE病人Bcl-2高表达，已有报道EB病毒和白细胞介素2可刺激Bcl-2蛋白表达水平升高[5]。有人推测SLE病人循环Bcl-2阳性淋巴细胞数明显增多是由于骨髓大量释放(an augmented release)且生存延长[5]。
, http://www.100md.com
系统性红斑狼疮病人血T、B淋巴细胞Bcl-2的表达 本课题由国家自然科学基金资助(No.39770706)
赵湘茹 中山医科大学教学实验中心，广州510080
作者简介：刘亚光，男，33岁，博士，讲师；
尹培达，男，63岁，教授，博士生导师，主要从事风湿病和肾病研究
4 参考文献
1 Tsujimoto Y,Finger L R,Yunis J et al. Cloning the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14;18) chromosome location.Science,1984;226(4678):1097
, 百拇医药
2 Talal N.Concluding remarks：autogene and oncogenes.Clin Immunol Immunopathol,1994;72(2):208
3 唐福林，董 怡，陈培珍 et al.系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎病人血清中抗组织蛋白抗体的测定及其临床意义.中华内科杂志，1990；29(4)：221
4 Bombardier C,Gladman D D,Urowiz M B et al. Derivation of the SLEDAI; a disease activity index for lupus patients.Arthritis Rheum,1992;35(6):630
5 Aringer M,Wintersberger W,Steiner C W et al. High levels of bcl-2 pro tein in circulating T lymphocytes,but not B lymphocytes, of patients with systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,1994;37(10):1423
, 百拇医药
6 Ohsako S,Hara M,Harigai M et al. Expression and function of Fas antigen and bcl-2 in human systemic lupus erythematosus lymphocytes.Clin Immunol Immunopathol,1994；73(1):109
7 Graninger W B.Transcriptional overexpression of the protooncogene bcl-2 in patients with systemic lupus erythematosus.Wien Klin Wochenschr,1992;104(7):205
8 Strasser A, Harris A W,Cory S. Bcl-2 transgene inhibits T cell death and perturbs thymic self-censorship.Cell,1991;67(5):889
〔收稿1997-11-30 修回1998-03-18〕, http://www.100md.com
单位：中山医科大学附属一院肾脏研究所风湿科，广州510080
关键词：系统性红斑狼疮；细胞凋亡；Bcl-2
中国免疫学杂志990214 中国图书分类号 R593.241
摘 要 目的：探讨Bcl-2在系统性红斑狼疮(SLE)发病机制中作用。方法：采用流式细胞仪双标记法检测31例SLE病人外周血T、B细胞Bcl-2蛋白表达。结果：发现活动期SLE病人CD3+、CD4+和CD8+T细胞Bcl-2蛋白表达明显高于非活动期SLE病人、其他疾病组和正常对照组。CD19+B细胞Bcl-2蛋白表达在各组之间并无统计学差异。CD3+T细胞Bcl-2蛋白表达的平均荧光强度(MFI)与SLE疾病活动指数(SLEDAI)成正相关关系(r=0.819 5，P<0.01)，而与血沉、补体C3、C4水平及自身抗体(ANA、抗ds-DNA、抗Sm)无相关。结论：提示T细胞Bcl-2异常表达在SLE疾病活动的过程中起着重要作用。
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Expression of Bcl-2 of peripheral blood T，B lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus
LIU Ya-Guang,ZHAO Xiang-Ru，YIN Pei-Da et al.
Division of Rheumatology,First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen Univerisity of Medical Sciences,Guangzhou 510080
Abstract Objective:In order to investigate Bcl-2 expression in the pathogenesis of Systemic lupus erythematosus(SLE).Methods:Tested Bcl-2 protein levels in T,B cells of 31 patients with SLE by two-colourcytofluorography.Results:Compared with inactive SLE patients,normal controls and other non-SLE patients,a proposition of T cells (including CD3+,CD4+ and CD8+ subgroups) expressed Bcl-2 protein increased significantly in active SLE patients.However,Bcl-2 protein levels did not statistically differentiate in CD19+ B cells among all groups.Mean fluorescence intensity(MFI) of Bcl-2 protein on CD3+ T cells,which wasn't related to serological indices,was positively related to the SLE disease activity index(SLEDA) among SLE patients.Conclusion:Abnormal expression of Bcl-2 in T cells might play an important role in the active stage of SLE patients.
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Key words Systemic lupus erythematosus(SLE) Apoptosis Bcl-2
Bcl-2基因(B cell lymphoma/leukemia-2 gene)是人们在研究B细胞淋巴瘤中发现的一种异常表达的原癌基因，位于第18号染色体短臂21.3(18 q21.3)[1]。近年发现，Bcl-2为一种细胞凋亡抑制基因。Bcl-2转基因鼠自身反应性B细胞克隆消除功能抑制，B细胞记忆和生存期均延长，可产生许多自身抗体，形成SLE样病损，因而有人称之为自身免疫基因[2]。我们检测了SLE病人外周血淋巴细胞Bcl-2表达水平，探讨其临床意义。
1 病例与方法
1.1 对象 31例病例均符合1982年美国风湿病协会SLE分类修订标准。其中女性26例，平均年龄31±8岁(18～58岁)。几乎所有病人在受检时均用过强的松10～30 mg/d。参照唐氏标准活动期病人18例，非活动期病人13例[3]。以SLE疾病活动指数(SLE Disease Activity Index,SLEDAI)对SLE病情活动性进行评分[4]。设其他疾病组9例(类风湿性关节炎和慢性肾炎各3例，强直性脊柱炎、多发性肌炎和白塞氏病各1例)。正常对照组14例系健康人员，女性10例，平均年龄33±9岁(21～59岁)。
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1.2 方法 采用分层液密度梯度离心获取PBMC；以流式细胞仪双标记免疫荧光方法测定外周血T、B淋巴细胞Bcl-2蛋白的表达[5，6]。PBMC加入多聚甲醛使其终浓度为0.5%，4℃过夜后离心弃上清，加入0.1%的Triton100 5 min，离心弃上清，每管分别加入FITC标记的鼠抗人CD3+、CD4+、CD8+和CD19+单抗(Immunotech)10 μl，再加入兔抗人Bcl-2单抗(Dako)5 μl，混合后4℃ 60 min，PBS洗两遍，所有管都加入若丹明标记的单抗兔IgG(Immunotech)5 μl，混合后4℃60 min，以流式细胞仪(Coulter)分析每管样品中10 000个细胞，得出表达Bcl-2蛋白阳性的百分率，并测定CD3+T细胞Bcl-2蛋白表达的平均荧光强度(Mean fluorescence intensity,MFI)。
1.3 统计分析 应用美国SPSS6.0对实验数据进行Mann-Whitney U检验和Duncan秩和检验(Duncan's multiple range test)及双变量相关分析。
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2 结果
活动期SLE病人CD3+、CD4+和CD8+T细胞亚群Bcl-2蛋白表达明显高于非活动期SLE病人、其他疾病组和正常对照组，CD19+B细胞Bcl-2蛋白的表达在各组之间无统计学差异(见表1)。进一步分析发现，活动期SLE病人外周血CD3+T细胞Bcl-2蛋白表达的平均荧光强度(MFI)明显高于非活动期SLE病人、其他疾病组和正常对照组(0.535 7±0.264 0对比0.164 2±0.031 0、0.158 1±0.029 0及0.138 9±0.022 0，P<0.05)。且与SLE疾病活动指数(SLEDAI)成正相关(r=0.819 5，P<0.01)，而与ESR、C3和C4水平无相关关系，与自身抗体ANA、抗ds-DNA及抗Sm抗体阳性率也无相关关系。
表1 SLE病人外周血T、B淋巴细胞Bcl-2的表达(x±s,%)
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Tab.1 Expression of Bcl-2 protein peripheral blood T subgroups and B cells in SLE patients (x±s，%)
CD3+
CD4+
CD8+
CD19+
Active SLE
63.49±16.771)
64.32±16.291)
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60.76±16.921)
78.23±11.5
Inactive SLE
14.52±10.93
14.07±11.70
15.93±11.56
80.56±10.48
Other diseases
11.47±4.97
12.44±5.77
11.00±4.98
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78.59±7.52
Healthy control
9.94±4.96
14.99±20.92
10.53±4.89
81.9±6.97
Note:1)compared with healthy controls，other diseases and inactive SLE，P<0.01
3 讨论
SLE是一种全身性多器官受累的自身免疫病，免疫学特征是B细胞多克隆活化，T细胞活化增加，产生许多自身抗体，其发病机制尚不清楚。有人报道活动期SLE病人T细胞Bcl-2蛋白表达明显增高[5，6]，且PBMC Bcl-2 mRNA表达水平明显升高[7]。我们也证实活动期SLE病人CD3+、CD4+和CD8+ T细胞Bcl-2蛋白与非活动期SLE病人有显著差异。Strasser等观察到细胞凋亡抑制基因Bcl-2对成熟T细胞具有明显效应[8]，可表达Bcl-2的外周血T细胞在培养中不仅生存期较长，而且也产生持续时间长而剧烈的抗原反应，这种抗原反应的变化可能是活化T细胞凋亡被抑制的结果。此外，Bcl-2表达使得CD3+抑制性自身反应性胸腺细胞出现，提示Bcl-2表达确实对胸腺内克隆性删除具有抑制效应[8]。再者，我们发现CD4+T细胞(T辅助细胞)和CD8+T细胞(T抑制细胞)亚群Bcl-2表达异常，这可导致T细胞亚群凋亡的异常，从而引起SLE病人T细胞的免疫调节功能紊乱，而SLE病人B细胞的活化是T细胞依赖性的，在B细胞多克隆化过程中，T细胞调节功能紊乱是一个重要因素。表明了T细胞Bcl-2异常表达在SLE疾病活动的过程中起着重要作用。
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Aringer报道SLE病人PBMC Bcl-2蛋白表达的MFI与疾病活动性(SIS)成正相关[5]，我们发现SLE病人外周血CD3+T细胞Bcl-2蛋白表达的MFI与SLEDAI也成正相关关系，故检测SLE病人血T淋巴细胞Bcl-2蛋白的表达水平可作为SLE的活动性指标，但CD3+T细胞Bcl-2蛋白表达的MFI与血沉、补体C3、C4水平及抗ds-DNA、抗Sm、ANA阳性率并无相关关系，提示T细胞Bcl-2蛋白表达是反映疾病活动性的独立指标。SLE病人淋巴细胞Bcl-2基因及蛋白的高表达原因未明了。研究显示，Bcl-2基因易位于14号染色体上免疫球蛋白重链基因区(JH)的基因重排可使Bcl-2蛋白高表达。Aringer等报道具有Bcl-2蛋白及mRNA高表达的活动期SLE病人未见Bcl-2基因重排[5]。说明尚有其他机制调节SLE病人Bcl-2高表达，已有报道EB病毒和白细胞介素2可刺激Bcl-2蛋白表达水平升高[5]。有人推测SLE病人循环Bcl-2阳性淋巴细胞数明显增多是由于骨髓大量释放(an augmented release)且生存延长[5]。
, http://www.100md.com
系统性红斑狼疮病人血T、B淋巴细胞Bcl-2的表达 本课题由国家自然科学基金资助(No.39770706)
赵湘茹 中山医科大学教学实验中心，广州510080
作者简介：刘亚光，男，33岁，博士，讲师；
尹培达，男，63岁，教授，博士生导师，主要从事风湿病和肾病研究
4 参考文献
1 Tsujimoto Y,Finger L R,Yunis J et al. Cloning the chromosome breakpoint of neoplastic B cells with the t(14;18) chromosome location.Science,1984;226(4678):1097
, 百拇医药
2 Talal N.Concluding remarks：autogene and oncogenes.Clin Immunol Immunopathol,1994;72(2):208
3 唐福林，董 怡，陈培珍 et al.系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎病人血清中抗组织蛋白抗体的测定及其临床意义.中华内科杂志，1990；29(4)：221
4 Bombardier C,Gladman D D,Urowiz M B et al. Derivation of the SLEDAI; a disease activity index for lupus patients.Arthritis Rheum,1992;35(6):630
5 Aringer M,Wintersberger W,Steiner C W et al. High levels of bcl-2 pro tein in circulating T lymphocytes,but not B lymphocytes, of patients with systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum,1994;37(10):1423
, 百拇医药
6 Ohsako S,Hara M,Harigai M et al. Expression and function of Fas antigen and bcl-2 in human systemic lupus erythematosus lymphocytes.Clin Immunol Immunopathol,1994；73(1):109
7 Graninger W B.Transcriptional overexpression of the protooncogene bcl-2 in patients with systemic lupus erythematosus.Wien Klin Wochenschr,1992;104(7):205
8 Strasser A, Harris A W,Cory S. Bcl-2 transgene inhibits T cell death and perturbs thymic self-censorship.Cell,1991;67(5):889
〔收稿1997-11-30 修回1998-03-18〕, http://www.100md.com