组织蛋白酶D在乳腺良、恶性病变中的表达及意义
作者：崔猛胜 刘秉义 季德刚 李晨玉①
单位：崔猛胜 刘秉义 季德刚 李晨玉① (白求恩医科大学第三临床学院外科，长春130031)
关键词：乳腺癌；免疫组化；组织蛋白酶D
中国免疫免学杂志/990513 摘 要 目的：探讨组织蛋白酶D在乳腺良、恶性病变中的表达及意义。方法：用ABC法研究93例乳腺癌、31例乳腺良性病变及6例正常乳腺组织Cath-D的表达。结果：乳腺癌中43例(46.24%)细胞浆染色阳性，而全部良性病变及正常乳腺组织均阴性。Cath-D表达阳性的乳腺癌其肿瘤体积及淋巴结转移率均高于Cath-D表达阴性者。结论：Cath-D可以作为反映乳腺癌细胞增殖状态的细胞生物学因子，其过度表达提示乳腺癌恶性程度高。
中国图书分类号 R392.66
, 百拇医药 The expression and significance of cathepsin D in begin and malign breast disease
CUI Meng-Sheng， LIU Bing-Yi, JI De-Gang et al.
The Third Clinical Hospital of Norman Bethune University of Medical Science， Changchun 130031
Abstract Objective:Discussed the expression and significance of cathepsin-D in breast begin and breast carcinomas. Methods:Examined the expression of cathepsin-D in 93 cases of breast carcinomas, 31 cases of breast begin disease and 6 cases of normal breast tissue with the ABC immunohistochemical technique. Results:Demonstrate that the cytosol staining is positive in 43 cases (46.24%) of breast cancer but negative in all of the begin breast disease and te normal breast tissue. The size of tumor and the ratio of lymphnode metastasis in the breast cancer in which the expression of cathepsin-D were positive are higher than that the expression were negative. Conclusion: Discussion cathepsin-D can be used as a biological factor to reflect the proliferation status of carcinoma cells. The carcinoma cells in which cathepsin-D expression is positive have higher malignant degree.
, 百拇医药
Key words Breast cancer,prognosis Immunohistochemical Cathepsin D
本研究应用ABC法研究了93例乳腺癌，31例乳腺良性病变及6例正常乳腺组织中Cath-D的表达情况并探讨其在乳腺癌预后的意义。
1 材料与方法
1.1 材料 93例乳腺癌组织全部取自白求恩医大三院1994～1995年手术切除并经病理证实(其中浸润性导管癌49例、单纯癌25例、髓样癌13例、粘液癌3例、导管内癌3例)，另取31例良性病变组织(纤维腺瘤12例、囊性增生病7例、乳头状瘤9例、乳腺炎3例)及6例正常乳腺组织作为对照。乳腺癌年龄29～63岁，平均年龄48.5岁。
1.2 试剂 兔抗人Cath-D为IYMED公司产品；猪抗兔IgG与ABC试剂均为美国DAKO公司产品。
, http://www.100md.com
1.3 方法 所有组织均用10%福尔马林液固定，石蜡包埋，4 μm连续切片3张。切片常规二甲苯脱腊、梯度乙醇水化后用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBS)清洗3次，使用标准猪血清(1∶20)封闭，37℃孵育30 min，TBS清洗3次，取两张切片分别滴加一抗Cath-D及TBS，室温下孵育60 min，TBS清洗3次后于两张切片上分别滴加生物素标记的猪抗兔IgG(1∶30)，以后按ABC免疫组织化学技术方法常规进行，ABC显色。另取一张切片供病理分型用。
1.4 结果判定 Cath-D阳性颗粒位于胞浆内，染色信号为棕黄色，着色细胞数需50%。
1.5 自动图象分析 图象分析仪(日本Nlreco公司生产)，型号为Luzex-F型。显微图象通过高分辨电视摄象机转换成图象信号呈象在显示器上，用鼠标描记其细胞及核的轮廓，选定细胞形态学参数后，由微机控制已编制各参数的运算程序，对处理后的图象测量结果送入微机内的分析系统，然后将结果输出至显示器上，即可得到细胞核面积(NA)，核周长(NP)，细胞面积(CA)，计算核浆比(NCR)，NCR-NA/(CA-NA)统计结果用χ2和t检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 Cath-D在乳腺良、恶性病变中的表达93例乳腺癌中Cath-D表达阳性者43例(46.24%)，其中浸润性导管癌的阳性率为57.14%，单纯癌的阳性率为44.00%，两者无明显差别(P>0.05)。髓样癌为23.07%，导管内癌为33.33%。31例乳腺良性病变及6例正常乳腺组织Cath-D的表达均为阴性。
2.2 Cath-D的表达与肿瘤大小的关系 肿瘤直径大于4cm的Cath-D的阳性率明显高于2 cm者(χ2=11.260，P<0.05)，肿瘤直径为2～4 cm的Cath-D阳性率也明显高于小于2 cm者(χ2=12.320，P<0.05)，肿瘤直径大于4 cm的Cath-D表达率与2～4 cm的表达率无明显差别(χ2=0.234， P>0.005)。
2.3 Cath-D的表达与淋巴结转移的关系 结果显示，Cath-D表达阳性的43例中有淋巴结转移的30例(69.77%)，Cath-D表达阴性的50例中有淋巴结转移的22例(44.00%)，Cath-D表达阳性者淋巴结转移明显高于Cath-D表达阴性者(χ2=6.227，P<0.05)。
, 百拇医药
2.4 Cath-D表达与年龄及雌激素受体的关系 50岁以下者Cath-D的表达率(47.06%)与大于50岁的Cath-D表达率(45.24%)无明显差异(χ2=0.031，P>0.05)，雌激素受体(ER)阳性者Cath-D的表达率(40.43%)与ER阴性者表达率无明显差异(χ2=1.290，P>0.05)。
2.5 显微图象分析 根据Cath-D表达的阳性和阴性结果，在浸润性导管癌中各取10例，每例测量100个细胞进行显微图象分析，测得NA、NP、NCR得均值及标准差，Cath-D表达阳性癌细胞的NA为45.888、NP为25.851及NCR为0.532均显著大于阴性癌细胞NA为34.194、NP为22.62、NCR为0.433，NA t值为2.302，P<0.025；NP t值为3.019，P<0.01；NCR t值为2.156，P<0.05，统计学上意义显著。
3 讨论
, http://www.100md.com
Cath-D于1979年首先由Westleg和Rochefort等发现，是一种52 kD的糖蛋白，正常组织即合成Cath-D，在所有细胞中都以低浓度存在，其正常功能是在溶酶体的酸性pH环境中分解蛋白质，在乳腺癌细胞中被过度表达，其机制尚不清楚。有研究表明：Cath-D是一种普遍存在的溶酶体蛋白酶，合成后即被溶酶全靶受体从高尔器中运输出来，一旦进入溶酶体，Cath-D被分解成两链形式(34和14 D)，稳定且积聚起来，当Cath-D基因过度表达时可以造成溶酶体靶通道的过度负荷，导致52 kD的持续分泌[1]和其它溶酶体酶的释放。过度表达的Cath-D，其酸性蛋白分解活性可作用于多种底物(包括有丝分裂原底物和基底膜)，从而促进有丝分裂、溶解基底膜、细胞外基质和结缔组织，加速癌细胞的生长和转移，这在体外动物实验已得到证实。国外研究表明：Cath-D对早期复发和死亡都是重要指标，对乳腺癌预后有明显的提示作用，特别在淋巴结阴性的患者中[2]。Tandon等及Mc Guire等的研究显示[2]：高浓度的Cath-D病人5年内复发率高达50%～60%。Spyratos F等[3]对122例乳腺癌患者术后随访平均4～6年后指出：Cath-D是乳腺癌预后的重要指标，而且独立于传统的预后指标。我们的研究结果发现Cath-D在乳腺良性病变及正常乳腺组织中表达阴性，而在乳腺癌中表达率高达46.24%，且Cath-D的表达与肿瘤大小及淋巴结转移率均明显相关，统计学上意义显著。肿瘤大小及淋巴结转移率正是反映了肿瘤局部生长、浸润能力及沿淋巴道的转移能力。因此提示Cath-D表达阳性的乳腺癌具有更强的侵袭、转移能力，预后较差。
, 百拇医药
Tosi等研究了乳腺浸润性导管癌的核分裂指数、核面积均值及标准差与患者的生存年限呈现负相关，所测得的值越大，生存年限越短[4]。Ramachandre等研究了癌基因c-rebB-2的表达与癌细胞各种形态学指标的关系，发现癌细胞的核越大，c-rebB-2的表达率越高，癌细胞的恶性程度越高，生长繁殖能力越强[5]。本实验测得了Cath-D表达阳性及阴性的乳腺浸润性导管癌细胞各种形态学指标，发现Cath-D表达阳性的癌细胞的核面积、核周长及核浆比均比Cath-D阴性癌细胞大，统计学上意义显著。从另一角度提供了癌细胞恶性程度高的客观指标。对此，我们认为Cath-D可以作为反映乳腺癌细胞增殖状态的细胞生物学因子，Cath-D的过度表达提示乳腺癌恶性程度高、预后差，对这类乳腺癌患者有必要加大术后化疗剂量、增加化疗及随访次数，防止复发。
①吉林省人民医院，长春130021
作者简介：崔猛胜，男，34岁，硕士，现在长治医院附院普外科；
, 百拇医药
刘秉义，男，56岁，教授，主要从事肝病，乳腺肿瘤的研究
4 参考文献
[1] Stein M, Braulke T, Figura K et al. Effects of differcentiation-inclucing ageuts on synthesis, maturation and secretion of cathepsin D in 11937 and H1-60 cells. Biol chem Hoppe Scyler, 1987;368:413
[2] Mc Guire W L, Tandon A K, Allred D C et al. Prognosis and treadment decision in Patients with breast cancer withour axillary node involvment. Cancer， 1992;70:1775
, http://www.100md.com
[3] Spyratos F, Mardelonds T, Brouillet J P et al. Cathepsin D. Auimprotant marker predicting matastasis in primary breast cancer. Lancet, 1989;2:1115
[4] Tosi P. Correlation between morphometrical parameters and discase-free survival in ductal breast cancer treated only by surgery. Appl Pathol， 1986;4:33
[5] Ramachandre S, Machin L, Ashley S et al. Immunohistoch emical distrbution of c-erbB-2 in situ breast carcinoma-A detailed morphological analysis. J Pathol， 1990;161：7
〔收稿1997-04-10 三次修回1998-09-25〕, 百拇医药
单位：崔猛胜 刘秉义 季德刚 李晨玉① (白求恩医科大学第三临床学院外科，长春130031)
关键词：乳腺癌；免疫组化；组织蛋白酶D
中国免疫免学杂志/990513 摘 要 目的：探讨组织蛋白酶D在乳腺良、恶性病变中的表达及意义。方法：用ABC法研究93例乳腺癌、31例乳腺良性病变及6例正常乳腺组织Cath-D的表达。结果：乳腺癌中43例(46.24%)细胞浆染色阳性，而全部良性病变及正常乳腺组织均阴性。Cath-D表达阳性的乳腺癌其肿瘤体积及淋巴结转移率均高于Cath-D表达阴性者。结论：Cath-D可以作为反映乳腺癌细胞增殖状态的细胞生物学因子，其过度表达提示乳腺癌恶性程度高。
中国图书分类号 R392.66
, 百拇医药 The expression and significance of cathepsin D in begin and malign breast disease
CUI Meng-Sheng， LIU Bing-Yi, JI De-Gang et al.
The Third Clinical Hospital of Norman Bethune University of Medical Science， Changchun 130031
Abstract Objective:Discussed the expression and significance of cathepsin-D in breast begin and breast carcinomas. Methods:Examined the expression of cathepsin-D in 93 cases of breast carcinomas, 31 cases of breast begin disease and 6 cases of normal breast tissue with the ABC immunohistochemical technique. Results:Demonstrate that the cytosol staining is positive in 43 cases (46.24%) of breast cancer but negative in all of the begin breast disease and te normal breast tissue. The size of tumor and the ratio of lymphnode metastasis in the breast cancer in which the expression of cathepsin-D were positive are higher than that the expression were negative. Conclusion: Discussion cathepsin-D can be used as a biological factor to reflect the proliferation status of carcinoma cells. The carcinoma cells in which cathepsin-D expression is positive have higher malignant degree.
, 百拇医药
Key words Breast cancer,prognosis Immunohistochemical Cathepsin D
本研究应用ABC法研究了93例乳腺癌，31例乳腺良性病变及6例正常乳腺组织中Cath-D的表达情况并探讨其在乳腺癌预后的意义。
1 材料与方法
1.1 材料 93例乳腺癌组织全部取自白求恩医大三院1994～1995年手术切除并经病理证实(其中浸润性导管癌49例、单纯癌25例、髓样癌13例、粘液癌3例、导管内癌3例)，另取31例良性病变组织(纤维腺瘤12例、囊性增生病7例、乳头状瘤9例、乳腺炎3例)及6例正常乳腺组织作为对照。乳腺癌年龄29～63岁，平均年龄48.5岁。
1.2 试剂 兔抗人Cath-D为IYMED公司产品；猪抗兔IgG与ABC试剂均为美国DAKO公司产品。
, http://www.100md.com
1.3 方法 所有组织均用10%福尔马林液固定，石蜡包埋，4 μm连续切片3张。切片常规二甲苯脱腊、梯度乙醇水化后用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(TBS)清洗3次，使用标准猪血清(1∶20)封闭，37℃孵育30 min，TBS清洗3次，取两张切片分别滴加一抗Cath-D及TBS，室温下孵育60 min，TBS清洗3次后于两张切片上分别滴加生物素标记的猪抗兔IgG(1∶30)，以后按ABC免疫组织化学技术方法常规进行，ABC显色。另取一张切片供病理分型用。
1.4 结果判定 Cath-D阳性颗粒位于胞浆内，染色信号为棕黄色，着色细胞数需50%。
1.5 自动图象分析 图象分析仪(日本Nlreco公司生产)，型号为Luzex-F型。显微图象通过高分辨电视摄象机转换成图象信号呈象在显示器上，用鼠标描记其细胞及核的轮廓，选定细胞形态学参数后，由微机控制已编制各参数的运算程序，对处理后的图象测量结果送入微机内的分析系统，然后将结果输出至显示器上，即可得到细胞核面积(NA)，核周长(NP)，细胞面积(CA)，计算核浆比(NCR)，NCR-NA/(CA-NA)统计结果用χ2和t检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 Cath-D在乳腺良、恶性病变中的表达93例乳腺癌中Cath-D表达阳性者43例(46.24%)，其中浸润性导管癌的阳性率为57.14%，单纯癌的阳性率为44.00%，两者无明显差别(P>0.05)。髓样癌为23.07%，导管内癌为33.33%。31例乳腺良性病变及6例正常乳腺组织Cath-D的表达均为阴性。
2.2 Cath-D的表达与肿瘤大小的关系 肿瘤直径大于4cm的Cath-D的阳性率明显高于2 cm者(χ2=11.260，P<0.05)，肿瘤直径为2～4 cm的Cath-D阳性率也明显高于小于2 cm者(χ2=12.320，P<0.05)，肿瘤直径大于4 cm的Cath-D表达率与2～4 cm的表达率无明显差别(χ2=0.234， P>0.005)。
2.3 Cath-D的表达与淋巴结转移的关系 结果显示，Cath-D表达阳性的43例中有淋巴结转移的30例(69.77%)，Cath-D表达阴性的50例中有淋巴结转移的22例(44.00%)，Cath-D表达阳性者淋巴结转移明显高于Cath-D表达阴性者(χ2=6.227，P<0.05)。
, 百拇医药
2.4 Cath-D表达与年龄及雌激素受体的关系 50岁以下者Cath-D的表达率(47.06%)与大于50岁的Cath-D表达率(45.24%)无明显差异(χ2=0.031，P>0.05)，雌激素受体(ER)阳性者Cath-D的表达率(40.43%)与ER阴性者表达率无明显差异(χ2=1.290，P>0.05)。
2.5 显微图象分析 根据Cath-D表达的阳性和阴性结果，在浸润性导管癌中各取10例，每例测量100个细胞进行显微图象分析，测得NA、NP、NCR得均值及标准差，Cath-D表达阳性癌细胞的NA为45.888、NP为25.851及NCR为0.532均显著大于阴性癌细胞NA为34.194、NP为22.62、NCR为0.433，NA t值为2.302，P<0.025；NP t值为3.019，P<0.01；NCR t值为2.156，P<0.05，统计学上意义显著。
3 讨论
, http://www.100md.com
Cath-D于1979年首先由Westleg和Rochefort等发现，是一种52 kD的糖蛋白，正常组织即合成Cath-D，在所有细胞中都以低浓度存在，其正常功能是在溶酶体的酸性pH环境中分解蛋白质，在乳腺癌细胞中被过度表达，其机制尚不清楚。有研究表明：Cath-D是一种普遍存在的溶酶体蛋白酶，合成后即被溶酶全靶受体从高尔器中运输出来，一旦进入溶酶体，Cath-D被分解成两链形式(34和14 D)，稳定且积聚起来，当Cath-D基因过度表达时可以造成溶酶体靶通道的过度负荷，导致52 kD的持续分泌[1]和其它溶酶体酶的释放。过度表达的Cath-D，其酸性蛋白分解活性可作用于多种底物(包括有丝分裂原底物和基底膜)，从而促进有丝分裂、溶解基底膜、细胞外基质和结缔组织，加速癌细胞的生长和转移，这在体外动物实验已得到证实。国外研究表明：Cath-D对早期复发和死亡都是重要指标，对乳腺癌预后有明显的提示作用，特别在淋巴结阴性的患者中[2]。Tandon等及Mc Guire等的研究显示[2]：高浓度的Cath-D病人5年内复发率高达50%～60%。Spyratos F等[3]对122例乳腺癌患者术后随访平均4～6年后指出：Cath-D是乳腺癌预后的重要指标，而且独立于传统的预后指标。我们的研究结果发现Cath-D在乳腺良性病变及正常乳腺组织中表达阴性，而在乳腺癌中表达率高达46.24%，且Cath-D的表达与肿瘤大小及淋巴结转移率均明显相关，统计学上意义显著。肿瘤大小及淋巴结转移率正是反映了肿瘤局部生长、浸润能力及沿淋巴道的转移能力。因此提示Cath-D表达阳性的乳腺癌具有更强的侵袭、转移能力，预后较差。
, 百拇医药
Tosi等研究了乳腺浸润性导管癌的核分裂指数、核面积均值及标准差与患者的生存年限呈现负相关，所测得的值越大，生存年限越短[4]。Ramachandre等研究了癌基因c-rebB-2的表达与癌细胞各种形态学指标的关系，发现癌细胞的核越大，c-rebB-2的表达率越高，癌细胞的恶性程度越高，生长繁殖能力越强[5]。本实验测得了Cath-D表达阳性及阴性的乳腺浸润性导管癌细胞各种形态学指标，发现Cath-D表达阳性的癌细胞的核面积、核周长及核浆比均比Cath-D阴性癌细胞大，统计学上意义显著。从另一角度提供了癌细胞恶性程度高的客观指标。对此，我们认为Cath-D可以作为反映乳腺癌细胞增殖状态的细胞生物学因子，Cath-D的过度表达提示乳腺癌恶性程度高、预后差，对这类乳腺癌患者有必要加大术后化疗剂量、增加化疗及随访次数，防止复发。
①吉林省人民医院，长春130021
作者简介：崔猛胜，男，34岁，硕士，现在长治医院附院普外科；
, 百拇医药
刘秉义，男，56岁，教授，主要从事肝病，乳腺肿瘤的研究
4 参考文献
[1] Stein M, Braulke T, Figura K et al. Effects of differcentiation-inclucing ageuts on synthesis, maturation and secretion of cathepsin D in 11937 and H1-60 cells. Biol chem Hoppe Scyler, 1987;368:413
[2] Mc Guire W L, Tandon A K, Allred D C et al. Prognosis and treadment decision in Patients with breast cancer withour axillary node involvment. Cancer， 1992;70:1775
, http://www.100md.com
[3] Spyratos F, Mardelonds T, Brouillet J P et al. Cathepsin D. Auimprotant marker predicting matastasis in primary breast cancer. Lancet, 1989;2:1115
[4] Tosi P. Correlation between morphometrical parameters and discase-free survival in ductal breast cancer treated only by surgery. Appl Pathol， 1986;4:33
[5] Ramachandre S, Machin L, Ashley S et al. Immunohistoch emical distrbution of c-erbB-2 in situ breast carcinoma-A detailed morphological analysis. J Pathol， 1990;161：7
〔收稿1997-04-10 三次修回1998-09-25〕, 百拇医药