抗乙肝病毒表面抗原单链抗体在大肠杆菌中的高效表达
作者：高荣凯 王 琰 刘群英 朱迎春 化 冰 陈宇萍
单位：海军总医院，北京100037
关键词：乙肝病毒表面抗原；单链抗体；高效表达
中国免疫学杂志990311 中国图书分类号 R371-33
摘 要 目的：在大肠杆菌中高效表达抗乙肝表面抗原的单链抗体。方法：通过PCR将单链抗体基因重组到原核细胞表达载体pT7中，构建单链抗体高效表达载体pT7SC。将pT7SC质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导进行表达。结果：获得了ScFv的高效表达，表达产物占菌体总蛋白的28%以上。竞争抑制性ELISA检测诱导后的细菌培养上清，证明所表达的ScFv具有抗体活性。进一步将c-Myc十肽连接在ScFv的羧基端，使所表达的ScFv易于检测。结论：在大肠杆菌高效表达抗乙肝ScFv，将促进小分子抗体的应用。
, 百拇医药
High level expression of anti-HBsAg single-chain Fv in E.coli
GAO Rong-Kai，WANG Yan,LIU Qun-Ying et al.
Central Laboratory,Navy General Hospital,Beijing 100037
Abstract Objective：To obtain high level expression of anti-HBsAg ScFv in E.coli.Methods：An anti-HBsAg ScFv expression vector pT7SC was constructed by inserting the ScFv gene obtained by PCR amplification from vector pHBSCS constructed previously into a T7 promoter containing vector. pT7SC was transformed into E.coli BL21(DE3) cells and expression was induced by IPTG.Results:The ScFv product constituted 28% of the total bacterial protein.HBsAg binding activity was detected in the supernatant of the induced bacteria by competitive ELISA.In order to facilitate the detection of ScFv,the vector was further modified attaching sequences encoding c-Myc derived decapeptide to the 3′-end of ScFv gene.ScFv protein thus produced could be easily detected by ELISA using McAb 9E10.Conclusion:Success in high level expression of anti-HBsAg ScFv would facilitate the use of small antibody molecules.
, 百拇医药
Key words HBsAg Single-chain Fv(ScFv) High level expression
单链抗体是将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一个人工设计的柔性连接肽连接在一起，形成单一肽链的小分子抗体，它以一条多肽链的形式表达存在，能够正确折叠，保持与特异抗原结合的能力[1，2]。用噬菌体抗体库技术克隆了抗HBsAg的人抗体基因[3，4]，并构建了抗HBsAg单链抗体的分泌型表达载体[5]，本文在此基础上构建了ScFv的高效表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表达。
1 材料与方法
1.1 大肠杆菌HB101、BL21(DE3)为本室保存菌种。质粒pHBSCS为本室构建的分泌型ScFv表达载体[5]，内含抗HBsAg单链抗体基因片段。质粒pT7为原核细胞表达载体，含有T7 RNA聚合酶启动子和终止子，由美国引进。分泌 9E10 单抗的杂交瘤细胞株由美国引进，9E10单抗所针对的抗原决定基是c-Myc蛋白内的一段十肽[6]。
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1.2 为了构建pT7SC,参照ScFv基因序列合成两段特异引物。5′-引物为GCGGCCATATGAAAAAACA
GCG-TATCGC，引入Nde I切点；3′-引物为GCGGGGATCC-TTAGTGATGGTGATGGTGAT。为添加c-Myc-抗原决定基，合成如下2条寡核苷酸：5′-CTAGTGAACAAA-AACTCATCTCAGAAGAAGATCTGGCTAGCG和5′-CT-AGCGCTAGCCAGATCTTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTT-CA，2条链有38个碱基互补，经退火形成的双链含有c-Myc十肽(EQKLISEEDL)的编码序列[6]，其两端为Spe I和Nhe I的粘性末端。以上引物均通过赛百盛公司由美国CyberSyn公司合成。
1.3 PCR等基因工程操作参照文献[7]进行。
1.4 抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中以IPTG对含pT7SC的重组菌株BL21(DE3)进行诱导表达，不同时间取样进行检测。
, 百拇医药
1.5 表达产物的活性测定
1.5.1 竞争性抑制ELISA 用HBsAg包酶标板，ScFv与HBsAg噬菌体抗体的竞争性结合按公式计算：抑制率=(OD对照-OD样品)/OD对照×100%。
1.5.2 间接ELISA 通过c-Myc十肽进行检测，以HBsAg包板，待测样品孵育后加入1∶1 000稀释的9E10腹水，37℃孵育后加入适当稀释的HRP-抗鼠IgG进行反应，最后用OPD底物显色。
1.6 SDS-PAGE按常规方法进行。
2 结果
2.1 高效表达载体pT7SC的构建 为将抗HBsAgScFv表达载体pHBSCS中的ScFv基因重组到pT7中，我们设计了一组引物，可将ScFv基因及其ompA前导序列和3′端的组氨酸尾巴通过PCR扩增得到约860 bp的产物，以Nde I加Sal I位点定向克隆入pT7载体中，得到表达载体pT7SC。
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2.2 pT7SC所表达的ScFv的活性测定 将pT7SC转化BL21(DE3)细胞，转化菌经IPTG诱导不同时间后，用竞争抑制性ELISA检测培养上清中表达产物的抗原结合活性，发现培养上清中抗原结合活性随诱导表达时间增长而增加，到诱导表达4 h后逐渐持平，抑制率最高可近50%。
2.3 ScFv的高效表达 将上述IPTG诱导不同时间后的细菌沉淀进行SDS-PAGE分析，从诱导表达0.5 h开始即在28 kD左右出现一诱导表达带，随时间增长，该表达带增多，在3.0～6.0 h基本保持平稳，而空载体对照则无此诱导表达带。用UVP公司Gelbase-Pro软件对电泳结果分析发现，在诱导表达后0.5 h时，表达量占菌体总蛋白的10%以上，在2.0～6.0 h时表达量可达菌体总蛋白的28%左右，如图1。
2.4 pT7SCM的构建及表达 由于ScFv不含有Ig恒定区，不能用一般抗Ig进行检测，为使ScFv便于检测，我们合成了编码c-Myc十肽的寡核苷酸，将其组装到p7TSC的VH基因和聚组氨酸之间，得到表达载体pT7SCM，该c-Myc十肽是一确定的抗原决定基，可被单克隆抗体9E10特异性识别[6]，将pT7SCM转入BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导不同时间后获取上清，进行ELISA实验，证明可用9E10检测出ScFv与HBsAg的结合活性。
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图1 经IPTG诱导后细菌的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
Fig.1 SDS-PAGE analysis of induction expression
Note:M.MW marker;1-8. samples after induction for 0.0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 and 6.0 h;9.pT7 vector control(3 h induction)
3 讨论
单链抗体是基因工程抗体家族中的一个重要成员，有多种优点及较好的临床应用前景，可在大肠杆菌中高效表达，从而为通过发酵大量制备单链抗体提供了条件。本文利用T7 RNA聚合酶启动表达体系得到了抗HBsAg ScFv的高效表达，表达量达菌体总蛋白的28%。在构建pT7SC时保留了原ScFv基因5′端的ompA信号序列，优点是：(1)由于它是细菌本身的蛋白，易于被宿主菌识别，使外源基因获高效表达；(2)可同时产生ScFv的分泌型表达产物，在细菌培养上清中得到有功能活性的蛋白分子，利于检测。我们用ELISA测到培养上清中的抗体活性也证明这一点。在细菌内外源基因表达量很高时，大部分表达产物以不溶性的包涵体形式沉积在菌体内，这种情况下信号肽仍能被正确切除[8]。形成的包涵体对表达产物的纯化有利，但其为不溶的非活性态，尚需对其进行复性，此研究正在进行中。
, 百拇医药
单链抗体不含有Ig的恒定区，不能与抗Ig的二抗结合，给ScFv的检测带来不便，需使用竞争抑制实验或生物活性测定法。为便于ScFv的检测，我们将一段来自c-Myc十肽编码序列重组到ScFv的3′端，该十肽是单抗9E10所识别的抗原决定基[6]，结果证明所表达的ScFv可用9E10进行ELISA检测，由于在c-Myc十肽序列两端设计了Nhe I和Spe I酶切位点，在体内应用时，可很方便地将其去除。此外还可利用此结构进行ScFv的亲和层析纯化。
抗乙肝病毒表面抗原单链抗体在大肠杆菌中的高效表达 本课题受国家科委“863”基金资助(863-102-12-08)
王 琰 通讯联系人
作者简介：高荣凯，男，30岁，博士，主要从事基因工程及抗体工程领域的研究；
王 琰，男，教授，主要从事分子免疫学方面的研究
, 百拇医药
4 参考文献
1 Huston J S,Levinson D,Mudgett-Humterr M et al.Protein engineering of antibody binding sites:recovery of specific activity of an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA,1998;85:5879
2 Bird R E,Hardman K D,Jacobson J W et al.Single-chain antigen-binding proteins.Science,1988;242:423
3 陈竞华，王 琰，刘群英et al.人源性噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选.中华微生物学和免疫学杂志，1995；15(3)：158
, http://www.100md.com
4 王 琰，刘群英，徐建军et al.人抗HBs Fab段基因的序列分析及表达.中华微生物学和免疫学杂志，1995；15(4)：304
5 王 琰，刘群英，高荣凯 et al.单链抗体(ScFv)表达载体的构建及抗HBsAg ScFv的表达.中华微生物学和免疫学杂志，1997；17(1)：68
6 Evan G I,Lewis G K,Ramsay G et al. Isolating of monoclonal antibodies specific for human c-Myc proto-oncogene product.Mole Cell Biol,1985;5:3610
7 萨姆布鲁克 J，弗里奇 E F，曼尼阿蒂斯T et al.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992：672-683
8 Marc W,David F.Single-chain Fv proteins and their fusion proteins.Methods:a companion to methods in enzymology,1991;2(2):97
〔收稿1996-07-09 二次修回1998-03-20〕, 百拇医药
单位：海军总医院，北京100037
关键词：乙肝病毒表面抗原；单链抗体；高效表达
中国免疫学杂志990311 中国图书分类号 R371-33
摘 要 目的：在大肠杆菌中高效表达抗乙肝表面抗原的单链抗体。方法：通过PCR将单链抗体基因重组到原核细胞表达载体pT7中，构建单链抗体高效表达载体pT7SC。将pT7SC质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导进行表达。结果：获得了ScFv的高效表达，表达产物占菌体总蛋白的28%以上。竞争抑制性ELISA检测诱导后的细菌培养上清，证明所表达的ScFv具有抗体活性。进一步将c-Myc十肽连接在ScFv的羧基端，使所表达的ScFv易于检测。结论：在大肠杆菌高效表达抗乙肝ScFv，将促进小分子抗体的应用。
, 百拇医药
High level expression of anti-HBsAg single-chain Fv in E.coli
GAO Rong-Kai，WANG Yan,LIU Qun-Ying et al.
Central Laboratory,Navy General Hospital,Beijing 100037
Abstract Objective：To obtain high level expression of anti-HBsAg ScFv in E.coli.Methods：An anti-HBsAg ScFv expression vector pT7SC was constructed by inserting the ScFv gene obtained by PCR amplification from vector pHBSCS constructed previously into a T7 promoter containing vector. pT7SC was transformed into E.coli BL21(DE3) cells and expression was induced by IPTG.Results:The ScFv product constituted 28% of the total bacterial protein.HBsAg binding activity was detected in the supernatant of the induced bacteria by competitive ELISA.In order to facilitate the detection of ScFv,the vector was further modified attaching sequences encoding c-Myc derived decapeptide to the 3′-end of ScFv gene.ScFv protein thus produced could be easily detected by ELISA using McAb 9E10.Conclusion:Success in high level expression of anti-HBsAg ScFv would facilitate the use of small antibody molecules.
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Key words HBsAg Single-chain Fv(ScFv) High level expression
单链抗体是将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一个人工设计的柔性连接肽连接在一起，形成单一肽链的小分子抗体，它以一条多肽链的形式表达存在，能够正确折叠，保持与特异抗原结合的能力[1，2]。用噬菌体抗体库技术克隆了抗HBsAg的人抗体基因[3，4]，并构建了抗HBsAg单链抗体的分泌型表达载体[5]，本文在此基础上构建了ScFv的高效表达载体，并在大肠杆菌中获得高效表达。
1 材料与方法
1.1 大肠杆菌HB101、BL21(DE3)为本室保存菌种。质粒pHBSCS为本室构建的分泌型ScFv表达载体[5]，内含抗HBsAg单链抗体基因片段。质粒pT7为原核细胞表达载体，含有T7 RNA聚合酶启动子和终止子，由美国引进。分泌 9E10 单抗的杂交瘤细胞株由美国引进，9E10单抗所针对的抗原决定基是c-Myc蛋白内的一段十肽[6]。
, http://www.100md.com
1.2 为了构建pT7SC,参照ScFv基因序列合成两段特异引物。5′-引物为GCGGCCATATGAAAAAACA
GCG-TATCGC，引入Nde I切点；3′-引物为GCGGGGATCC-TTAGTGATGGTGATGGTGAT。为添加c-Myc-抗原决定基，合成如下2条寡核苷酸：5′-CTAGTGAACAAA-AACTCATCTCAGAAGAAGATCTGGCTAGCG和5′-CT-AGCGCTAGCCAGATCTTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTT-CA，2条链有38个碱基互补，经退火形成的双链含有c-Myc十肽(EQKLISEEDL)的编码序列[6]，其两端为Spe I和Nhe I的粘性末端。以上引物均通过赛百盛公司由美国CyberSyn公司合成。
1.3 PCR等基因工程操作参照文献[7]进行。
1.4 抗HBsAg单链抗体在大肠杆菌中以IPTG对含pT7SC的重组菌株BL21(DE3)进行诱导表达，不同时间取样进行检测。
, 百拇医药
1.5 表达产物的活性测定
1.5.1 竞争性抑制ELISA 用HBsAg包酶标板，ScFv与HBsAg噬菌体抗体的竞争性结合按公式计算：抑制率=(OD对照-OD样品)/OD对照×100%。
1.5.2 间接ELISA 通过c-Myc十肽进行检测，以HBsAg包板，待测样品孵育后加入1∶1 000稀释的9E10腹水，37℃孵育后加入适当稀释的HRP-抗鼠IgG进行反应，最后用OPD底物显色。
1.6 SDS-PAGE按常规方法进行。
2 结果
2.1 高效表达载体pT7SC的构建 为将抗HBsAgScFv表达载体pHBSCS中的ScFv基因重组到pT7中，我们设计了一组引物，可将ScFv基因及其ompA前导序列和3′端的组氨酸尾巴通过PCR扩增得到约860 bp的产物，以Nde I加Sal I位点定向克隆入pT7载体中，得到表达载体pT7SC。
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2.2 pT7SC所表达的ScFv的活性测定 将pT7SC转化BL21(DE3)细胞，转化菌经IPTG诱导不同时间后，用竞争抑制性ELISA检测培养上清中表达产物的抗原结合活性，发现培养上清中抗原结合活性随诱导表达时间增长而增加，到诱导表达4 h后逐渐持平，抑制率最高可近50%。
2.3 ScFv的高效表达 将上述IPTG诱导不同时间后的细菌沉淀进行SDS-PAGE分析，从诱导表达0.5 h开始即在28 kD左右出现一诱导表达带，随时间增长，该表达带增多，在3.0～6.0 h基本保持平稳，而空载体对照则无此诱导表达带。用UVP公司Gelbase-Pro软件对电泳结果分析发现，在诱导表达后0.5 h时，表达量占菌体总蛋白的10%以上，在2.0～6.0 h时表达量可达菌体总蛋白的28%左右，如图1。
2.4 pT7SCM的构建及表达 由于ScFv不含有Ig恒定区，不能用一般抗Ig进行检测，为使ScFv便于检测，我们合成了编码c-Myc十肽的寡核苷酸，将其组装到p7TSC的VH基因和聚组氨酸之间，得到表达载体pT7SCM，该c-Myc十肽是一确定的抗原决定基，可被单克隆抗体9E10特异性识别[6]，将pT7SCM转入BL21(DE3)菌株，经IPTG诱导不同时间后获取上清，进行ELISA实验，证明可用9E10检测出ScFv与HBsAg的结合活性。
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图1 经IPTG诱导后细菌的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
Fig.1 SDS-PAGE analysis of induction expression
Note:M.MW marker;1-8. samples after induction for 0.0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 and 6.0 h;9.pT7 vector control(3 h induction)
3 讨论
单链抗体是基因工程抗体家族中的一个重要成员，有多种优点及较好的临床应用前景，可在大肠杆菌中高效表达，从而为通过发酵大量制备单链抗体提供了条件。本文利用T7 RNA聚合酶启动表达体系得到了抗HBsAg ScFv的高效表达，表达量达菌体总蛋白的28%。在构建pT7SC时保留了原ScFv基因5′端的ompA信号序列，优点是：(1)由于它是细菌本身的蛋白，易于被宿主菌识别，使外源基因获高效表达；(2)可同时产生ScFv的分泌型表达产物，在细菌培养上清中得到有功能活性的蛋白分子，利于检测。我们用ELISA测到培养上清中的抗体活性也证明这一点。在细菌内外源基因表达量很高时，大部分表达产物以不溶性的包涵体形式沉积在菌体内，这种情况下信号肽仍能被正确切除[8]。形成的包涵体对表达产物的纯化有利，但其为不溶的非活性态，尚需对其进行复性，此研究正在进行中。
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单链抗体不含有Ig的恒定区，不能与抗Ig的二抗结合，给ScFv的检测带来不便，需使用竞争抑制实验或生物活性测定法。为便于ScFv的检测，我们将一段来自c-Myc十肽编码序列重组到ScFv的3′端，该十肽是单抗9E10所识别的抗原决定基[6]，结果证明所表达的ScFv可用9E10进行ELISA检测，由于在c-Myc十肽序列两端设计了Nhe I和Spe I酶切位点，在体内应用时，可很方便地将其去除。此外还可利用此结构进行ScFv的亲和层析纯化。
抗乙肝病毒表面抗原单链抗体在大肠杆菌中的高效表达 本课题受国家科委“863”基金资助(863-102-12-08)
王 琰 通讯联系人
作者简介：高荣凯，男，30岁，博士，主要从事基因工程及抗体工程领域的研究；
王 琰，男，教授，主要从事分子免疫学方面的研究
, 百拇医药
4 参考文献
1 Huston J S,Levinson D,Mudgett-Humterr M et al.Protein engineering of antibody binding sites:recovery of specific activity of an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA,1998;85:5879
2 Bird R E,Hardman K D,Jacobson J W et al.Single-chain antigen-binding proteins.Science,1988;242:423
3 陈竞华，王 琰，刘群英et al.人源性噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选.中华微生物学和免疫学杂志，1995；15(3)：158
, http://www.100md.com
4 王 琰，刘群英，徐建军et al.人抗HBs Fab段基因的序列分析及表达.中华微生物学和免疫学杂志，1995；15(4)：304
5 王 琰，刘群英，高荣凯 et al.单链抗体(ScFv)表达载体的构建及抗HBsAg ScFv的表达.中华微生物学和免疫学杂志，1997；17(1)：68
6 Evan G I,Lewis G K,Ramsay G et al. Isolating of monoclonal antibodies specific for human c-Myc proto-oncogene product.Mole Cell Biol,1985;5:3610
7 萨姆布鲁克 J，弗里奇 E F，曼尼阿蒂斯T et al.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992：672-683
8 Marc W,David F.Single-chain Fv proteins and their fusion proteins.Methods:a companion to methods in enzymology,1991;2(2):97
〔收稿1996-07-09 二次修回1998-03-20〕, 百拇医药