抗皂角毒、表皮生长因子受体双功能抗体的制备与体外效应的研究
作者：张尚权 严缘昌 赵 峰 杨绍华 陈小东 何 颖
单位：中国科学院上海细胞生物学研究所，上海200031
关键词：双功能抗体；皂角毒蛋白；表皮生长因子受体
中国免疫学杂志990409 中国图书分类号 R730.53
摘 要 目的：研究制备抗皂角毒和表皮生长因子受体双功能抗体，用以导向皂角毒杀伤肿瘤细胞。方法：在制备EQ75、CY12.14单克隆抗体细胞株的基础上，通过杂交-杂交瘤技术制备双功能抗体细胞株。结果：双功能抗体(EQ75×CY12.14)与单用皂角毒杀伤肿瘤细胞(A431)的IC50分别为10-9.6、10-8.4 mol/L。结论：双功能抗体(EQ75×CY12.14)杀伤肿瘤细胞(A431)，以IC50值计算，有效率为单用皂角毒的15倍左右。
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In vitro study on cytotoxicity and the preparation of anti-Saporin/anti-EGFR bispecific antibody
ZHANG Shang-Quan, YAN Yuan-Chang, ZHAO Feng et al.Shanghai Institute of Cell Biology,Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031
Abstract Objective:To analyses and prepare the bispecific monoclonal antibody of anti-Saporin and anti-epidermal growth factor receptor(EGFR) which can enhance the effectiveness of tumor cell killing activity.Methods:On the basis of establishing the cell lins which produce monoclonal antibody against EGFR(EQ75) and Saporin (CY12.14) hybri-hybridoma technique was used to construct the cell line of bispecific monoclonal antibody against Saporin and EGFR.Results:IC50 of the bispecific monoclonal antibody and only saporin are 10-9.6 mol/L and 10-8.4mol/L respectively in tumor-killing cell (A431).Conclusion:The effectiveness measured by IC50 which bispecific antibody(EQ75×CY12.14)tumor-killing cell(A431),is about 15 times more than that of which only saporin dose.
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Key words Bispecific antibody Saporin Epidermal growth receptor
继单克隆抗体制备发展成为双功能单克隆抗体(BSAb)，迄今，已在肿瘤、感染性疾病及免疫组化、检测等方面得到广泛的应用与研究。尤其在肿瘤治疗方面，国外研究甚多，国内已有肝癌、肺癌、胃癌等单克隆抗体都已进入临床试验。EGF-R单克隆抗体也得到很多研究工作者的关注，文献表明许多肿瘤表面过度表达EGF-R，如非小细胞肺癌、肝癌、胶质瘤、鳞癌、恶性表皮癌等表面过度表达的EGF-R可达1×106[1]，而一般哺乳类动物上皮细胞含量极微，并且证明EGF-R 与编码 C-erbB-2 癌基因产物同源，EGF-R和erbB-2与肿瘤的形成密切相关。
细胞表面EGF-R与自/旁分泌异常的配体EGF/TGF-α 结合后，促进细胞的恶性增殖和细胞的转化，过量的EGF-R单抗与EGF-R结合，可有效地竞争性地阻断EGF/TGF-α与EGF-R结合从而抑制肿瘤细胞恶性发生与发展[2]。另外，人们所熟知的某类肿瘤单克隆抗体只能针对某类肿瘤细胞表面的某种抗原决定簇，因此单一的肿瘤单抗往往因为其肿瘤抗原的调变或其肿瘤表面抗原的异质性，使肿瘤单抗导向治疗效果不十分明显，而EGF-R单抗则有效地避免了肿瘤导向治疗中的这类弊端。
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1 材料与方法
1.1 CY12.14单克隆抗体的亚型鉴定 抗Saporin的单克隆抗体细胞株CY12.14(Prof.Ferrini实验室)培养至5×106细胞/0.5 ml注射BALB/C小鼠产生腹水，应用protein A Sepharose (Kit)分离CY12.14单抗，CY12.14抗体经SDS-PAGE 10%胶电泳(图略)，最后用Bio-Red公司抗体作亚型分析(Kit，catalog number 172-2055)。
1.2 CY12.14单抗的免疫印迹实验(Western blot) 将Saporin 用 SDS-PAGE 电泳样品缓冲液稀释 10 μg/ml(100℃×5 min)与 14 C- Lucin标记标准分子量分别上12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，取出电泳胶，转移至Immobilon膜(12 mA，40 min)，将印迹膜取出，切割 14 C- Lucin标准分子量膜带，以PBS 0.02%叠氮钠保存。样品膜带以TTBS(20 mmol/L Tris, pH 7.4, 0.05% Tween 20,0.14 mol/L NaCl)和2.3%脱脂奶室温振荡处理1～2 h，洗涤后样品膜带加CY12.14单抗，另外取一条样品膜带加非相关性抗体作为阴性对照，室温内振荡1 h，再经TTBS 2.3%脱脂奶洗涤4次后，分别加 125 I-兔抗鼠IgG(大约2×105cpm/ml)振荡培养1 h后洗涤干燥，在暗盒内与Immobilon-p-teflon胶片自动曝光(图1)。
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图1 CY12.14单克隆抗体与对应抗原皂角毒的免疫印迹分析
Fig.1 Immunoblot analysis of the saporin which use the monoclonal antibody(CY12/14) to detect
Note:1. 14 C-Lucin protein molecular weight marker. 2. 1 μg/ml Saporin. 3. 0.1 μg/ml Saporin. 4. 10 μg/ml Saporin. 5. 5 μg/ml Sporin. A.The immobilon straps(2,3,4) incubate with CY12.14 and add the second reagent 125 I-RAM IgG，show blot(29 kD) in film. B. The immobilon strap(5) incubate with no specific antibody and add the second reagent 125 I-RAM IgG.strap(5) shows insensible blot(29 kD) in film
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1.3 EGF-R单克隆抗体(EQ75)免疫组化分析 方法参考文献[3]。
1.4 EQ75抗肿瘤细胞株的免疫荧光测定[4] 将若
干管肿瘤细胞株A549、A431、SPC A1 (5×104/管)分别加入50 μl EQ75单抗细胞株培养上清及加入非相关性抗体作为对照组。方法参见本文1.6.1。
1.5 杂交-杂交瘤细胞株的制备[5] CY12.14经1～20 γ/ml的8-杂氮鸟嘌呤RPMI1640培养液培养筛选出HRPT 酶缺失的 CY12.14杂交瘤细胞株。将EQ75(HRPT+) 1×107杂交瘤细胞株用PBS洗涤，在1 mol/L iodoacetamide(Sigma公司) 10 ml PBS 保存(4℃)30 min，PBS洗涤，然后与5×107CY12.14(HRPT-)杂交瘤细胞株混合，用RPMI1640无血清培养液洗涤，按常规融合方法，融合细胞在37℃ CO2 孵箱内培养，48 h后用HAT RPMI1640 10%FCS选择培养基。
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1.6 二次杂交瘤(抗EGF-R×CY12.14)筛选和鉴定 筛选融合细胞的96孔板中，发现近20%孔生长有单个簇型细胞，然后将此类孔上清液分两步进行筛选。
1.6.1 将上清50 μl加入5×104A431/管中，4℃30 min，洗涤后加羊抗鼠IgG-FITC，4℃30 min，洗涤后流式细胞仪定量荧光分析(图2)。
图2 ZY16以A431为靶抗原经免疫荧光FACS分析图示
Fig.2 Immunofluorescence results of FACS of ZY16 which using A431 as the target Ag
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Note:ZY16 is assayed to appear positive rate 94% by FACS
1.6.2 另一部分上清加入预先100μl皂角毒(3 μg/ml)包被的96孔板(Boehringer,Elisa Kit)，测定OD405 nm值，选择对A431及免疫结合皂角毒素为强阳性值的孔进行单克隆化筛选4～5次 ， 筛选方法与上述相同。单克隆化后96孔阳性分布率为100%，其中一株双阳性细胞命名为ZY16。
1.7 ZY16导向杀伤靶细胞试验[6，7]培养A431细胞0.5×106 ml-1，分装于96孔板，每孔100 μl，然后加ZY16培养上清50μl/孔置冰浴中30 min，洗涤2次，阳性对照孔分别加入兔抗鼠抗体与Saporin的交联物(RAM IgG-Saporin)，按Saporin浓度计算10-7～10-11mol/L(Inland 实验室)。样品加入 Saporin 10-6
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～10-11 mol/L，冰浴30 min，置CO2孵箱37℃培养48 h，加3H亮氨酸1μCi/ 孔继续培养20 h，离心去除上清，沉淀加生理盐水洗1次，用低渗液破碎细胞，用多孔负压吸附仪，将每孔细胞吸附在纤维滤膜纸上，洗涤后同位素计数，计算双功能抗体的杀伤率。
2 结果
2.1 EQ75单抗经免疫组织化学分析(ABC法)，人的主要器官心、肝、肺、胃等正常组织为阴性，人肝癌、肺腺癌、肺鳞癌组织标本为阳性。
2.2 EQ75对表皮癌细胞系A431、肺癌细胞系A549，SPC A1、肝癌细胞系SMMC7721流式细胞分析仪(FACS)分析为阳性。
2.3 CY12.14单克隆抗体，经Protein A-Sephrose 柱纯化后，作免疫印迹实验。
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2.4 双价抗体的鉴定ZY16以A431为靶细胞，以EQ75为阳性对照，结果显示阳性(图3)。以Saporin包被96孔板，Elisa kit分析双功能抗体：OD405 nm为0.315±0.009(x±s)，非相关抗体：OD405 nm为0.106±0.014，CY12.14：OD405 nm为0.312±0.032。
2.5 ZY16体外杀伤试验 见图3。
图3 ZY16双功能抗体对靶细胞A431杀伤的比较曲线
Fig.3 Killing effect curve of bispesific antibody,ZY16 on its target-cell A431
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Note:RAM-IgG-Saporin+EQ75(indirect immunotoxin),only RAM-IgG-Saporin,Saporin,EQ75+CY12.14 and ZY16 killed tumor cells(A431) with an IC50 of 10-9.3，10-8.8，10-8.4，10-8.4，10-9.6mol/L respectively
3 讨论
本文筛选的双功能抗体的细胞株采用FACS与
ELISA两种方法同时重复筛选结果均为阳性，但是实验中均为阳性的细胞株也不一定为双专一性单克隆抗体，因为细胞融合后，异源染色体的V和C基因重组，杂交细胞随机合成两个亲本的肽链组合成完整的抗体分子，可同时表达两个亲本株的信息，按特异性信息可分为无活性、单特异性和双特异性3类，然而单特异性双价抗体的杂交细胞株经FACS与ELISA分析同样为双价阳性结果，但无增强皂角毒蛋白的细胞毒效应，所以双特异性抗体既具有V区双阳性又能携带皂角毒蛋白，比单用皂角毒蛋白，更为有效地杀伤靶细胞。
, 百拇医药
实验结果中的ZY16免疫毒素IC50值略低于间接免疫毒素(兔抗鼠IgG-Saporin+EQ75)，如果改变分离ZY16抗体的条件，可能有效地提高ZY16对靶细胞杀伤率。本实验由于分离纯化BSAb的条件限制，只运用protein A-sephaose分离，显然BSAb纯度低，根据国外经典分离BSAb的方法，将BSAb鼠腹水经protein A-sepharose分离后，再经HCA-HPLC纯化，可获得高比活的双专一性单价抗体，从而提高BSAb的细胞毒效应。
抗皂角毒、表皮生长因子受体双功能抗体的制备与体外效应的研究 中国科学院留学经费择优支持并得到意大利国立癌症研究中心Prof. Silvano Ferrini 的帮助
陈小东 上海医科大学附属中山医院肺科，上海200032
, 百拇医药 作者简介：张尚权，男，49岁，助理研究员，主要从事肿瘤生物治疗研究工作；
严缘昌，男，57岁，教授，主要从事细胞生物学研究工作
4 参考文献
[1] Hendler F J, Ozanne B W. Human squamous cell lung cancers express increased epidermal growth factor receptor. J Clin Invest, 1984;74(2): 647
[2] Noa B B, Yosef Y. Neu differentiation factors: a family of alternatively spliced neuronal and mesenchymal factors. Proc Soci Experi Bio & Med, 1994;206(3):221
, 百拇医药
[3] 孙亚平，张尚权，赵 峰 et al. 表皮生长因子受体(EGF-R)在大鼠和小鼠睾丸中的表达和分布.生殖与避孕，1997；17 (2)：209
[4] Ferrini S, Prigione I, Mammoliti S et al. Re-targeting of human lymphocytes expressing the T-cell receptor gamma/delta to ovarian carcinoma cells by the use of bispecific monoclonal antibodies. Int J Cancer,1989;44:245
[5] Ferrini S,Cambiaggi A,Sforzini S et al. Targeting of T lymphocytes against EGF-receptor+tumor cells by bispecific monoclonal antibodies: requirement of CD3 molecule cross-linking for T-cell activation. Int J Cancer, 1993; 55: 931
, 百拇医药
[6] Clark M R,Waldmann H. Killing of target cells induced by hybird antibodies: comparison of two bispecific monoclonal antibodies.J Natl Cancer Inst, 1987; 79(6): 1393
[7] Glennie M J, Brennand D M, Bryden F et al. Bispecific F (AB'r)2 antibody for the delivery of saporin in the treatment of lymphoma. J Immunol, 1988; 141(10): 3662
〔收稿1997-11-10 二次修回1998-11-20〕, 百拇医药
单位：中国科学院上海细胞生物学研究所，上海200031
关键词：双功能抗体；皂角毒蛋白；表皮生长因子受体
中国免疫学杂志990409 中国图书分类号 R730.53
摘 要 目的：研究制备抗皂角毒和表皮生长因子受体双功能抗体，用以导向皂角毒杀伤肿瘤细胞。方法：在制备EQ75、CY12.14单克隆抗体细胞株的基础上，通过杂交-杂交瘤技术制备双功能抗体细胞株。结果：双功能抗体(EQ75×CY12.14)与单用皂角毒杀伤肿瘤细胞(A431)的IC50分别为10-9.6、10-8.4 mol/L。结论：双功能抗体(EQ75×CY12.14)杀伤肿瘤细胞(A431)，以IC50值计算，有效率为单用皂角毒的15倍左右。
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In vitro study on cytotoxicity and the preparation of anti-Saporin/anti-EGFR bispecific antibody
ZHANG Shang-Quan, YAN Yuan-Chang, ZHAO Feng et al.Shanghai Institute of Cell Biology,Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031
Abstract Objective:To analyses and prepare the bispecific monoclonal antibody of anti-Saporin and anti-epidermal growth factor receptor(EGFR) which can enhance the effectiveness of tumor cell killing activity.Methods:On the basis of establishing the cell lins which produce monoclonal antibody against EGFR(EQ75) and Saporin (CY12.14) hybri-hybridoma technique was used to construct the cell line of bispecific monoclonal antibody against Saporin and EGFR.Results:IC50 of the bispecific monoclonal antibody and only saporin are 10-9.6 mol/L and 10-8.4mol/L respectively in tumor-killing cell (A431).Conclusion:The effectiveness measured by IC50 which bispecific antibody(EQ75×CY12.14)tumor-killing cell(A431),is about 15 times more than that of which only saporin dose.
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Key words Bispecific antibody Saporin Epidermal growth receptor
继单克隆抗体制备发展成为双功能单克隆抗体(BSAb)，迄今，已在肿瘤、感染性疾病及免疫组化、检测等方面得到广泛的应用与研究。尤其在肿瘤治疗方面，国外研究甚多，国内已有肝癌、肺癌、胃癌等单克隆抗体都已进入临床试验。EGF-R单克隆抗体也得到很多研究工作者的关注，文献表明许多肿瘤表面过度表达EGF-R，如非小细胞肺癌、肝癌、胶质瘤、鳞癌、恶性表皮癌等表面过度表达的EGF-R可达1×106[1]，而一般哺乳类动物上皮细胞含量极微，并且证明EGF-R 与编码 C-erbB-2 癌基因产物同源，EGF-R和erbB-2与肿瘤的形成密切相关。
细胞表面EGF-R与自/旁分泌异常的配体EGF/TGF-α 结合后，促进细胞的恶性增殖和细胞的转化，过量的EGF-R单抗与EGF-R结合，可有效地竞争性地阻断EGF/TGF-α与EGF-R结合从而抑制肿瘤细胞恶性发生与发展[2]。另外，人们所熟知的某类肿瘤单克隆抗体只能针对某类肿瘤细胞表面的某种抗原决定簇，因此单一的肿瘤单抗往往因为其肿瘤抗原的调变或其肿瘤表面抗原的异质性，使肿瘤单抗导向治疗效果不十分明显，而EGF-R单抗则有效地避免了肿瘤导向治疗中的这类弊端。
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1 材料与方法
1.1 CY12.14单克隆抗体的亚型鉴定 抗Saporin的单克隆抗体细胞株CY12.14(Prof.Ferrini实验室)培养至5×106细胞/0.5 ml注射BALB/C小鼠产生腹水，应用protein A Sepharose (Kit)分离CY12.14单抗，CY12.14抗体经SDS-PAGE 10%胶电泳(图略)，最后用Bio-Red公司抗体作亚型分析(Kit，catalog number 172-2055)。
1.2 CY12.14单抗的免疫印迹实验(Western blot) 将Saporin 用 SDS-PAGE 电泳样品缓冲液稀释 10 μg/ml(100℃×5 min)与 14 C- Lucin标记标准分子量分别上12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，取出电泳胶，转移至Immobilon膜(12 mA，40 min)，将印迹膜取出，切割 14 C- Lucin标准分子量膜带，以PBS 0.02%叠氮钠保存。样品膜带以TTBS(20 mmol/L Tris, pH 7.4, 0.05% Tween 20,0.14 mol/L NaCl)和2.3%脱脂奶室温振荡处理1～2 h，洗涤后样品膜带加CY12.14单抗，另外取一条样品膜带加非相关性抗体作为阴性对照，室温内振荡1 h，再经TTBS 2.3%脱脂奶洗涤4次后，分别加 125 I-兔抗鼠IgG(大约2×105cpm/ml)振荡培养1 h后洗涤干燥，在暗盒内与Immobilon-p-teflon胶片自动曝光(图1)。
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图1 CY12.14单克隆抗体与对应抗原皂角毒的免疫印迹分析
Fig.1 Immunoblot analysis of the saporin which use the monoclonal antibody(CY12/14) to detect
Note:1. 14 C-Lucin protein molecular weight marker. 2. 1 μg/ml Saporin. 3. 0.1 μg/ml Saporin. 4. 10 μg/ml Saporin. 5. 5 μg/ml Sporin. A.The immobilon straps(2,3,4) incubate with CY12.14 and add the second reagent 125 I-RAM IgG，show blot(29 kD) in film. B. The immobilon strap(5) incubate with no specific antibody and add the second reagent 125 I-RAM IgG.strap(5) shows insensible blot(29 kD) in film
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1.3 EGF-R单克隆抗体(EQ75)免疫组化分析 方法参考文献[3]。
1.4 EQ75抗肿瘤细胞株的免疫荧光测定[4] 将若
干管肿瘤细胞株A549、A431、SPC A1 (5×104/管)分别加入50 μl EQ75单抗细胞株培养上清及加入非相关性抗体作为对照组。方法参见本文1.6.1。
1.5 杂交-杂交瘤细胞株的制备[5] CY12.14经1～20 γ/ml的8-杂氮鸟嘌呤RPMI1640培养液培养筛选出HRPT 酶缺失的 CY12.14杂交瘤细胞株。将EQ75(HRPT+) 1×107杂交瘤细胞株用PBS洗涤，在1 mol/L iodoacetamide(Sigma公司) 10 ml PBS 保存(4℃)30 min，PBS洗涤，然后与5×107CY12.14(HRPT-)杂交瘤细胞株混合，用RPMI1640无血清培养液洗涤，按常规融合方法，融合细胞在37℃ CO2 孵箱内培养，48 h后用HAT RPMI1640 10%FCS选择培养基。
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1.6 二次杂交瘤(抗EGF-R×CY12.14)筛选和鉴定 筛选融合细胞的96孔板中，发现近20%孔生长有单个簇型细胞，然后将此类孔上清液分两步进行筛选。
1.6.1 将上清50 μl加入5×104A431/管中，4℃30 min，洗涤后加羊抗鼠IgG-FITC，4℃30 min，洗涤后流式细胞仪定量荧光分析(图2)。
图2 ZY16以A431为靶抗原经免疫荧光FACS分析图示
Fig.2 Immunofluorescence results of FACS of ZY16 which using A431 as the target Ag
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Note:ZY16 is assayed to appear positive rate 94% by FACS
1.6.2 另一部分上清加入预先100μl皂角毒(3 μg/ml)包被的96孔板(Boehringer,Elisa Kit)，测定OD405 nm值，选择对A431及免疫结合皂角毒素为强阳性值的孔进行单克隆化筛选4～5次 ， 筛选方法与上述相同。单克隆化后96孔阳性分布率为100%，其中一株双阳性细胞命名为ZY16。
1.7 ZY16导向杀伤靶细胞试验[6，7]培养A431细胞0.5×106 ml-1，分装于96孔板，每孔100 μl，然后加ZY16培养上清50μl/孔置冰浴中30 min，洗涤2次，阳性对照孔分别加入兔抗鼠抗体与Saporin的交联物(RAM IgG-Saporin)，按Saporin浓度计算10-7～10-11mol/L(Inland 实验室)。样品加入 Saporin 10-6
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～10-11 mol/L，冰浴30 min，置CO2孵箱37℃培养48 h，加3H亮氨酸1μCi/ 孔继续培养20 h，离心去除上清，沉淀加生理盐水洗1次，用低渗液破碎细胞，用多孔负压吸附仪，将每孔细胞吸附在纤维滤膜纸上，洗涤后同位素计数，计算双功能抗体的杀伤率。
2 结果
2.1 EQ75单抗经免疫组织化学分析(ABC法)，人的主要器官心、肝、肺、胃等正常组织为阴性，人肝癌、肺腺癌、肺鳞癌组织标本为阳性。
2.2 EQ75对表皮癌细胞系A431、肺癌细胞系A549，SPC A1、肝癌细胞系SMMC7721流式细胞分析仪(FACS)分析为阳性。
2.3 CY12.14单克隆抗体，经Protein A-Sephrose 柱纯化后，作免疫印迹实验。
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2.4 双价抗体的鉴定ZY16以A431为靶细胞，以EQ75为阳性对照，结果显示阳性(图3)。以Saporin包被96孔板，Elisa kit分析双功能抗体：OD405 nm为0.315±0.009(x±s)，非相关抗体：OD405 nm为0.106±0.014，CY12.14：OD405 nm为0.312±0.032。
2.5 ZY16体外杀伤试验 见图3。
图3 ZY16双功能抗体对靶细胞A431杀伤的比较曲线
Fig.3 Killing effect curve of bispesific antibody,ZY16 on its target-cell A431
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Note:RAM-IgG-Saporin+EQ75(indirect immunotoxin),only RAM-IgG-Saporin,Saporin,EQ75+CY12.14 and ZY16 killed tumor cells(A431) with an IC50 of 10-9.3，10-8.8，10-8.4，10-8.4，10-9.6mol/L respectively
3 讨论
本文筛选的双功能抗体的细胞株采用FACS与
ELISA两种方法同时重复筛选结果均为阳性，但是实验中均为阳性的细胞株也不一定为双专一性单克隆抗体，因为细胞融合后，异源染色体的V和C基因重组，杂交细胞随机合成两个亲本的肽链组合成完整的抗体分子，可同时表达两个亲本株的信息，按特异性信息可分为无活性、单特异性和双特异性3类，然而单特异性双价抗体的杂交细胞株经FACS与ELISA分析同样为双价阳性结果，但无增强皂角毒蛋白的细胞毒效应，所以双特异性抗体既具有V区双阳性又能携带皂角毒蛋白，比单用皂角毒蛋白，更为有效地杀伤靶细胞。
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实验结果中的ZY16免疫毒素IC50值略低于间接免疫毒素(兔抗鼠IgG-Saporin+EQ75)，如果改变分离ZY16抗体的条件，可能有效地提高ZY16对靶细胞杀伤率。本实验由于分离纯化BSAb的条件限制，只运用protein A-sephaose分离，显然BSAb纯度低，根据国外经典分离BSAb的方法，将BSAb鼠腹水经protein A-sepharose分离后，再经HCA-HPLC纯化，可获得高比活的双专一性单价抗体，从而提高BSAb的细胞毒效应。
抗皂角毒、表皮生长因子受体双功能抗体的制备与体外效应的研究 中国科学院留学经费择优支持并得到意大利国立癌症研究中心Prof. Silvano Ferrini 的帮助
陈小东 上海医科大学附属中山医院肺科，上海200032
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严缘昌，男，57岁，教授，主要从事细胞生物学研究工作
4 参考文献
[1] Hendler F J, Ozanne B W. Human squamous cell lung cancers express increased epidermal growth factor receptor. J Clin Invest, 1984;74(2): 647
[2] Noa B B, Yosef Y. Neu differentiation factors: a family of alternatively spliced neuronal and mesenchymal factors. Proc Soci Experi Bio & Med, 1994;206(3):221
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[3] 孙亚平，张尚权，赵 峰 et al. 表皮生长因子受体(EGF-R)在大鼠和小鼠睾丸中的表达和分布.生殖与避孕，1997；17 (2)：209
[4] Ferrini S, Prigione I, Mammoliti S et al. Re-targeting of human lymphocytes expressing the T-cell receptor gamma/delta to ovarian carcinoma cells by the use of bispecific monoclonal antibodies. Int J Cancer,1989;44:245
[5] Ferrini S,Cambiaggi A,Sforzini S et al. Targeting of T lymphocytes against EGF-receptor+tumor cells by bispecific monoclonal antibodies: requirement of CD3 molecule cross-linking for T-cell activation. Int J Cancer, 1993; 55: 931
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[6] Clark M R,Waldmann H. Killing of target cells induced by hybird antibodies: comparison of two bispecific monoclonal antibodies.J Natl Cancer Inst, 1987; 79(6): 1393
[7] Glennie M J, Brennand D M, Bryden F et al. Bispecific F (AB'r)2 antibody for the delivery of saporin in the treatment of lymphoma. J Immunol, 1988; 141(10): 3662
〔收稿1997-11-10 二次修回1998-11-20〕, 百拇医药