酶标法检测基因工程干扰素半成品中残余宿主菌蛋白含量
作者：石晓丽 刘景会 王东倩 万 里 姚为民 张雪梅 刘 畅 盛 君
单位：卫生部长春生物制品研究所分子生物研究室，长春130062
关键词：
中国免疫学杂志990416 中国图书分类号 R392.11
基因工程干扰素是一类具有抗病素、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子，被广泛地应用于临床治疗中。根据《中国生物制品规程》基因工程干扰素半成品中残余宿主菌蛋白含量小于总蛋白量的2的要求，我们建立了酶标法用于该项目的检定[1，2]。
1 材料与方法
1.1 包被抗体(羊抗宿主菌蛋白IgG血清)和夹层抗体(兔抗宿主菌蛋白IgG血清) 由本室制备[3]。
, 百拇医药
1.2 酶标抗体(羊抗兔) 辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗兔IgG，购于华美生物工程公司。
1.3 宿主菌蛋白标准 本室制备的大肠菌JM103可溶性蛋白。
1.4 测定方法 采用双夹心酶标法。
2 结果
2.1 线性工作曲线的确定 在实验过程中，我们发现抗原抗体反应在37℃，40 min比较合适，如图1所示，标准蛋白在10～50 ng/ml之间与其OD值呈良好线性关系(F检验，P<0.01)。从而保证了检测结果的可靠性和重复性。
图1 不同浓度宿主菌可溶性蛋白OD值曲线
Fig.1 Curve of OD values of different concentrations of E.coli proteins
, 百拇医药
2.2 rIFN-α2b半成品中残余宿主菌蛋白含量的测取rIFN-α2b 3批半成品9605、9606和9607均稀释为蛋白含量为100μg/ml，按照《中国生物制品规程》要求rIFN-α2b半成品中残余宿主菌蛋白含量小于总蛋白量的2。即上述3批半成品每剂量(10 μg/ml)残余宿主菌蛋白含量要小于20ng/ml，测定结果分别为11.5、16.3、14.2ng/ml，均符合要求。
2.3 准确性试验 在同一次测定中，我们将样品9606稀释成4个稀释浓度(5、10、15、20 μg/ml)，进行测定，各稀释度测得CV值均小于8.00%，说明本方法准确性好。
2.4 重复性试验 取9606批半成品不同时间对其残余宿主菌蛋白测定10次，CV值为3.25%，说明本方法重复性较好。
2.5 灵敏度试验 将宿主菌蛋白标准作一系列稀释至0.15ng再进行测定。蛋白含量在1ng/ml时OD值仍可达0.30。至1ng/ml以下，误差较大。
, http://www.100md.com
3 讨论
本实验采用常规的双夹心酶标法，实验步骤及注意事项均按酶标试验要求做，试验中值得注意的是宿主菌蛋白标准必须全部是可溶性的，否则测定结果就会偏大，造成不必要的损失。
总之，本方法是一种简便、快速、灵敏度高、特异性强的检定方法，同样适用于其它的基因工程产品的此项检定项目，从而保证了我们的基因工程产品的质量。
致谢：本实验承蒙郭凤云老师，潘荆华老师的指导和帮助，在此表示感谢。
作者简介：石晓丽，女，32岁，助理研究员，主要从事干扰素应用研究；
盛 君，男，36岁，研究员，硕士生导师，主要从事分子生物学研究定结果
4 参考文献
[1] 庄晨杰，吴 昊，童葵塘. 酶联免疫分析法测定人αl型基因工程干扰素成品中的干扰素蛋白含量. 病毒学报，1995；11(2)：180
[2] 张振龙，高梦玲，陈晓龙 et al. 检测α肿瘤坏死因子ELISA方法的建立及初步应用. 中国生物制品学杂志，1996；9(3)：136
[3] 高天祥. 临床免疫与实验技术.济南：山东科学技术出版社，1984：408-418
〔收稿1998-01-19 修回1998-03-20〕, http://www.100md.com
单位：卫生部长春生物制品研究所分子生物研究室，长春130062
关键词：
中国免疫学杂志990416 中国图书分类号 R392.11
基因工程干扰素是一类具有抗病素、抗肿瘤和免疫调节作用的细胞因子，被广泛地应用于临床治疗中。根据《中国生物制品规程》基因工程干扰素半成品中残余宿主菌蛋白含量小于总蛋白量的2的要求，我们建立了酶标法用于该项目的检定[1，2]。
1 材料与方法
1.1 包被抗体(羊抗宿主菌蛋白IgG血清)和夹层抗体(兔抗宿主菌蛋白IgG血清) 由本室制备[3]。
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1.2 酶标抗体(羊抗兔) 辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗兔IgG，购于华美生物工程公司。
1.3 宿主菌蛋白标准 本室制备的大肠菌JM103可溶性蛋白。
1.4 测定方法 采用双夹心酶标法。
2 结果
2.1 线性工作曲线的确定 在实验过程中，我们发现抗原抗体反应在37℃，40 min比较合适，如图1所示，标准蛋白在10～50 ng/ml之间与其OD值呈良好线性关系(F检验，P<0.01)。从而保证了检测结果的可靠性和重复性。
图1 不同浓度宿主菌可溶性蛋白OD值曲线
Fig.1 Curve of OD values of different concentrations of E.coli proteins
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2.2 rIFN-α2b半成品中残余宿主菌蛋白含量的测取rIFN-α2b 3批半成品9605、9606和9607均稀释为蛋白含量为100μg/ml，按照《中国生物制品规程》要求rIFN-α2b半成品中残余宿主菌蛋白含量小于总蛋白量的2。即上述3批半成品每剂量(10 μg/ml)残余宿主菌蛋白含量要小于20ng/ml，测定结果分别为11.5、16.3、14.2ng/ml，均符合要求。
2.3 准确性试验 在同一次测定中，我们将样品9606稀释成4个稀释浓度(5、10、15、20 μg/ml)，进行测定，各稀释度测得CV值均小于8.00%，说明本方法准确性好。
2.4 重复性试验 取9606批半成品不同时间对其残余宿主菌蛋白测定10次，CV值为3.25%，说明本方法重复性较好。
2.5 灵敏度试验 将宿主菌蛋白标准作一系列稀释至0.15ng再进行测定。蛋白含量在1ng/ml时OD值仍可达0.30。至1ng/ml以下，误差较大。
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3 讨论
本实验采用常规的双夹心酶标法，实验步骤及注意事项均按酶标试验要求做，试验中值得注意的是宿主菌蛋白标准必须全部是可溶性的，否则测定结果就会偏大，造成不必要的损失。
总之，本方法是一种简便、快速、灵敏度高、特异性强的检定方法，同样适用于其它的基因工程产品的此项检定项目，从而保证了我们的基因工程产品的质量。
致谢：本实验承蒙郭凤云老师，潘荆华老师的指导和帮助，在此表示感谢。
作者简介：石晓丽，女，32岁，助理研究员，主要从事干扰素应用研究；
盛 君，男，36岁，研究员，硕士生导师，主要从事分子生物学研究定结果
4 参考文献
[1] 庄晨杰，吴 昊，童葵塘. 酶联免疫分析法测定人αl型基因工程干扰素成品中的干扰素蛋白含量. 病毒学报，1995；11(2)：180
[2] 张振龙，高梦玲，陈晓龙 et al. 检测α肿瘤坏死因子ELISA方法的建立及初步应用. 中国生物制品学杂志，1996；9(3)：136
[3] 高天祥. 临床免疫与实验技术.济南：山东科学技术出版社，1984：408-418
〔收稿1998-01-19 修回1998-03-20〕, http://www.100md.com