抗MHC I类单抗对NK细胞杀伤能力的影响
作者：张 彩 田志刚 张建华 许晓群 孙
单位：山东省医学科学院基础医学研究所山东肿瘤生物治疗研究中心，济南250062
关键词：NK细胞；MHC I类分子；细胞毒活性
中国免疫学杂志990307张 彩 田志刚 张建华 许晓群 孙
中国图书分类号 R392.1
摘 要 目的：探讨NK细胞杀伤与靶细胞表面MHC I类分子的关系。方法：用HLA-ABC单抗培养上清或腹水封闭靶细胞K562表面的HLA-ABC分子后，分别观察了外周血新鲜NK细胞、纯化NK细胞、LAK细胞和CD3AK细胞对K562细胞杀伤能力的变化。结果：外周血新鲜NK细胞和纯化NK细胞对K562的杀伤率明显提高，CD3AK细胞的杀伤力明显降低，LAK细胞的杀伤无明显变化。结论：NK细胞通过其表面受体识别靶细胞上的MHC I类分子而传递杀伤抑制性信号，抗HLA-ABC单抗封闭了靶细胞上的HLA-ABC等位基因而阻止了阴性信号的传导。
, 百拇医药
The effect of anti-MHC class I monoclonal antibody on NK-mediated cytolytic activity
ZHAHG Cai,TIAN Zhi-Gang,ZHANG Jian-Hua et al.
Shandong Cancer Biotherapy Center,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062
Abstract Objective:To study the relation of cytolytic activity of NK cells and MHC class I molecules on target cells.Metheds:The changes of cytolytic activity of fresh NK cells seperated from peripheral blood,purified NK cells,LAK cells and CD3AK cells were observed when target cells were cultured with anti-HLA-ABC monoclonal antibody for 30 minutes.Results:The cytolytic activity of fresh NK cells and purified NK cells from LAK cells was highly increased,but that of CD3AK cells was lowered.The cytotxicity of LAK cells was not affected.Conclution:NK cell can recognize the MHC class I molecules on target cells and then inhibit its cytolytic activity by transmitting kill-inhibitory signals.The anti-HLA-ABC monoclonal antibody had prevented the delivering of negative signals by blocking the MHC class I molecules on target cells.
, http://www.100md.com
Key words NK cells MHC class I molecules Cytolytic actioity
NK细胞是表型和功能上独特的淋巴细胞亚群，是机体抵抗病毒感染和肿瘤生长的第一道防线，不需预先刺激即可介导广谱的杀瘤效应。由于NK细胞对不表达MHC分子的肿瘤细胞同样具有较高的杀伤能力，多年来人们通常认为NK细胞介导的细胞毒效应是MHC非限制性的。近年来，随着对NK细胞研究的深入，人们发现NK细胞杀伤的敏感性与靶细胞上MHC I类分子的表达密切相关，对不表达MHC I类分子或表达量较低的靶细胞杀伤力强，对表达MHC I类分子高的靶细胞杀伤力较弱或不杀伤。这方面的研究已逐步成为肿瘤免疫学研究的热点内容之一[1～4]。本文初步观察了MHC I类单抗对NK细胞杀伤能力的影响，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 K562细胞为本室常规传代培养 鼠抗人HLA-ABC、HLA-DR单抗杂交瘤细胞(ATCC引入)培养上清及腹水、新鲜兔血清均为本室自制。
, http://www.100md.com
1.2 LAK、CD3AK细胞的诱导 常规分离正常人外周血淋巴细胞，调至2×106～3×106ml-1，用rhIL-2 1 000 U/ml诱导LAK细胞；用rhIL-2 200 U/ml、CD3单抗培养上清20 μl/ml诱导CD3AK细胞。均诱导8～10 d。
1.3 纯化NK细胞的制备[5] 以补体依赖细胞毒法去除LAK细胞中的T细胞，剩余细胞即为较纯的NK细胞。即将LAK细胞悬液加入抗CD3单抗培养上清，37℃ 30 min后加新鲜兔血清，37℃ 1 h，以去除其中的T细胞。用淋巴细胞分离液分离活细胞，并经表型测定(间接SPA法)确定为NK细胞。
1.4 细胞毒活性测定 用MTT法，将K562细胞先与不同量的HLA-ABC或HLA-DR单抗上清或腹水作用30 min后，洗3遍，再加效应细胞，并设不加单抗对照组，效靶比为10∶1。采用10%SDS溶解甲颗粒[6]。
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2 结果
2.1 HLA-ABC单抗对外周血NK细胞杀伤能力的影响 HLA-ABC单抗与靶细胞作用后靶细胞对NK杀伤的敏感性有提高的趋势，以2.5 μl单抗腹水组提高幅度最大(P<0.01)。各浓度的HLA-DR单抗培养上清及腹水对其杀伤力无明显影响，见图1。
图1 抗MHC I类单抗对新鲜NK细胞杀伤能力的影响
Fig.1 Effect of anti-MHC I MoAb on cytotoxicity of fresh NK cells seperated from peripheral blood
2.2 HLA-ABC单抗对LAK细胞中纯化NK细胞杀伤能力的影响 HLA-ABC单抗与K562细胞作用后，LAK细胞的杀伤率略有所降低。而去除T细胞后的纯化NK细胞的杀伤有提高的趋势，以5 μl单抗腹水组提高最明显(P<0.01)。各浓度的HLA-DR单抗培养上清或腹水对LAK及NK细胞的杀伤均无影响，见图2。
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图2 抗MHC I类单抗对LAK和纯化NK细胞杀伤能力的影响
Fig.2 Effect of anti-MHC Class I MoAb on cytotoxicity of LAK cells and purified NK cells
2.3 HLA-ABC单抗对CD3AK细胞杀伤能力的影响 HLA-ABC单抗与靶细胞作用后，靶细胞对CD3AK细胞杀伤的敏感性明显降低(P<0.001)，见图3。
图3 抗MHC I类单抗对CD3AK细胞毒活性的影响
Fig.3 Effect of anti-MHC Class I MoAb on cytotoxicity of CD3AK cells
, 百拇医药
3 讨论
现已发现，NK细胞存在识别靶细胞表面分子的触发性受体(Killer-cell activatory receptors,KARs)和杀伤抑制性受体(Killer-cell inhibitory receptors,KIRs)。杀伤抑制性受体识别靶细胞上的MHC I类分子，并传递阴性信号[2，3]。因此，NK细胞对MHC I类分子表达量高的靶细胞杀伤力弱或不杀伤，对MHC I类分子缺乏或突变的靶细胞则杀伤能力强。用MHC I类基因转染后，可使对NK裂解敏感的靶细胞转为完全或部分抵抗。
本文用MHC I类单抗与靶细胞事先孵育后，发现外周血新鲜NK细胞及纯化NK细胞对靶细胞的杀伤率有提高的趋势。由于NK细胞也能通过ADCC作用杀伤靶细胞，我们用鼠抗人HLA-DR单抗培养上清或腹水与靶细胞K562孵育作为对照组，发现不能增加NK细胞的裂解能力(见图1，2)。在以前的试验中曾用其他非MHC类单抗(如鼠抗人IL-6、IL-1单抗，均属IgG类)与靶细胞孵育后，均不增强NK杀伤的能力。因此，可以说明本试验NK杀伤能力的提高并非是由于NK细胞ADCC的作用。提示靶细胞上的MHC I类分子被单抗封闭后，使NK细胞的杀伤抑制性受体不能识别MHC I类分子而阻止了阴性信号的传导，从而使NK细胞杀伤能力明显增强。国外学者曾在测NK细胞毒活性之前先用鼠抗人HLA-DR单抗与靶细胞孵育或直接用HLA-ABC单抗的(Fab)’2片段与靶细胞作用来消除ADCC的影响，均得到类似的结果[7，8]。CD3AK细胞是以T细胞为主的异质性群体，与NK细胞相反，T细胞，尤其是CTL细胞，通过识别靶细胞上的MHC I类分子传递阳性信号而杀伤相应的靶细胞。MHC I类单抗能遮蔽CTL细胞的MHC识别位点而阻止CTL的杀伤，故MHC I类单抗对CD3AK细胞的杀伤起明显的抑制作用。NK细胞和CTL细胞识别MHC I类分子产生的不同结果，使二者的功能相互补充，共同完成机体的免疫监视任务。MHC I类单抗对LAK细胞的杀伤无明显影响，可能与LAK细胞中NK细胞与T细胞识别MHC I类分子产生的不同效应有关。
, 百拇医药
克隆分析提示，不同的NK细胞亚群能识别不同的MHC I类等位基因，即NK细胞对MHC I类等位基因的识别存在克隆异质性[2，3]。NK细胞存在识别MHC I类分子的受体库。因此，用NK克隆技术进行研究将更为合理。此工作正在进行中。
作者简介：张 彩，女，32岁，助理研究员，主要从事免疫学研究；
田志刚，男，42岁，研究员，博士，博士生导师，主要从事免疫学和分子生物学研究
4 参考文献
1 Moretta L,Ciccone E,Mingari M C et al. Human Natural Killer Cells: Origin,Clonality,Specificity and Receptors.Advances in Immunology,1994;55:341
, 百拇医药
2 Bottino C,Vitale M,Pende D et al. Receptors for HLA Class I Molecules in Human NK Cells.Seminars in Immunology,1995;7:67
3 Lanier L L,Phillips J S.NK Cells Recognition of Major Histocompatibility Complex Class I Molecules.Seminars in Immunology,1995;7:75
4 田志刚，孙氵 内.NK细胞的识别功能.国外医学。肿瘤分册，1997；24(3)：133
5 Ciccone E,Viale O,Pende D et al. Specific Lysis of Allogeneic Cells After Activation of CD3- Lymphocytes in Mixed Lymphocytes Cuture.J Exp Med,1988;168:2403
, http://www.100md.com
6 邱玉华，缪竞诚，付 强 et al. 异丙醇和SDS在MTT比色法检测NKCF活性中的应用比较.上海免疫学杂志，1994；14(3)：128
7 Rojo S,Burshtyn D N,Long E O et al.Type I Transmembrane Receptor with Inhibitory Function in Mouse Mast Cells and NK Cells.J Immunol,1997;158(1):9
8 Lobo P I，Spencer C E.Use of Anti-HLA Antibodies to Mask Major Histocompatibility Complex Gene Products on Tumor Cells Can Enhence Susceptibility of These Cells to Lysis by Natural Killer Cells.J Clin Invest,1989;83:278
〔收稿1997-08-25 修回1998-03-05〕, http://www.100md.com
单位：山东省医学科学院基础医学研究所山东肿瘤生物治疗研究中心，济南250062
关键词：NK细胞；MHC I类分子；细胞毒活性
中国免疫学杂志990307张 彩 田志刚 张建华 许晓群 孙
中国图书分类号 R392.1
摘 要 目的：探讨NK细胞杀伤与靶细胞表面MHC I类分子的关系。方法：用HLA-ABC单抗培养上清或腹水封闭靶细胞K562表面的HLA-ABC分子后，分别观察了外周血新鲜NK细胞、纯化NK细胞、LAK细胞和CD3AK细胞对K562细胞杀伤能力的变化。结果：外周血新鲜NK细胞和纯化NK细胞对K562的杀伤率明显提高，CD3AK细胞的杀伤力明显降低，LAK细胞的杀伤无明显变化。结论：NK细胞通过其表面受体识别靶细胞上的MHC I类分子而传递杀伤抑制性信号，抗HLA-ABC单抗封闭了靶细胞上的HLA-ABC等位基因而阻止了阴性信号的传导。
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The effect of anti-MHC class I monoclonal antibody on NK-mediated cytolytic activity
ZHAHG Cai,TIAN Zhi-Gang,ZHANG Jian-Hua et al.
Shandong Cancer Biotherapy Center,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062
Abstract Objective:To study the relation of cytolytic activity of NK cells and MHC class I molecules on target cells.Metheds:The changes of cytolytic activity of fresh NK cells seperated from peripheral blood,purified NK cells,LAK cells and CD3AK cells were observed when target cells were cultured with anti-HLA-ABC monoclonal antibody for 30 minutes.Results:The cytolytic activity of fresh NK cells and purified NK cells from LAK cells was highly increased,but that of CD3AK cells was lowered.The cytotxicity of LAK cells was not affected.Conclution:NK cell can recognize the MHC class I molecules on target cells and then inhibit its cytolytic activity by transmitting kill-inhibitory signals.The anti-HLA-ABC monoclonal antibody had prevented the delivering of negative signals by blocking the MHC class I molecules on target cells.
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Key words NK cells MHC class I molecules Cytolytic actioity
NK细胞是表型和功能上独特的淋巴细胞亚群，是机体抵抗病毒感染和肿瘤生长的第一道防线，不需预先刺激即可介导广谱的杀瘤效应。由于NK细胞对不表达MHC分子的肿瘤细胞同样具有较高的杀伤能力，多年来人们通常认为NK细胞介导的细胞毒效应是MHC非限制性的。近年来，随着对NK细胞研究的深入，人们发现NK细胞杀伤的敏感性与靶细胞上MHC I类分子的表达密切相关，对不表达MHC I类分子或表达量较低的靶细胞杀伤力强，对表达MHC I类分子高的靶细胞杀伤力较弱或不杀伤。这方面的研究已逐步成为肿瘤免疫学研究的热点内容之一[1～4]。本文初步观察了MHC I类单抗对NK细胞杀伤能力的影响，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 K562细胞为本室常规传代培养 鼠抗人HLA-ABC、HLA-DR单抗杂交瘤细胞(ATCC引入)培养上清及腹水、新鲜兔血清均为本室自制。
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1.2 LAK、CD3AK细胞的诱导 常规分离正常人外周血淋巴细胞，调至2×106～3×106ml-1，用rhIL-2 1 000 U/ml诱导LAK细胞；用rhIL-2 200 U/ml、CD3单抗培养上清20 μl/ml诱导CD3AK细胞。均诱导8～10 d。
1.3 纯化NK细胞的制备[5] 以补体依赖细胞毒法去除LAK细胞中的T细胞，剩余细胞即为较纯的NK细胞。即将LAK细胞悬液加入抗CD3单抗培养上清，37℃ 30 min后加新鲜兔血清，37℃ 1 h，以去除其中的T细胞。用淋巴细胞分离液分离活细胞，并经表型测定(间接SPA法)确定为NK细胞。
1.4 细胞毒活性测定 用MTT法，将K562细胞先与不同量的HLA-ABC或HLA-DR单抗上清或腹水作用30 min后，洗3遍，再加效应细胞，并设不加单抗对照组，效靶比为10∶1。采用10%SDS溶解甲颗粒[6]。
, 百拇医药
2 结果
2.1 HLA-ABC单抗对外周血NK细胞杀伤能力的影响 HLA-ABC单抗与靶细胞作用后靶细胞对NK杀伤的敏感性有提高的趋势，以2.5 μl单抗腹水组提高幅度最大(P<0.01)。各浓度的HLA-DR单抗培养上清及腹水对其杀伤力无明显影响，见图1。
图1 抗MHC I类单抗对新鲜NK细胞杀伤能力的影响
Fig.1 Effect of anti-MHC I MoAb on cytotoxicity of fresh NK cells seperated from peripheral blood
2.2 HLA-ABC单抗对LAK细胞中纯化NK细胞杀伤能力的影响 HLA-ABC单抗与K562细胞作用后，LAK细胞的杀伤率略有所降低。而去除T细胞后的纯化NK细胞的杀伤有提高的趋势，以5 μl单抗腹水组提高最明显(P<0.01)。各浓度的HLA-DR单抗培养上清或腹水对LAK及NK细胞的杀伤均无影响，见图2。
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图2 抗MHC I类单抗对LAK和纯化NK细胞杀伤能力的影响
Fig.2 Effect of anti-MHC Class I MoAb on cytotoxicity of LAK cells and purified NK cells
2.3 HLA-ABC单抗对CD3AK细胞杀伤能力的影响 HLA-ABC单抗与靶细胞作用后，靶细胞对CD3AK细胞杀伤的敏感性明显降低(P<0.001)，见图3。
图3 抗MHC I类单抗对CD3AK细胞毒活性的影响
Fig.3 Effect of anti-MHC Class I MoAb on cytotoxicity of CD3AK cells
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3 讨论
现已发现，NK细胞存在识别靶细胞表面分子的触发性受体(Killer-cell activatory receptors,KARs)和杀伤抑制性受体(Killer-cell inhibitory receptors,KIRs)。杀伤抑制性受体识别靶细胞上的MHC I类分子，并传递阴性信号[2，3]。因此，NK细胞对MHC I类分子表达量高的靶细胞杀伤力弱或不杀伤，对MHC I类分子缺乏或突变的靶细胞则杀伤能力强。用MHC I类基因转染后，可使对NK裂解敏感的靶细胞转为完全或部分抵抗。
本文用MHC I类单抗与靶细胞事先孵育后，发现外周血新鲜NK细胞及纯化NK细胞对靶细胞的杀伤率有提高的趋势。由于NK细胞也能通过ADCC作用杀伤靶细胞，我们用鼠抗人HLA-DR单抗培养上清或腹水与靶细胞K562孵育作为对照组，发现不能增加NK细胞的裂解能力(见图1，2)。在以前的试验中曾用其他非MHC类单抗(如鼠抗人IL-6、IL-1单抗，均属IgG类)与靶细胞孵育后，均不增强NK杀伤的能力。因此，可以说明本试验NK杀伤能力的提高并非是由于NK细胞ADCC的作用。提示靶细胞上的MHC I类分子被单抗封闭后，使NK细胞的杀伤抑制性受体不能识别MHC I类分子而阻止了阴性信号的传导，从而使NK细胞杀伤能力明显增强。国外学者曾在测NK细胞毒活性之前先用鼠抗人HLA-DR单抗与靶细胞孵育或直接用HLA-ABC单抗的(Fab)’2片段与靶细胞作用来消除ADCC的影响，均得到类似的结果[7，8]。CD3AK细胞是以T细胞为主的异质性群体，与NK细胞相反，T细胞，尤其是CTL细胞，通过识别靶细胞上的MHC I类分子传递阳性信号而杀伤相应的靶细胞。MHC I类单抗能遮蔽CTL细胞的MHC识别位点而阻止CTL的杀伤，故MHC I类单抗对CD3AK细胞的杀伤起明显的抑制作用。NK细胞和CTL细胞识别MHC I类分子产生的不同结果，使二者的功能相互补充，共同完成机体的免疫监视任务。MHC I类单抗对LAK细胞的杀伤无明显影响，可能与LAK细胞中NK细胞与T细胞识别MHC I类分子产生的不同效应有关。
, 百拇医药
克隆分析提示，不同的NK细胞亚群能识别不同的MHC I类等位基因，即NK细胞对MHC I类等位基因的识别存在克隆异质性[2，3]。NK细胞存在识别MHC I类分子的受体库。因此，用NK克隆技术进行研究将更为合理。此工作正在进行中。
作者简介：张 彩，女，32岁，助理研究员，主要从事免疫学研究；
田志刚，男，42岁，研究员，博士，博士生导师，主要从事免疫学和分子生物学研究
4 参考文献
1 Moretta L,Ciccone E,Mingari M C et al. Human Natural Killer Cells: Origin,Clonality,Specificity and Receptors.Advances in Immunology,1994;55:341
, 百拇医药
2 Bottino C,Vitale M,Pende D et al. Receptors for HLA Class I Molecules in Human NK Cells.Seminars in Immunology,1995;7:67
3 Lanier L L,Phillips J S.NK Cells Recognition of Major Histocompatibility Complex Class I Molecules.Seminars in Immunology,1995;7:75
4 田志刚，孙氵 内.NK细胞的识别功能.国外医学。肿瘤分册，1997；24(3)：133
5 Ciccone E,Viale O,Pende D et al. Specific Lysis of Allogeneic Cells After Activation of CD3- Lymphocytes in Mixed Lymphocytes Cuture.J Exp Med,1988;168:2403
, http://www.100md.com
6 邱玉华，缪竞诚，付 强 et al. 异丙醇和SDS在MTT比色法检测NKCF活性中的应用比较.上海免疫学杂志，1994；14(3)：128
7 Rojo S,Burshtyn D N,Long E O et al.Type I Transmembrane Receptor with Inhibitory Function in Mouse Mast Cells and NK Cells.J Immunol,1997;158(1):9
8 Lobo P I，Spencer C E.Use of Anti-HLA Antibodies to Mask Major Histocompatibility Complex Gene Products on Tumor Cells Can Enhence Susceptibility of These Cells to Lysis by Natural Killer Cells.J Clin Invest,1989;83:278
〔收稿1997-08-25 修回1998-03-05〕, http://www.100md.com