细胞增殖法检测单核/巨噬细胞ADCC效应方法的建立
作者：黄 瑾 马忠森 林树青 王荣有
单位：黄 瑾 马忠森 林树青 (白求恩医科大学第二临床学院呼吸内科，长春130041)；王荣有 (白求恩医科大学第二临床学院胸外科，长春130041)
关键词：单核/巨噬细胞；ADCC；细胞增殖
中国免疫学杂志990412 中国图书分类号 R392-33
摘 要 目的：为了建立一种供临床实验室广泛应用的检测单核/巨噬细胞ADCC效应的实验方法。方法：选择CTLL2细胞作为靶细胞，制备出兔抗CTLL2细胞特异性抗血清，用单核细胞作为效应细胞，通过CTLL2细胞增殖结果检测单核细胞ADCC效应，并与传统检测方法125I-UdR释放试验进行比较。结果：该方法较同位素试验方法更敏感。结论：细胞增殖法检测单核细胞ADCC效应准确、可靠。
, 百拇医药
Creation of the method of cell proliferation for detecting the ADCC effect of monocyte/macrophage
HUANG Jin,MA Zhong-Sen,LIN Shu-Qing et al. The Second Clinical College of Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130041
Abstract Objective:To create a method of detecting the ADCC effect of monocyte/macrophage in clinical laboratory.Methods:CTLL2 cells was selected as target cells to prepare the specific antiserum of rabbit.Monocytes act as effect cells.The ADCC effect of monocyte was detected by observing the proliferation of CTLL2 cells.This new method was also compared with the traditional method of 125 I-UdR releasing test.Results:The method of cell proliferation is more sensitive than that of isotope releasing test.Conclusion:Using cell proliferation method to detect the ADCC effect of monocyte is stable and accurate.
, 百拇医药
Key words Monocyte/macrophage ADCC Cell proliferation
单核/巨噬细胞ADCC效应是重要免疫学功能之一，在抗感染、抗肿瘤及抗寄生虫等方面均具有重要作用，与许多疾病的发生和发展密切相关[1-5]。传统方法多用同位素释放法检测单核/巨噬细胞ADCC效应，因同位素半衰期短不易保存且易污染等缺点，限制其临床的应用研究，因此本实验建立了细胞增殖法用于检测单核/巨噬细胞ADCC效应。
1 材料与方法
1.1 细胞株、试剂与动物 CTLL2细胞由本实验室长期传代培养；rhIL-2为卫生部长春生物制品所产品；酶标羊抗兔IgG为北京军科院产品；125I-UDR为北京原子能研究所产品；CBWR/B兔为本校动物中心提供。单核细胞取自健康人外周血。兔抗CTLL2细胞抗血清由本室制备。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 兔抗CTLL2细胞抗血清制备方法 参照文献[6]。
1.2.2 免疫兔血清抗体特异性测定 将CTLL2细胞固定，分3管，浓度为1×106 ml-1，分别加入免疫兔血清(工作效价为1∶20)、正常兔血清对照及空白对照，最后加酶标羊抗兔IgG，用含有OPD的磷酸、柠檬酸缓冲液显色，用酶标仪测OD490 nm值。
1.2.3 效应细胞的制备 无菌取人静脉血提取PBMC，调细胞浓度为1×106 ml-1，取1 ml倾入直径35 mm塑料细胞培养平皿内，37℃CO2孵箱中静置90 min，洗去非贴壁细胞，贴壁细胞为单核细胞，贴壁前后分别计数PBMC数，差值为单核细胞数。
, 百拇医药 1.2.4 实验分组及结果测定 ①单核细胞ADCC效应实验组：内有单核细胞、CTLL2细胞和免疫兔血清，效/靶细胞数比值为2∶1，血清工作效价为1∶5 000。②单核细胞非特异杀伤对照组：内有单核细胞和CTLL2细胞，效/靶细胞数比值为2∶1。③抗血清非特异毒性对照组：内有免疫兔血清和CTLL2细胞血清工作效价为1∶5 000，细胞浓度为1.6×104 ml-1。④CTLL2细胞增殖标准对照组：只有CTLL2细胞，其浓度分别为0.2×104、0.4×104、0.8×104、1.6×104 ml-1。上述各组均加入rhIL-2 100 U/ml，37℃CO2箱中培养72 h，将培养皿内细胞悬液移入试管中离心吸去部分上清，混匀管内细胞悬液移至40孔酶标反应板中，用改良的MTT比色法测定结果[7]。
1.2.5 实验结果计算 CTLL2细胞增殖标准对照组细胞增殖数按直线回归方程式计算，确定OD值与细胞数的相关性。单核细胞ADCC效应组CTLL2细胞数按下述公式计算：ODADCC＝ODt-(ODc-ODs)-(ODc-ODm)＝ODt-(2ODc-ODs-ODm)。ODADCC：单核细胞ADCC效应组实际OD值；ODt：单核细胞ADCC效应组测得OD值；ODc：CTLL2细胞增殖标准对照组OD值；ODs：抗血清非特异毒性对照组OD值；ODm：单核细胞非特异杀伤对照组OD值。将ODADCC代入CTLL2细胞增殖直线方程中，计算出ADCC效应组CTLL2细胞增殖数，最后用细胞增殖培养对照组细胞数减去ADCC效应组细胞增殖数，得出被杀伤细胞数。上述计算利用自编计算机程序完成。
, 百拇医药
1.2.6 125I-UdR 释放试验检测单核细胞ADCC效应方法参照文献[8]。
2 结果
2.1 免疫兔血清抗CTLL2细胞特异性抗体测定 表明免疫兔血清均产生出抗CTLL2细胞特异性抗体(图1)。
图1 免疫兔血清抗体特异性
Fig.1 Specificity of anti-CTLL2 Ab in the serum of the rabbit
Note:1 and 2 and 3.immune serum of the rabbits；4.serum of the normal rabbit；5.no serum dilution of the serum 1∶20
, 百拇医药
2.2 靶细胞数量变化时细胞增殖法和同位素释放法检测单核细胞ADCC效应的敏感性比较 结果显示细胞增殖法检测ADCC效应时，随CTLL2细胞数减少，曲线近似直线，细胞数减少至0.250×105以下时，OD值仍发生明显变化；当用125I-UdR释放试验检测ADCC效应时，CTLL2细胞较多的部分结果近似直线，当细胞数减少至0.250×105以下时曲线低平，说明125I-UdR释放法需要靶细胞数目较多，因此细胞增殖法结果较敏感(图2)。
图2 CTLL2细胞数与ADCC效应关系
Fig.2 The relationship between the number of CTLL2 cells and the ADCC effect of monocyte
, 百拇医药
Note:No.of monocytes is 5×104；dilution of immune srum is 1∶5 000：culture time of CTLL2 cells is 48 h
2.3 效应细胞数量变化时细胞增殖法和同位素释放法检测ADCC效应方法敏感性比较 结果表明效应细胞数在本实验条件下变化时，细胞增殖法检测ADCC效应曲线近似直线，而125I-UdR释放法检测ADCC效应时，效应细胞数在0.250×105以下时曲线低平，说明125I-UdR释放法需要效应细胞数目较多，而细胞增殖法在效应细胞数目较少情况下仍很敏感(图3)。
图3 单核细胞数与ADCC效应关系
Fig.3 The relationship between the number of monocyte and the ADCC effect of monocyte
, 百拇医药
Note:No.of CTLL2 cell is 2.5×104；dilution of immune serum is 1∶5 000：culture time of CTLL2 cells is 48 h
3 讨论
单核/巨噬细胞ADCC效应虽然被发现的时间较早，但临床并未广泛深入研究，其原因与传统检测方法中同位素易污染、半衰期短不易保存及检测仪器昂贵等有关。
本室建立的细胞增殖法与传统125I-UdR释放法检测ADCC效应机理不尽相同。细胞增殖法是效应细胞发挥ADCC作用后，存活的靶细胞再度增殖，得到的结果是放大效应。而125I-UdR释放法是在效应细胞发挥ADCC作用后测定被破坏的靶细胞释放出的同位素量，因此细胞增殖法更敏感，从图2，图3可以看出在低效应细胞及低靶细胞数量条件下，细胞增殖法均较125I-UdR释放法敏感，表明细胞增殖法检测ADCC效应更有可行性，因效应细胞数减少可节约血量，减轻病人抽血时的心理负担，便于临床研究应用。而靶细胞数目减少可以节省靶细胞扩大培养所需要的时间和费用，便于随时检测。
, http://www.100md.com
因细胞增殖法检测单核/巨噬细胞ADCC效应不仅与同位素释放法同样准确、稳定，而且避免了同位素应用过程中许多弊端，具有费用低、敏感性高及简便易行等优点，是一种适合广泛开展、应用的实验方法。
作者简介：黄 瑾，男，39岁，副教授
4 参考文献
[1] Tevelde A A,Figdor C G.Monocyte mediated cytotoxic activity against melanoma.Melanoma Tes,1992;(5-6)：303
[2] Osumi K,Nagao J,Yuasa H et al. Antibody dependent cell mediated cytotoxicity on human cervical carcinoma cell line,me-180,with human monoclonal antibody.Cancer Lett,1992;62(2):179
, 百拇医药
[3] Vinayak V K,Sharma P.Kinetics of the immune responses during the course of hepatic amoeebic infection an experimental study.Trans R Soc Trop Med Hys,1989;83(3):349
[4] Loftin K C,Gonik B,Kumaran P.Natural killer cytotoxicity and antibody dependent cell cytotoxicity to simplex herpes virus infected target cells in murine pregnancy.Am J Reprod Immunol Microbiol，1988;17(2):53
[5] Munn D H,Cheung N K.Antibody independent phagocytosis of tumor cells by human monocyte derived macrophages cultured in recombinant macrophage colon stimulating factor.Cancer Immunol Immunother,1995;41(1):46
[6] 杨景山主编.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1990：75
[7] 黄 瑾，安继红，薛晓梅.MTT比色检测细胞增殖方法的改良及实验影响因素观察.白求恩医科大学学报，1992；18(4)：395
[8] 张金山，李修义，刘 进.ADCC活性测定.见：龚守良主编.实用基础医学实验技术.长春：吉林科学技术出版社，1990：196
〔收稿1997-03-14 三次修回1998-10-30〕, 百拇医药
单位：黄 瑾 马忠森 林树青 (白求恩医科大学第二临床学院呼吸内科，长春130041)；王荣有 (白求恩医科大学第二临床学院胸外科，长春130041)
关键词：单核/巨噬细胞；ADCC；细胞增殖
中国免疫学杂志990412 中国图书分类号 R392-33
摘 要 目的：为了建立一种供临床实验室广泛应用的检测单核/巨噬细胞ADCC效应的实验方法。方法：选择CTLL2细胞作为靶细胞，制备出兔抗CTLL2细胞特异性抗血清，用单核细胞作为效应细胞，通过CTLL2细胞增殖结果检测单核细胞ADCC效应，并与传统检测方法125I-UdR释放试验进行比较。结果：该方法较同位素试验方法更敏感。结论：细胞增殖法检测单核细胞ADCC效应准确、可靠。
, 百拇医药
Creation of the method of cell proliferation for detecting the ADCC effect of monocyte/macrophage
HUANG Jin,MA Zhong-Sen,LIN Shu-Qing et al. The Second Clinical College of Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130041
Abstract Objective:To create a method of detecting the ADCC effect of monocyte/macrophage in clinical laboratory.Methods:CTLL2 cells was selected as target cells to prepare the specific antiserum of rabbit.Monocytes act as effect cells.The ADCC effect of monocyte was detected by observing the proliferation of CTLL2 cells.This new method was also compared with the traditional method of 125 I-UdR releasing test.Results:The method of cell proliferation is more sensitive than that of isotope releasing test.Conclusion:Using cell proliferation method to detect the ADCC effect of monocyte is stable and accurate.
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Key words Monocyte/macrophage ADCC Cell proliferation
单核/巨噬细胞ADCC效应是重要免疫学功能之一，在抗感染、抗肿瘤及抗寄生虫等方面均具有重要作用，与许多疾病的发生和发展密切相关[1-5]。传统方法多用同位素释放法检测单核/巨噬细胞ADCC效应，因同位素半衰期短不易保存且易污染等缺点，限制其临床的应用研究，因此本实验建立了细胞增殖法用于检测单核/巨噬细胞ADCC效应。
1 材料与方法
1.1 细胞株、试剂与动物 CTLL2细胞由本实验室长期传代培养；rhIL-2为卫生部长春生物制品所产品；酶标羊抗兔IgG为北京军科院产品；125I-UDR为北京原子能研究所产品；CBWR/B兔为本校动物中心提供。单核细胞取自健康人外周血。兔抗CTLL2细胞抗血清由本室制备。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 兔抗CTLL2细胞抗血清制备方法 参照文献[6]。
1.2.2 免疫兔血清抗体特异性测定 将CTLL2细胞固定，分3管，浓度为1×106 ml-1，分别加入免疫兔血清(工作效价为1∶20)、正常兔血清对照及空白对照，最后加酶标羊抗兔IgG，用含有OPD的磷酸、柠檬酸缓冲液显色，用酶标仪测OD490 nm值。
1.2.3 效应细胞的制备 无菌取人静脉血提取PBMC，调细胞浓度为1×106 ml-1，取1 ml倾入直径35 mm塑料细胞培养平皿内，37℃CO2孵箱中静置90 min，洗去非贴壁细胞，贴壁细胞为单核细胞，贴壁前后分别计数PBMC数，差值为单核细胞数。
, 百拇医药 1.2.4 实验分组及结果测定 ①单核细胞ADCC效应实验组：内有单核细胞、CTLL2细胞和免疫兔血清，效/靶细胞数比值为2∶1，血清工作效价为1∶5 000。②单核细胞非特异杀伤对照组：内有单核细胞和CTLL2细胞，效/靶细胞数比值为2∶1。③抗血清非特异毒性对照组：内有免疫兔血清和CTLL2细胞血清工作效价为1∶5 000，细胞浓度为1.6×104 ml-1。④CTLL2细胞增殖标准对照组：只有CTLL2细胞，其浓度分别为0.2×104、0.4×104、0.8×104、1.6×104 ml-1。上述各组均加入rhIL-2 100 U/ml，37℃CO2箱中培养72 h，将培养皿内细胞悬液移入试管中离心吸去部分上清，混匀管内细胞悬液移至40孔酶标反应板中，用改良的MTT比色法测定结果[7]。
1.2.5 实验结果计算 CTLL2细胞增殖标准对照组细胞增殖数按直线回归方程式计算，确定OD值与细胞数的相关性。单核细胞ADCC效应组CTLL2细胞数按下述公式计算：ODADCC＝ODt-(ODc-ODs)-(ODc-ODm)＝ODt-(2ODc-ODs-ODm)。ODADCC：单核细胞ADCC效应组实际OD值；ODt：单核细胞ADCC效应组测得OD值；ODc：CTLL2细胞增殖标准对照组OD值；ODs：抗血清非特异毒性对照组OD值；ODm：单核细胞非特异杀伤对照组OD值。将ODADCC代入CTLL2细胞增殖直线方程中，计算出ADCC效应组CTLL2细胞增殖数，最后用细胞增殖培养对照组细胞数减去ADCC效应组细胞增殖数，得出被杀伤细胞数。上述计算利用自编计算机程序完成。
, 百拇医药
1.2.6 125I-UdR 释放试验检测单核细胞ADCC效应方法参照文献[8]。
2 结果
2.1 免疫兔血清抗CTLL2细胞特异性抗体测定 表明免疫兔血清均产生出抗CTLL2细胞特异性抗体(图1)。
图1 免疫兔血清抗体特异性
Fig.1 Specificity of anti-CTLL2 Ab in the serum of the rabbit
Note:1 and 2 and 3.immune serum of the rabbits；4.serum of the normal rabbit；5.no serum dilution of the serum 1∶20
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2.2 靶细胞数量变化时细胞增殖法和同位素释放法检测单核细胞ADCC效应的敏感性比较 结果显示细胞增殖法检测ADCC效应时，随CTLL2细胞数减少，曲线近似直线，细胞数减少至0.250×105以下时，OD值仍发生明显变化；当用125I-UdR释放试验检测ADCC效应时，CTLL2细胞较多的部分结果近似直线，当细胞数减少至0.250×105以下时曲线低平，说明125I-UdR释放法需要靶细胞数目较多，因此细胞增殖法结果较敏感(图2)。
图2 CTLL2细胞数与ADCC效应关系
Fig.2 The relationship between the number of CTLL2 cells and the ADCC effect of monocyte
, 百拇医药
Note:No.of monocytes is 5×104；dilution of immune srum is 1∶5 000：culture time of CTLL2 cells is 48 h
2.3 效应细胞数量变化时细胞增殖法和同位素释放法检测ADCC效应方法敏感性比较 结果表明效应细胞数在本实验条件下变化时，细胞增殖法检测ADCC效应曲线近似直线，而125I-UdR释放法检测ADCC效应时，效应细胞数在0.250×105以下时曲线低平，说明125I-UdR释放法需要效应细胞数目较多，而细胞增殖法在效应细胞数目较少情况下仍很敏感(图3)。
图3 单核细胞数与ADCC效应关系
Fig.3 The relationship between the number of monocyte and the ADCC effect of monocyte
, 百拇医药
Note:No.of CTLL2 cell is 2.5×104；dilution of immune serum is 1∶5 000：culture time of CTLL2 cells is 48 h
3 讨论
单核/巨噬细胞ADCC效应虽然被发现的时间较早，但临床并未广泛深入研究，其原因与传统检测方法中同位素易污染、半衰期短不易保存及检测仪器昂贵等有关。
本室建立的细胞增殖法与传统125I-UdR释放法检测ADCC效应机理不尽相同。细胞增殖法是效应细胞发挥ADCC作用后，存活的靶细胞再度增殖，得到的结果是放大效应。而125I-UdR释放法是在效应细胞发挥ADCC作用后测定被破坏的靶细胞释放出的同位素量，因此细胞增殖法更敏感，从图2，图3可以看出在低效应细胞及低靶细胞数量条件下，细胞增殖法均较125I-UdR释放法敏感，表明细胞增殖法检测ADCC效应更有可行性，因效应细胞数减少可节约血量，减轻病人抽血时的心理负担，便于临床研究应用。而靶细胞数目减少可以节省靶细胞扩大培养所需要的时间和费用，便于随时检测。
, http://www.100md.com
因细胞增殖法检测单核/巨噬细胞ADCC效应不仅与同位素释放法同样准确、稳定，而且避免了同位素应用过程中许多弊端，具有费用低、敏感性高及简便易行等优点，是一种适合广泛开展、应用的实验方法。
作者简介：黄 瑾，男，39岁，副教授
4 参考文献
[1] Tevelde A A,Figdor C G.Monocyte mediated cytotoxic activity against melanoma.Melanoma Tes,1992;(5-6)：303
[2] Osumi K,Nagao J,Yuasa H et al. Antibody dependent cell mediated cytotoxicity on human cervical carcinoma cell line,me-180,with human monoclonal antibody.Cancer Lett,1992;62(2):179
, 百拇医药
[3] Vinayak V K,Sharma P.Kinetics of the immune responses during the course of hepatic amoeebic infection an experimental study.Trans R Soc Trop Med Hys,1989;83(3):349
[4] Loftin K C,Gonik B,Kumaran P.Natural killer cytotoxicity and antibody dependent cell cytotoxicity to simplex herpes virus infected target cells in murine pregnancy.Am J Reprod Immunol Microbiol，1988;17(2):53
[5] Munn D H,Cheung N K.Antibody independent phagocytosis of tumor cells by human monocyte derived macrophages cultured in recombinant macrophage colon stimulating factor.Cancer Immunol Immunother,1995;41(1):46
[6] 杨景山主编.医学细胞化学与细胞生物技术.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1990：75
[7] 黄 瑾，安继红，薛晓梅.MTT比色检测细胞增殖方法的改良及实验影响因素观察.白求恩医科大学学报，1992；18(4)：395
[8] 张金山，李修义，刘 进.ADCC活性测定.见：龚守良主编.实用基础医学实验技术.长春：吉林科学技术出版社，1990：196
〔收稿1997-03-14 三次修回1998-10-30〕, 百拇医药