基因重组丁型肝炎病毒抗原的制备与检测
作者：张亚冰 杨小昂 高 峰
单位：河南省医学科学研究所，郑州540052
关键词：
中国免疫学杂志990417 中国图书分类号 R446.6
丁型肝炎病毒是一种缺陷性RNA病毒，其感染发病需在乙型肝炎病毒(HBV)存在时才能发生[1]，这种重叠性感染通常导致暴发性肝炎、进行性慢性活动性肝炎及肝硬化[2]。采用HDV感染实验动物，提取HDV抗原制备诊断HDV试剂盒[3，4]，方法复杂，周期长，实验动物进口不便。为解决HDVAg的来源，我们构建了表达HDV的大肠杆菌工程菌株。
1 材料与方法
1.1 HDV基因重组及表达质粒的构建 按文献[5]进行。
, 百拇医药
1.2 HDV重组抗原的制备 挑取工程菌株单斑接种LB培养液中(含Ampicillin 100 μg/ml)，37℃震荡培养过夜。次日1∶50稀释后继续培养8 h，使OD到0.4～0.8左右，加入浓度为0.1 mol/L的IPTG，诱导6 h。收集细菌，重悬于原体积1/10的pH 7.4 PBS中，加溶菌酶处理(浓度为1 mg/ml)4℃，40 min后离心，沉淀用8 mol/L尿素裂解。超声破碎3次，20 s/次，获得重组HDV抗原。
1.3 试剂与血清标本 HDV诊断试剂盒购自河南瑞安公司。血清标本为经爱尔兰Noctech试剂确认的抗-HDV阴、阳性血清各6份。
2 结果
2.1 重组抗原的表达结果 将表达产物HDV粗提后经SDS-PAGE电泳，结果表明菌株3 ED和12 E在24 kD和29 kD处可见明显表达蛋白带，其分子量与预期值一致。
, 百拇医药
2.2 重组抗原的抗原性 表达蛋白SDS-PAGE后转移到硝酸纤维膜上，进行Western blot试验，结果表明两种表达蛋白均能与1号阳性血清起特异性反应。
为了进一步了解重组抗原的灵敏度，用重组抗原包被酶联板，分别加入不同稀释度的抗-HDV阳性血清，结果显示灵敏度为1:150 0，说明该抗原具有良好的特异性和灵敏度。
2.3 重组抗原的稳定性与初步应用 用重组抗原制备ELISA HDV诊断试剂盒，分别4℃存放4个月，OD值无差异，37℃存放7 d，OD值无明显变化，证明重组抗原的稳定性好。以重组抗原包被反应板，用ELISA间接法检测标化血清11份，结果与Noctech试剂相符。
3 讨论
表达产物基因重组HDV抗原，经SDS-PAGE电泳和Western blot分析，小抗原分子量为24 kD，大抗原分子量为29 kD，与理论设计一致[6]。通过免疫印迹反应和免疫酶联反应证明表达产物具有丁型肝炎病毒抗原活性，与抗-HDV阳性血清特异性结合。我们用重组抗原制备的ELISA诊断试剂盒与土拨鼠完全抗原制备的同类试剂比较，二者具有一致性。重组抗原在诊断HDV感染中具有良好的应用前景。
, http://www.100md.com
作者简介：张亚冰，女，43岁，副研究员，从事病毒性肝炎研究；
杨小昂，男，35岁，硕士，副研究员，从事病毒性肝炎研究
4 参考文献
[1] Rizzetto M,Canese M G, Gerin J L et al. Transmission of hepatitis B virus-associated delta antigen to chimpanzees.J Infect Dis，1980；141：590
[2] Craxi A, Raimondo G, Longo G et al .Delta agent infection in acute and chronic HBsAg carriers with and without liver disease.Gut,1984；25:1288
, 百拇医药
[3] 金志宏,杨 波,杨小昂 et al.丁型肝炎病毒感染东方土拨鼠的研究.病毒学报,1990;6(1):74
[4] 张亚冰,金志宏,职慧军 et al.丁型肝炎抗体诊断试剂的研制.河南医科大学学报，1992；27(2):129
[5] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T et al著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京：北京科学出版社，1996:822-826
[6] Hwang S B,Lee C Z, Lai M M et al .Hepatitis delta antigen expressed by recombinant baculoviruses: comparison of biochemical properties and post-translational modifications between the large and small forms. Virology，1992；190(1):413
〔收稿1998-05-11 修回1998-09-14〕, 百拇医药
单位：河南省医学科学研究所，郑州540052
关键词：
中国免疫学杂志990417 中国图书分类号 R446.6
丁型肝炎病毒是一种缺陷性RNA病毒，其感染发病需在乙型肝炎病毒(HBV)存在时才能发生[1]，这种重叠性感染通常导致暴发性肝炎、进行性慢性活动性肝炎及肝硬化[2]。采用HDV感染实验动物，提取HDV抗原制备诊断HDV试剂盒[3，4]，方法复杂，周期长，实验动物进口不便。为解决HDVAg的来源，我们构建了表达HDV的大肠杆菌工程菌株。
1 材料与方法
1.1 HDV基因重组及表达质粒的构建 按文献[5]进行。
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1.2 HDV重组抗原的制备 挑取工程菌株单斑接种LB培养液中(含Ampicillin 100 μg/ml)，37℃震荡培养过夜。次日1∶50稀释后继续培养8 h，使OD到0.4～0.8左右，加入浓度为0.1 mol/L的IPTG，诱导6 h。收集细菌，重悬于原体积1/10的pH 7.4 PBS中，加溶菌酶处理(浓度为1 mg/ml)4℃，40 min后离心，沉淀用8 mol/L尿素裂解。超声破碎3次，20 s/次，获得重组HDV抗原。
1.3 试剂与血清标本 HDV诊断试剂盒购自河南瑞安公司。血清标本为经爱尔兰Noctech试剂确认的抗-HDV阴、阳性血清各6份。
2 结果
2.1 重组抗原的表达结果 将表达产物HDV粗提后经SDS-PAGE电泳，结果表明菌株3 ED和12 E在24 kD和29 kD处可见明显表达蛋白带，其分子量与预期值一致。
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2.2 重组抗原的抗原性 表达蛋白SDS-PAGE后转移到硝酸纤维膜上，进行Western blot试验，结果表明两种表达蛋白均能与1号阳性血清起特异性反应。
为了进一步了解重组抗原的灵敏度，用重组抗原包被酶联板，分别加入不同稀释度的抗-HDV阳性血清，结果显示灵敏度为1:150 0，说明该抗原具有良好的特异性和灵敏度。
2.3 重组抗原的稳定性与初步应用 用重组抗原制备ELISA HDV诊断试剂盒，分别4℃存放4个月，OD值无差异，37℃存放7 d，OD值无明显变化，证明重组抗原的稳定性好。以重组抗原包被反应板，用ELISA间接法检测标化血清11份，结果与Noctech试剂相符。
3 讨论
表达产物基因重组HDV抗原，经SDS-PAGE电泳和Western blot分析，小抗原分子量为24 kD，大抗原分子量为29 kD，与理论设计一致[6]。通过免疫印迹反应和免疫酶联反应证明表达产物具有丁型肝炎病毒抗原活性，与抗-HDV阳性血清特异性结合。我们用重组抗原制备的ELISA诊断试剂盒与土拨鼠完全抗原制备的同类试剂比较，二者具有一致性。重组抗原在诊断HDV感染中具有良好的应用前景。
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作者简介：张亚冰，女，43岁，副研究员，从事病毒性肝炎研究；
杨小昂，男，35岁，硕士，副研究员，从事病毒性肝炎研究
4 参考文献
[1] Rizzetto M,Canese M G, Gerin J L et al. Transmission of hepatitis B virus-associated delta antigen to chimpanzees.J Infect Dis，1980；141：590
[2] Craxi A, Raimondo G, Longo G et al .Delta agent infection in acute and chronic HBsAg carriers with and without liver disease.Gut,1984；25:1288
, 百拇医药
[3] 金志宏,杨 波,杨小昂 et al.丁型肝炎病毒感染东方土拨鼠的研究.病毒学报,1990;6(1):74
[4] 张亚冰,金志宏,职慧军 et al.丁型肝炎抗体诊断试剂的研制.河南医科大学学报，1992；27(2):129
[5] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T et al著.金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京：北京科学出版社，1996:822-826
[6] Hwang S B,Lee C Z, Lai M M et al .Hepatitis delta antigen expressed by recombinant baculoviruses: comparison of biochemical properties and post-translational modifications between the large and small forms. Virology，1992；190(1):413
〔收稿1998-05-11 修回1998-09-14〕, 百拇医药