从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的重链可变区和更小抗体片段
作者：胡志伟 段招军 朱建高 周国华 胡锦跃 孙去病
单位：湖南医科大学肿瘤研究所免疫生物室，长沙410078
关键词：人免疫球蛋白基因；单链抗体库；大肠癌靶向；重链可变区；互补决定区
中国免疫学杂志990402 中国图书分类号 R730.3
摘 要 目的：用噬菌体呈现技术结合体外致敏法构建了人源单链抗体库，并用大肠癌相关抗原CA-Hb3筛选出抗大肠癌噬菌体抗体克隆EL5D、EL6D和Ca12，测定3个克隆的核苷酸序列，并研究其免疫活性。方法：采用抗体克隆扩增、测序分析、免疫组化法测定活性。结果：抗体基因插入片段分别为220、500、500 bp。测序结果表明，EL6D和Ca12属VH5-D-JH4，仅为VH结构亚单位，而EL5D属Vκ的Jκ1，仅为FR3-CDR3-FR4结构。三者均能与人结直肠癌细胞和组织反应，与其亲本鼠源单抗Hb3的结合特性一致。3个抗体克隆已列入国际基因库，序号为AF051165-AF051167。结论：短的人源抗体片段具有潜在临床应用价值。
, http://www.100md.com
VH and shorter fragments with antigen-binding activities biopanned from human repertoire single-chain Fv libraries
HU Zhi-Wei,DUAN Zhao-Jun,ZHU Jian-Gao et al. Laboratory of Tumor Immunobiology,Cancer Research Institute,Hunan Medical University,Changsha 410078
Abstract Objective:Phage display technology is the best method for humanizing mouse-original monoclonal antibodies.Human repertoire single-chain Fv libraries had been constructed with phage display technology in combination of immunization in vitro,and three phage antibody clones(EL5D,EL6D and Ca12)were biopanned with an colorectal-carcinoma associated antigen CA-Hb3.The object of this study is to detect the sequence of these antibody clones and study immunological activity.Methods:The antibody sequences were stadied and it's immune activities were detected by immunohistochemistry.Results:The inserts of EL5D,EL6D and Ca12 were of 220,500 and 500 bp,respectively.The sequences of EL6D and Ca12 belonged to subgroup VH5-D-JH4 and were just VH region.The sequence of EL5D,however,belonged to Vκ and just were Jκl region containing partial FR3-CDR3-FR4 of kabba light chain.They could specifically bind with colorectal carcinoma cell lines and tissues,which were identical with their parent mouse monoclonal antibody Hb3.The accession numbers of international genbank are AF051165-AF051167.Conclusion:The shorter antibody fragments would have better clinical application.
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Key words Human immunoglobulin genes Single-chain Fv library Colorectal carcinoma targetting Variable region of heavy chain Complementarity determining region
近年来，我们用体外致敏法结合噬菌体表面呈现技术构建了人源抗大肠癌单链抗体库[1]，用固相抗原递减法经3轮筛选得到90个阳性克隆。在噬菌体fUSE5载体DNA中的单链抗体(Single-chain variable fragments,scFv)基因的插入片段大小约为500和220 bp不等。挑选A405 nm值最好的3个克隆经免疫组化鉴定，它们均与大肠癌组织反应。测序结果显示，其中两个克隆仅为重链可变区(VH)片段，而第3个更短，仅为轻链可变区第三互补区(The third complementarity-determining region,CDR3)。现报道如下。
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1 材料与方法
1.1 噬菌体抗体克隆的筛选和扩增 用Hb3抗体亲和层析柱纯化的大肠癌抗原CA-Hb3包板的间接ELISA筛出90个阳性克隆，其中A405nm值最好的EL5D、EL6D和Ca123个克隆。挑取单菌落接种于含40 μg/ml四环素的LB培基中，37℃，振摇过夜，离心保留上清(含噬菌体颗粒，抗体片段表达于噬菌体衣壳蛋白Ⅲ的氨基端[2])。取2μl上清作模板用PCR检查抗体基因在噬菌体DNA中插入片段大小，PCR引物及条件参照文献[3]。1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物大小。
1.2 噬菌体抗体克隆测序模板的制备 将上述含EL5D、EL6D和Ca12噬菌体抗体克隆的15 ml上清分别用PEG/NaCl沉淀纯化，溶于1ml H2O中，PEG/NaCl再沉淀一次，溶于0.5ml H2O中,酚、氯仿分别抽提一次，最后用酒精沉淀噬菌体单链DNA(ssDNA)。ssDNA溶于10μl H2O中,其中2μl用于测A260nm和A280nm值，其余用于测序。
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1.3 噬菌体抗体克隆测序 测序引物为5′HO-GAATTTTCTGTATGAGGTTTTGCT-OH 3′[3,4]，插入片段距离该引物尚有25个核苷酸。采用全自动荧光测序仪(美国Perkin Elmer公司，377型)进行测序并从基因库的BLASTN中进行同源性分析[5]。
1.4 噬菌体抗体克隆结合抗原功能的鉴定 免疫组化方法鉴定3个噬菌体抗体克隆，一抗为阳性噬菌体克隆，二抗为HRP-抗M13酶结合物。癌细胞株的免疫组化：癌细胞株为人大肠癌(HRT-18、HT-29、Hce-8693、SW620)、人鼻咽癌(HNE1)、人白血病(HL-60、K562)。大肠癌组织的免疫组化：按常规处理，封片观察结果。
2 结果
2.1 抗体片段的插入大小 EL5D、EL6D和Ca12 3个克隆经PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳后显示EL5D仅有约220 bp，后两者为500 bp(图1)。
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图1 PCR扩增的噬菌体抗体克隆在载体DNA中插入片段大小
Fig.1 Inserts of antibody genes in vector DNA of fUSE5 analyzed by PCR
2.2 抗体片段的核苷酸序列分析 上述3个抗体克隆的核苷酸序列和相应的氨基酸序列见图2，其中EL6D和Ca12两个克隆全长384个核苷酸，均为重链可变区序列，属VH5-D-JH4,两者差别仅在第177位A(EL6D)换成C(Ca12)，由此氨基酸残基由Gln(Q)变为His(H)；EL5D全长105个核苷酸，属Vκ中Jκ1序列，仅含有κ轻链部分FR3-CDR3-FR4结构。3个基因的5′端序列为CTATT CTCACTCGGCCGACGTGGCC，3′端为GGGGCCGCT GGGGCCGAAACT GTTGAA，系载体fUSE5 DNA在插入片段两端的序列(斜体)及限制性内切酶SfiI的识别位点(下划线)，说明所测插入片段序列完整。
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2.3 抗体片段结合抗原的活性 细胞免疫组化结果显示，VH结构的EL6D和Ca12可结合人大肠癌细胞，不与人白血病细胞和人宫颈癌细胞反应，但尚与人鼻咽癌反应。大肠癌免疫组化结果则显示，EL5D、EL6D和Ca12均可与Hb3阳性的大肠癌组织反应，且与Hb3的结合部位一致，均为大肠癌细胞的胞浆、胞膜以及腺腔内分泌物。
3 讨论
我们结合噬菌体呈现技术和体外致敏法成功地构建抗大肠癌的人源单链抗体库，并用固相抗原递减法筛得90个阳性抗体克隆。本研究从中挑选吸光度值较高的3个克隆进行分析，发现EL6D和Ca12两个克隆只有500 bp，且核苷酸序列仅含VH序列，不含连接序列和VL序列，EL5D只有220 bp且仅有Vκ的部分FR3、CDR3和FR4。VH可以结合抗原已有报道[3，4，6]。最短的EL5D有结合抗原活性。在此之前曾预测可结合抗原的最小识别单位(Minimal recognition unit,MRU)为一个CDR[7]。现在我们偶然发现仅含VκFR3、CDR3和FR4的一个小抗体分子EL5D确能结合抗原，从而在实验上证明了该推测。以前单纯CDR结构结合抗原的报道仅见于按照鼠源单抗序列合成的多肽[8，9]。具有抗原结合活性的VH(EL6D、Ca12)甚至更小的抗体分子(EL5D)可能比scFv更有应用前景，Cai等从人源抗黑色素瘤单链抗体库中筛出的特异性最好的V86也仅为VH结构[3，4]。另外，Jang等发现一个来自红斑狼疮小鼠的IgG单抗的VH与含有VL的scFv分子相比，有同等的与天然抗原结合能力[10]。上述研究提示VH结构亚单位本身能决定抗体的特异性。此外在骆驼体内有一个天然产生的有功能的重链全套抗体库[11]，这种重链抗体由两个同样的由二硫键相连的重链组成，每个重链有一个VH、CH2和CH3结构亚单位。此研究提供了另外一个证据支持功能性的重链，也许并不需要任何VL结构亚单位配对。
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图2 抗大肠癌噬菌体抗体EL5D(Ⅲ)、EL6D(Ⅰ)和Ca12(Ⅱ)克隆的核苷酸和氨基酸序列
Fig.2 Sequences of nucleotides and amino acids of the EL5D(Ⅲ)，EL6D(Ⅰ) and Ca12(Ⅱ) clones
在VL的FR1和CDR1之间有一个SfiI酶切位点，因此将scFv克隆入fUSE5载体时，用SfiI酶切就可以将VL的大部分切除，从而只剩下完整的VH或VL的CDR3[4]。
从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的重链可变区和更小抗体片段 本文受国家自然科学基金资助(39700054)
作者简介：胡志伟，男，27岁，讲师，博士，主要研究肿瘤免疫学的免疫诊断和抗肿瘤人源抗体库；孙去病，男，69岁，教授，博士生导师，主要从事大肠癌和鼻咽癌的肿瘤免疫学研究
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4 参考文献
[1] 胡志伟，孙去病.大肠癌相关抗原体外致敏法构建人源抗体库.中国肿瘤生物治疗杂志，1997；4(2)：130
[2] Scott J K,Smith G P.Searching for peptide ligands with an epitope library.Science，1990;249:386
[3] Cai X H,Garen A.Anti-melanoma antibodies from melanoma patients immunized with genetically modified autologous tumor cells:Selection of specific antibodies from single-chain Fv fusion phage libraries.Proc Natl Acad Sci USA,1995;92(14):6537
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[4] Cai X H,Garen A.A melanoma-specific antibody heavy chain variable region fragment from melanoma patients immunized with gentically modified autologous tumor cells.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(13):6280
[5] Altschul S F,Gish W,Miller W et al. Basic alignment search tool.J Mol Biol，1990;215:403
[6] Ward E S,Gussow D,Griffiths A D et al.Binding activities of a repertoire of immunoglobulins secreted from Escherichia coli.Nature,1989；341:544
, http://www.100md.com
[7] Rodwell J D.Engeering monoclonal antibody.Nature,1989;342:99
[8] Taub R,Gould R J,Garsky V M et al. A monclonal antibody against the platelet fibrinogen receptor contains a sequence that mimics a receptor recognition domain in fibrinogen.J Bio Chem,1989;264(1):259
[9] Wiliams W V,Moss D A,Kieber-Emmons T et al. Development of biologically active peptides based on antibody structure.Proc Natl Acad Sci USA,1989；86:553
, 百拇医药
[10] Jang Y J,Lecerf J M,Stoller B D.Heavy chain dominance in the binding og DNA by a lupus mouse monoclonal autoantibody.Mol Immunol,1996;33:197
[11] Hammers-Casternan C,Atarhouch T,Bendanhman N et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains.Nature,1993；363:446
〔收稿1997-11-06 修回1998-05-11〕, 百拇医药
单位：湖南医科大学肿瘤研究所免疫生物室，长沙410078
关键词：人免疫球蛋白基因；单链抗体库；大肠癌靶向；重链可变区；互补决定区
中国免疫学杂志990402 中国图书分类号 R730.3
摘 要 目的：用噬菌体呈现技术结合体外致敏法构建了人源单链抗体库，并用大肠癌相关抗原CA-Hb3筛选出抗大肠癌噬菌体抗体克隆EL5D、EL6D和Ca12，测定3个克隆的核苷酸序列，并研究其免疫活性。方法：采用抗体克隆扩增、测序分析、免疫组化法测定活性。结果：抗体基因插入片段分别为220、500、500 bp。测序结果表明，EL6D和Ca12属VH5-D-JH4，仅为VH结构亚单位，而EL5D属Vκ的Jκ1，仅为FR3-CDR3-FR4结构。三者均能与人结直肠癌细胞和组织反应，与其亲本鼠源单抗Hb3的结合特性一致。3个抗体克隆已列入国际基因库，序号为AF051165-AF051167。结论：短的人源抗体片段具有潜在临床应用价值。
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VH and shorter fragments with antigen-binding activities biopanned from human repertoire single-chain Fv libraries
HU Zhi-Wei,DUAN Zhao-Jun,ZHU Jian-Gao et al. Laboratory of Tumor Immunobiology,Cancer Research Institute,Hunan Medical University,Changsha 410078
Abstract Objective:Phage display technology is the best method for humanizing mouse-original monoclonal antibodies.Human repertoire single-chain Fv libraries had been constructed with phage display technology in combination of immunization in vitro,and three phage antibody clones(EL5D,EL6D and Ca12)were biopanned with an colorectal-carcinoma associated antigen CA-Hb3.The object of this study is to detect the sequence of these antibody clones and study immunological activity.Methods:The antibody sequences were stadied and it's immune activities were detected by immunohistochemistry.Results:The inserts of EL5D,EL6D and Ca12 were of 220,500 and 500 bp,respectively.The sequences of EL6D and Ca12 belonged to subgroup VH5-D-JH4 and were just VH region.The sequence of EL5D,however,belonged to Vκ and just were Jκl region containing partial FR3-CDR3-FR4 of kabba light chain.They could specifically bind with colorectal carcinoma cell lines and tissues,which were identical with their parent mouse monoclonal antibody Hb3.The accession numbers of international genbank are AF051165-AF051167.Conclusion:The shorter antibody fragments would have better clinical application.
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Key words Human immunoglobulin genes Single-chain Fv library Colorectal carcinoma targetting Variable region of heavy chain Complementarity determining region
近年来，我们用体外致敏法结合噬菌体表面呈现技术构建了人源抗大肠癌单链抗体库[1]，用固相抗原递减法经3轮筛选得到90个阳性克隆。在噬菌体fUSE5载体DNA中的单链抗体(Single-chain variable fragments,scFv)基因的插入片段大小约为500和220 bp不等。挑选A405 nm值最好的3个克隆经免疫组化鉴定，它们均与大肠癌组织反应。测序结果显示，其中两个克隆仅为重链可变区(VH)片段，而第3个更短，仅为轻链可变区第三互补区(The third complementarity-determining region,CDR3)。现报道如下。
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1 材料与方法
1.1 噬菌体抗体克隆的筛选和扩增 用Hb3抗体亲和层析柱纯化的大肠癌抗原CA-Hb3包板的间接ELISA筛出90个阳性克隆，其中A405nm值最好的EL5D、EL6D和Ca123个克隆。挑取单菌落接种于含40 μg/ml四环素的LB培基中，37℃，振摇过夜，离心保留上清(含噬菌体颗粒，抗体片段表达于噬菌体衣壳蛋白Ⅲ的氨基端[2])。取2μl上清作模板用PCR检查抗体基因在噬菌体DNA中插入片段大小，PCR引物及条件参照文献[3]。1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物大小。
1.2 噬菌体抗体克隆测序模板的制备 将上述含EL5D、EL6D和Ca12噬菌体抗体克隆的15 ml上清分别用PEG/NaCl沉淀纯化，溶于1ml H2O中，PEG/NaCl再沉淀一次，溶于0.5ml H2O中,酚、氯仿分别抽提一次，最后用酒精沉淀噬菌体单链DNA(ssDNA)。ssDNA溶于10μl H2O中,其中2μl用于测A260nm和A280nm值，其余用于测序。
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1.3 噬菌体抗体克隆测序 测序引物为5′HO-GAATTTTCTGTATGAGGTTTTGCT-OH 3′[3,4]，插入片段距离该引物尚有25个核苷酸。采用全自动荧光测序仪(美国Perkin Elmer公司，377型)进行测序并从基因库的BLASTN中进行同源性分析[5]。
1.4 噬菌体抗体克隆结合抗原功能的鉴定 免疫组化方法鉴定3个噬菌体抗体克隆，一抗为阳性噬菌体克隆，二抗为HRP-抗M13酶结合物。癌细胞株的免疫组化：癌细胞株为人大肠癌(HRT-18、HT-29、Hce-8693、SW620)、人鼻咽癌(HNE1)、人白血病(HL-60、K562)。大肠癌组织的免疫组化：按常规处理，封片观察结果。
2 结果
2.1 抗体片段的插入大小 EL5D、EL6D和Ca12 3个克隆经PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳后显示EL5D仅有约220 bp，后两者为500 bp(图1)。
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图1 PCR扩增的噬菌体抗体克隆在载体DNA中插入片段大小
Fig.1 Inserts of antibody genes in vector DNA of fUSE5 analyzed by PCR
2.2 抗体片段的核苷酸序列分析 上述3个抗体克隆的核苷酸序列和相应的氨基酸序列见图2，其中EL6D和Ca12两个克隆全长384个核苷酸，均为重链可变区序列，属VH5-D-JH4,两者差别仅在第177位A(EL6D)换成C(Ca12)，由此氨基酸残基由Gln(Q)变为His(H)；EL5D全长105个核苷酸，属Vκ中Jκ1序列，仅含有κ轻链部分FR3-CDR3-FR4结构。3个基因的5′端序列为CTATT CTCACTCGGCCGACGTGGCC，3′端为GGGGCCGCT GGGGCCGAAACT GTTGAA，系载体fUSE5 DNA在插入片段两端的序列(斜体)及限制性内切酶SfiI的识别位点(下划线)，说明所测插入片段序列完整。
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2.3 抗体片段结合抗原的活性 细胞免疫组化结果显示，VH结构的EL6D和Ca12可结合人大肠癌细胞，不与人白血病细胞和人宫颈癌细胞反应，但尚与人鼻咽癌反应。大肠癌免疫组化结果则显示，EL5D、EL6D和Ca12均可与Hb3阳性的大肠癌组织反应，且与Hb3的结合部位一致，均为大肠癌细胞的胞浆、胞膜以及腺腔内分泌物。
3 讨论
我们结合噬菌体呈现技术和体外致敏法成功地构建抗大肠癌的人源单链抗体库，并用固相抗原递减法筛得90个阳性抗体克隆。本研究从中挑选吸光度值较高的3个克隆进行分析，发现EL6D和Ca12两个克隆只有500 bp，且核苷酸序列仅含VH序列，不含连接序列和VL序列，EL5D只有220 bp且仅有Vκ的部分FR3、CDR3和FR4。VH可以结合抗原已有报道[3，4，6]。最短的EL5D有结合抗原活性。在此之前曾预测可结合抗原的最小识别单位(Minimal recognition unit,MRU)为一个CDR[7]。现在我们偶然发现仅含VκFR3、CDR3和FR4的一个小抗体分子EL5D确能结合抗原，从而在实验上证明了该推测。以前单纯CDR结构结合抗原的报道仅见于按照鼠源单抗序列合成的多肽[8，9]。具有抗原结合活性的VH(EL6D、Ca12)甚至更小的抗体分子(EL5D)可能比scFv更有应用前景，Cai等从人源抗黑色素瘤单链抗体库中筛出的特异性最好的V86也仅为VH结构[3，4]。另外，Jang等发现一个来自红斑狼疮小鼠的IgG单抗的VH与含有VL的scFv分子相比，有同等的与天然抗原结合能力[10]。上述研究提示VH结构亚单位本身能决定抗体的特异性。此外在骆驼体内有一个天然产生的有功能的重链全套抗体库[11]，这种重链抗体由两个同样的由二硫键相连的重链组成，每个重链有一个VH、CH2和CH3结构亚单位。此研究提供了另外一个证据支持功能性的重链，也许并不需要任何VL结构亚单位配对。
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图2 抗大肠癌噬菌体抗体EL5D(Ⅲ)、EL6D(Ⅰ)和Ca12(Ⅱ)克隆的核苷酸和氨基酸序列
Fig.2 Sequences of nucleotides and amino acids of the EL5D(Ⅲ)，EL6D(Ⅰ) and Ca12(Ⅱ) clones
在VL的FR1和CDR1之间有一个SfiI酶切位点，因此将scFv克隆入fUSE5载体时，用SfiI酶切就可以将VL的大部分切除，从而只剩下完整的VH或VL的CDR3[4]。
从人源单链抗体库中筛出具有抗原结合活性的重链可变区和更小抗体片段 本文受国家自然科学基金资助(39700054)
作者简介：胡志伟，男，27岁，讲师，博士，主要研究肿瘤免疫学的免疫诊断和抗肿瘤人源抗体库；孙去病，男，69岁，教授，博士生导师，主要从事大肠癌和鼻咽癌的肿瘤免疫学研究
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[1] 胡志伟，孙去病.大肠癌相关抗原体外致敏法构建人源抗体库.中国肿瘤生物治疗杂志，1997；4(2)：130
[2] Scott J K,Smith G P.Searching for peptide ligands with an epitope library.Science，1990;249:386
[3] Cai X H,Garen A.Anti-melanoma antibodies from melanoma patients immunized with genetically modified autologous tumor cells:Selection of specific antibodies from single-chain Fv fusion phage libraries.Proc Natl Acad Sci USA,1995;92(14):6537
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[4] Cai X H,Garen A.A melanoma-specific antibody heavy chain variable region fragment from melanoma patients immunized with gentically modified autologous tumor cells.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(13):6280
[5] Altschul S F,Gish W,Miller W et al. Basic alignment search tool.J Mol Biol，1990;215:403
[6] Ward E S,Gussow D,Griffiths A D et al.Binding activities of a repertoire of immunoglobulins secreted from Escherichia coli.Nature,1989；341:544
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[7] Rodwell J D.Engeering monoclonal antibody.Nature,1989;342:99
[8] Taub R,Gould R J,Garsky V M et al. A monclonal antibody against the platelet fibrinogen receptor contains a sequence that mimics a receptor recognition domain in fibrinogen.J Bio Chem,1989;264(1):259
[9] Wiliams W V,Moss D A,Kieber-Emmons T et al. Development of biologically active peptides based on antibody structure.Proc Natl Acad Sci USA,1989；86:553
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[10] Jang Y J,Lecerf J M,Stoller B D.Heavy chain dominance in the binding og DNA by a lupus mouse monoclonal autoantibody.Mol Immunol,1996;33:197
[11] Hammers-Casternan C,Atarhouch T,Bendanhman N et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains.Nature,1993；363:446
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