T-AK细胞的细胞毒活性研究
作者：魏虎来 马海珍 赵怀顺
单位：兰州医学院血液病研究所，兰州 730000
关键词：T-AK细胞；细胞毒活性；异质性
中国免疫学杂志990305 中国图书分类号 R392.12 R730.51
摘 要 目的：探讨抗CD3单抗(CD3McAb)和rIL-2共同激活诱生的T-AK(T-activated killer)细胞的细胞毒活性本质。方法：采用MTT法分别检测T-AK细胞杀伤白血病细胞的活性及其构成。结果：T-AK细胞杀伤白血病细胞的活性主要由4部分组成：CD3McAb激活的CD3AK活性约占50%，rIL-2诱生的LAK细胞活性约为30%，NK活性约占10%，可溶性抑制性因子的抑制活性约为10%；细胞表型分析T-AK细胞主要表达活化T淋巴细胞和NK细胞的表面标志。结论：T-AK细胞为异质性细胞群体，其杀伤活性主体为CD3AK活性和LAK活性。
, 百拇医药
Study on cytotoxicity of human T-activated killer cells
WEI Hu-Lai,MA Hai-Zhen，ZHAO Huai-Shun.
Institute of Hematology,Lanzhou Medical College,Lanzhou 730000
Abstract Objective：To study the essence of the cytotoxicity of T-activated killer (T-AK) cells costimulated by anti-CD3 monoclonal antibody (CD3McAb) and recombinant interleukin-2 (rIL-2).Methods：T-AK activity against leukemia cells (K562 cells and Raji cells) were determined separately in a MTT assay.Results:The cytotoxicity of T-AK cells were composed of mainly four parts:CD3 McAb-activated CD3AK activity(50%),rIL-2-induced LAK activity(30%),NK activity(10%) and the activities of inhibitory factors in T-AK supernatant(10%).The analyses of phenotypes showed that T-AK cells mainly expressed the surface makers of activated T lymphocytes and NK-like cells.Conclusion:T-AK cells are heterogeneous cell population,consisting of mainly activated T lymphocytes and NK-like cells,the main part of T-AK cytotoxicyty is CD3 AK activity and LAK activity.
, 百拇医药
Key words T-AK cells Cytotoxicity Heterogeneity
在肿瘤过继免疫治疗中，外周淋巴细胞群依所应用的激活物质的不同而产生的杀伤活性有所不同。研究证实单独IL-2诱生的LAK细胞活性主要来源于NK细胞群，抗CD3单抗(CD3McAb)单独或合用低浓度rIL-2激活的杀伤活性(CD3AK)主要为CD3+、CD8+T淋巴细胞；而CD3McAb和高浓度rIL-2共同激活的杀伤活性(T-activated killer cells,T-AK)则既有NK细胞活性，又有活化T淋巴细胞活性[1-3]。本文在T-AK细胞形态学和免疫表型研究的基础上，探讨了从正常人外周血单个核细胞(PBMC)中制备的T-AK细胞的细胞毒活性及其构成。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 CD3McAb\,rIL-2(军事医学科学院)；MTT(Sigma)；十二烷基硫酸钠(SDS，Serva)；CD系列单抗、碱性磷酸酶桥联酶标(APAAP)试剂盒(中国医学科学院血液学研究所、北京邦定生物医学公司)。
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1.2 靶细胞 K562细胞、Raji细胞均由本所传代保存。
1.3 T-AK细胞诱生及活性分析
1.3.1 T-AK细胞 参见文献[1，4]。PBMC以2×106 ml-1接种于含CD3 McAb(1.0 μg/ml)+rIL-2(200 U/ml)的RPMI 1640完全培养液(TCM)中激活培养，并适时扩增。
1.3.2 NK细胞 PBMC接种在TCM中培养，作为测定T-AK活性中NK活性的效应细胞。
1.3.3 LAK细胞 PBMC接种于含200 U/ml rIL-2的TCM中培养，作为测定T-AK活性中LAK活性的效应细胞。
1.3.4 CD3AK细胞 PBMC接种在含CD3McAb1.0 μg/ml的TCM中培养，作为检测T-AK活性中CD3 AK活性的效应细胞。上述细胞培养72和120 h后，以K562细胞和Raji细胞为靶细胞，改良MTT法测定活性[4]。
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1.3.5 T-AK细胞上清液制备及抑瘤活性 参见文献[5]，结果以抑制率(IR)表示。
1.4 T-AK细胞免疫表型分析 采用APAAP桥联酶染色法[6]。结果以阳性细胞百分率(%)表示。
2 结果
2.1 T-AK上清液的抑瘤活性 T-AK细胞与K562细胞(20∶1)混合培养24 h的上清液，体外抑制K562细胞和Raji细胞的增殖，同时对其它肿瘤细胞亦有抑制作用[5]。
2.2 T-AK细胞活性中的CD3AK活性、LAK活性和NK活性 分别检测T-AK细胞激活培养体系中各刺激物质所诱生的杀伤活性，发现T-AK细胞活性由多种活性成分组成，其中CD3McAb激活的CD3AK活性约占50%，rIL-2活化的LAK活性约占30%；NK活性约为10%，杀瘤过程中释放的可溶性抑制性因子约为10%(表1)；但培养时间不同，靶细胞不同，各类活性所占比例有所不同(数据未列)。分别测得的各杀伤活性的总活性高于T-AK活性，可能与检测时T-AK活性中各效应细胞活性的部分重叠(如LAK和NK)、分别检测的误差等因素有关。
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2.3 T-AK细胞的免疫表型 从PBMC中诱生、扩增培养的T-AK细胞形态具有活化淋巴母细胞的特点，其免疫表型中CD3+93%，CD8+91%，CD16+22%，CD56+47%，CD25+41%，CD38+96%，HLA-DR+64%，证明T-AK细胞为表达活化T淋巴细胞和NK细胞表面标志的异质细胞群。
表1 T-AK细胞杀伤不同靶细胞的细胞毒活性成分(培养时间为120 h,E/T为20∶1，n=4,
±s)
Tab.1 The components of the cytotoxicity of T-AK cells against different target cells(induced for 120 h,effector:targer=20∶1，n=4,±s) Effectors
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Cytotoxicity(%)
K562
Raji
T-AK
89.86±10.04
78.13±6.67
CD3AK
48.67±2.18(0.50)
40.00±7.89(0.49)
LAK
28.18±4.87(0.29)
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32.00±2.24(0.39)
NK
9.24±1.04(0.10)
1.87±0.97(0.02)
Supernatant
10.47±3.34(0.11)
8.48±2.19(0.10)
Sum of 4 activities
96.56(1.00)
82.35(1.00)
Note:The numbers in the parent heses show the activity proportion of each effector in the sum of the activities of the four effectors in T-AK cytotoxicity
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3 讨论
CD3单抗和IL-2共同激活诱生的T-AK细胞形态学上具有活化淋巴母细胞的特征，细胞表型以CD3+、CD8+淋巴细胞为主，约有20%～50%细胞为CD16+，CD56+NK样细胞，并表达IL-2R(CD25+)CD38，MHC Ⅱ类抗原(HLA-DR+)等活化T淋巴细胞的表面标志。CD3McAb主要激活T细胞，而rIL-2既可作用于T细胞，也可活化NK细胞[1，3，4]。因此，T-AK细胞具有CD3McAb激活的CD3AK细胞和rIL-2诱生的LAK细胞的某些共同生物学特性。
T-AK细胞的细胞毒活性存在异质性。本文采用分别检测的方法证实T-AK细胞杀伤靶细胞活性至少由4部分构成：以K562细胞(NK敏感细胞)为靶细胞，CD3McAb激活的CD3AK活性约占50%，rIL-2诱生的LAK活性约占30%,NK活性约为10%，可溶性抑制性因子的抑制活性约占10%；以Raji细胞(NK抵抗细胞)为靶细胞时，NK活性很低，约为2%。结合细胞表型从功能上证明T-AK细胞为异质性细胞群体，其主体为活化的T淋巴细胞和NK细胞，具有CD3AK细胞和LAK细胞的共同活性。
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作者简介：魏虎来，男，36岁，硕士，副研究员，主要从事免疫血液学和白血病生物治疗研究
4 参考文献
1 Loeffler C M,Plant J L,Anderson PM et al.Antitumor effects of interleukin-2 liposomes and anti-CD3-stimulated T-cells against murine MCA-38 hepatic metastasis.Cancer Res,1991;51:2127
2 Gallinger S,Hoskin D W,Mullen J B M et al.Comparison of cellular immunotherapies and anti-CD3 in the treatment of MCA-38-LD experimental hepatic metastases in CD57BL/6 mice.Cancer Res,1990;50:2476
, 百拇医药
3 Anderson P M,Blazer B R,Bach F H et al.Anti-CD3+IL-2 stimulated murine killer cells in vitro generation and in vivo antitumor activity.J Immunol,1989;142:1383
4 魏虎来.MTT法和LDH法检测T-AK细胞活性的研究.兰州医学院学报，1996；22(3)：9
5 魏虎来，赵怀顺，贾正平 et al.T-AK细胞上清液抑瘤活性的研究.兰州医学院学报，1996；22(4)：10
6 Mason D Y.Immunocytochemical labeling of monoclonal antibodies by the APAAP immuno-alkaine phosphatase.Tech Immunocytochem,1985;3:25
〔收稿1997-04-27 修回1998-03-20〕, http://www.100md.com
单位：兰州医学院血液病研究所，兰州 730000
关键词：T-AK细胞；细胞毒活性；异质性
中国免疫学杂志990305 中国图书分类号 R392.12 R730.51
摘 要 目的：探讨抗CD3单抗(CD3McAb)和rIL-2共同激活诱生的T-AK(T-activated killer)细胞的细胞毒活性本质。方法：采用MTT法分别检测T-AK细胞杀伤白血病细胞的活性及其构成。结果：T-AK细胞杀伤白血病细胞的活性主要由4部分组成：CD3McAb激活的CD3AK活性约占50%，rIL-2诱生的LAK细胞活性约为30%，NK活性约占10%，可溶性抑制性因子的抑制活性约为10%；细胞表型分析T-AK细胞主要表达活化T淋巴细胞和NK细胞的表面标志。结论：T-AK细胞为异质性细胞群体，其杀伤活性主体为CD3AK活性和LAK活性。
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Study on cytotoxicity of human T-activated killer cells
WEI Hu-Lai,MA Hai-Zhen，ZHAO Huai-Shun.
Institute of Hematology,Lanzhou Medical College,Lanzhou 730000
Abstract Objective：To study the essence of the cytotoxicity of T-activated killer (T-AK) cells costimulated by anti-CD3 monoclonal antibody (CD3McAb) and recombinant interleukin-2 (rIL-2).Methods：T-AK activity against leukemia cells (K562 cells and Raji cells) were determined separately in a MTT assay.Results:The cytotoxicity of T-AK cells were composed of mainly four parts:CD3 McAb-activated CD3AK activity(50%),rIL-2-induced LAK activity(30%),NK activity(10%) and the activities of inhibitory factors in T-AK supernatant(10%).The analyses of phenotypes showed that T-AK cells mainly expressed the surface makers of activated T lymphocytes and NK-like cells.Conclusion:T-AK cells are heterogeneous cell population,consisting of mainly activated T lymphocytes and NK-like cells,the main part of T-AK cytotoxicyty is CD3 AK activity and LAK activity.
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Key words T-AK cells Cytotoxicity Heterogeneity
在肿瘤过继免疫治疗中，外周淋巴细胞群依所应用的激活物质的不同而产生的杀伤活性有所不同。研究证实单独IL-2诱生的LAK细胞活性主要来源于NK细胞群，抗CD3单抗(CD3McAb)单独或合用低浓度rIL-2激活的杀伤活性(CD3AK)主要为CD3+、CD8+T淋巴细胞；而CD3McAb和高浓度rIL-2共同激活的杀伤活性(T-activated killer cells,T-AK)则既有NK细胞活性，又有活化T淋巴细胞活性[1-3]。本文在T-AK细胞形态学和免疫表型研究的基础上，探讨了从正常人外周血单个核细胞(PBMC)中制备的T-AK细胞的细胞毒活性及其构成。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 CD3McAb\,rIL-2(军事医学科学院)；MTT(Sigma)；十二烷基硫酸钠(SDS，Serva)；CD系列单抗、碱性磷酸酶桥联酶标(APAAP)试剂盒(中国医学科学院血液学研究所、北京邦定生物医学公司)。
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1.2 靶细胞 K562细胞、Raji细胞均由本所传代保存。
1.3 T-AK细胞诱生及活性分析
1.3.1 T-AK细胞 参见文献[1，4]。PBMC以2×106 ml-1接种于含CD3 McAb(1.0 μg/ml)+rIL-2(200 U/ml)的RPMI 1640完全培养液(TCM)中激活培养，并适时扩增。
1.3.2 NK细胞 PBMC接种在TCM中培养，作为测定T-AK活性中NK活性的效应细胞。
1.3.3 LAK细胞 PBMC接种于含200 U/ml rIL-2的TCM中培养，作为测定T-AK活性中LAK活性的效应细胞。
1.3.4 CD3AK细胞 PBMC接种在含CD3McAb1.0 μg/ml的TCM中培养，作为检测T-AK活性中CD3 AK活性的效应细胞。上述细胞培养72和120 h后，以K562细胞和Raji细胞为靶细胞，改良MTT法测定活性[4]。
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1.3.5 T-AK细胞上清液制备及抑瘤活性 参见文献[5]，结果以抑制率(IR)表示。
1.4 T-AK细胞免疫表型分析 采用APAAP桥联酶染色法[6]。结果以阳性细胞百分率(%)表示。
2 结果
2.1 T-AK上清液的抑瘤活性 T-AK细胞与K562细胞(20∶1)混合培养24 h的上清液，体外抑制K562细胞和Raji细胞的增殖，同时对其它肿瘤细胞亦有抑制作用[5]。
2.2 T-AK细胞活性中的CD3AK活性、LAK活性和NK活性 分别检测T-AK细胞激活培养体系中各刺激物质所诱生的杀伤活性，发现T-AK细胞活性由多种活性成分组成，其中CD3McAb激活的CD3AK活性约占50%，rIL-2活化的LAK活性约占30%；NK活性约为10%，杀瘤过程中释放的可溶性抑制性因子约为10%(表1)；但培养时间不同，靶细胞不同，各类活性所占比例有所不同(数据未列)。分别测得的各杀伤活性的总活性高于T-AK活性，可能与检测时T-AK活性中各效应细胞活性的部分重叠(如LAK和NK)、分别检测的误差等因素有关。
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2.3 T-AK细胞的免疫表型 从PBMC中诱生、扩增培养的T-AK细胞形态具有活化淋巴母细胞的特点，其免疫表型中CD3+93%，CD8+91%，CD16+22%，CD56+47%，CD25+41%，CD38+96%，HLA-DR+64%，证明T-AK细胞为表达活化T淋巴细胞和NK细胞表面标志的异质细胞群。
表1 T-AK细胞杀伤不同靶细胞的细胞毒活性成分(培养时间为120 h,E/T为20∶1，n=4,
±s)Tab.1 The components of the cytotoxicity of T-AK cells against different target cells(induced for 120 h,effector:targer=20∶1，n=4,
±s) Effectors, 百拇医药
Cytotoxicity(%)
K562
Raji
T-AK
89.86±10.04
78.13±6.67
CD3AK
48.67±2.18(0.50)
40.00±7.89(0.49)
LAK
28.18±4.87(0.29)
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32.00±2.24(0.39)
NK
9.24±1.04(0.10)
1.87±0.97(0.02)
Supernatant
10.47±3.34(0.11)
8.48±2.19(0.10)
Sum of 4 activities
96.56(1.00)
82.35(1.00)
Note:The numbers in the parent heses show the activity proportion of each effector in the sum of the activities of the four effectors in T-AK cytotoxicity
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3 讨论
CD3单抗和IL-2共同激活诱生的T-AK细胞形态学上具有活化淋巴母细胞的特征，细胞表型以CD3+、CD8+淋巴细胞为主，约有20%～50%细胞为CD16+，CD56+NK样细胞，并表达IL-2R(CD25+)CD38，MHC Ⅱ类抗原(HLA-DR+)等活化T淋巴细胞的表面标志。CD3McAb主要激活T细胞，而rIL-2既可作用于T细胞，也可活化NK细胞[1，3，4]。因此，T-AK细胞具有CD3McAb激活的CD3AK细胞和rIL-2诱生的LAK细胞的某些共同生物学特性。
T-AK细胞的细胞毒活性存在异质性。本文采用分别检测的方法证实T-AK细胞杀伤靶细胞活性至少由4部分构成：以K562细胞(NK敏感细胞)为靶细胞，CD3McAb激活的CD3AK活性约占50%，rIL-2诱生的LAK活性约占30%,NK活性约为10%，可溶性抑制性因子的抑制活性约占10%；以Raji细胞(NK抵抗细胞)为靶细胞时，NK活性很低，约为2%。结合细胞表型从功能上证明T-AK细胞为异质性细胞群体，其主体为活化的T淋巴细胞和NK细胞，具有CD3AK细胞和LAK细胞的共同活性。
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作者简介：魏虎来，男，36岁，硕士，副研究员，主要从事免疫血液学和白血病生物治疗研究
4 参考文献
1 Loeffler C M,Plant J L,Anderson PM et al.Antitumor effects of interleukin-2 liposomes and anti-CD3-stimulated T-cells against murine MCA-38 hepatic metastasis.Cancer Res,1991;51:2127
2 Gallinger S,Hoskin D W,Mullen J B M et al.Comparison of cellular immunotherapies and anti-CD3 in the treatment of MCA-38-LD experimental hepatic metastases in CD57BL/6 mice.Cancer Res,1990;50:2476
, 百拇医药
3 Anderson P M,Blazer B R,Bach F H et al.Anti-CD3+IL-2 stimulated murine killer cells in vitro generation and in vivo antitumor activity.J Immunol,1989;142:1383
4 魏虎来.MTT法和LDH法检测T-AK细胞活性的研究.兰州医学院学报，1996；22(3)：9
5 魏虎来，赵怀顺，贾正平 et al.T-AK细胞上清液抑瘤活性的研究.兰州医学院学报，1996；22(4)：10
6 Mason D Y.Immunocytochemical labeling of monoclonal antibodies by the APAAP immuno-alkaine phosphatase.Tech Immunocytochem,1985;3:25
〔收稿1997-04-27 修回1998-03-20〕, http://www.100md.com