IL-3、G-CSF拮抗Ara-c诱导的白血病细胞凋亡的研究
作者：俞 康 吴建波 沈志坚 胡晓霞 郭守芳
单位：俞 康 吴建波 沈志坚 胡晓霞 (温州医学院附属第一医院血液学研究室，温州 325000)；郭守芳 (吉林省中医中药研究院，长春130021)
关键词：凋亡；白细胞介素3；粒细胞集落刺激因子
中国免疫学杂志/990511 摘 要 目的：研究不同Ara-c浓度时白血病细胞凋亡的情况和G-CSF、IL-3+G-CSF对其的拮抗作用。方法：分别用不同剂量Ara-c诱导白血病细胞凋亡，同时加G-CSF、IL-3+G-CSF作为拮抗剂，分G-CSF、IL-3+G-CSF、Ara-c三组。通过形态学、DNA电泳、蛋白电泳免疫印迹法观察白血病细胞的凋亡情况。结果：随着Ara-c剂量的增加，凋亡细胞数增高。G-CSF能拮抗低剂量及常规剂量Ara-c诱导的凋亡，但不能完全拮抗中剂量Ara-c，而IL-3+G-CSF能拮抗中剂量Ara-c。Bcl-2表达蛋白IL-3+G-CSF组高于G-CSF组，G-CSF组高于Ara-c组。结论：IL-3、G-CSF能拮抗Ara-c诱导的白血病细胞凋亡。调节Bcl-2基因的表达是细胞因子拮抗凋亡的机制之一。临床应合理、适时地使用细胞因子。
, 百拇医药
中国图书分类号 R733.702 R331.1
The inhibitory effect of IL-3, G-CSF on
the apoptosis of leukemia cell induced by Ara-c
YU Kang, WU Jian-Bo, SHEN Zhi-Jian et al.
Department of Hematology of the First Hospital Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000
Abstract Objective: To study apoptosis of leukemia cell under vary concentratin of Ara-c and the inhibitory effect of G-CSF,IL-3+G-CSF. Methods: Observed the number of apoptotic cell in leukemia induced by vary concentration of Ara-c in morphology, DNA electrophoresis, immunoblotting. There were three groups: Ara-c, G-CSF and IL-3+G-CSF. Results: The number of apoptotic cell was increased while the dose of Ara-c araised. CSF can inhibit apoptosis by low and regular dose Ara-c, but can not complete inhibit the middle dose Ara-c. IL-3+G-CSF can do it. The protein expressed by Bcl-2 in IL-3+G-CSF group is higher than that in G-CSF group, G-CSF group is lower than Ara-c group. Conclusion: This indicate that IL-3, G-CSF can inhibit apoptosis of leukemia cell induced by Ara-c and regulation of Bcl-2 gene expression is the one of mechanism of cytokine inhibiting apoptosis. The results suggest that cytokine be used reasonably and timely in order to gain more effective chemical treatment.
, 百拇医药
Key words Apoptosis IL-3 G-CSF
阿糖胞苷(Ara-c)是在髓细胞白血病化疗中广为使用的抗代谢药物，近年研究表明，作用于核酸代谢不同环节的药物均能诱导肿瘤细胞的凋亡，凋亡亦是抗肿瘤药物杀灭肿瘤细胞的重要机制之一，而促细胞生长因子包括白介素3(IL-3)、粒细胞集落生长因子(G-CSF)均有明显抑制凋亡的作用。为探讨更合理地应用化疗药物及细胞生长因子，本文研究了不同浓度的Ara-c诱导新鲜白血病细胞的凋亡及IL-3、G-CSF对凋亡的拮抗作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象 选择经骨髓形态学及组织化学、免疫组织化学分型(按白血病国内诊断标准)确诊的未治疗者，M1 2例、M2 10例、M3 4例、M4 14例、M5 4例。
, 百拇医药
1.2 实验方法 取肝素抗凝骨髓5 ml，用Ficoll(上海试剂二厂)分离单个核细胞，用15%FCS(华美产品)、RPMI 1640培养液(GIBCO产品)调整细胞浓度为1×107 ml-1，置24孔培养板(丹麦NUNCLON)中。用RPMI 1640配制Ara-c溶液(上海联华制药厂)，加入Ara-c组培养孔中，使各孔终浓度分别为10、100、1 000 μg/ml。IL-3+G-CSF组和G-CSF组则再加IL-3(上海源东产品)，使其终浓度为1×104 U/ml。Ara-c组加入等量的RPMI 1640，37℃ 5%CO2培养24 h。
形态学观察：收集培养细胞，离心涂片，Wright-Giemsa染色光镜下观察计数300个细胞，发现有核固缩、染色体凝聚和凋亡小体形成等特征，为凋亡细胞，并计算百分率。
细胞DNA电泳：分别收集各组含100 μg/ml Ara-c 孔的细胞。PBS洗涤2次，用Sep Genen DNA提取试剂盒(Promega产品)提取DNA。紫外分光光度计定量后，取样与加样缓冲液混合后，10%聚丙烯凝胶电泳，银染观察。
, 百拇医药
蛋白印迹免疫检测：分别收集各组含100 μg/ml Ara-c孔的细胞。PBS洗 3 次，用1 ml细胞溶解液溶解(2%SDS，0.15 mol/L NaCl， 10 μmol Tris，1 mmol/L EDTA)4℃ 30 min，用总蛋白测定试剂盒(Sigma)分光光度计测定含量，每份取50 μg，煮沸变性于10% SDS-PAGE电泳，电泳后电转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，并用封闭液(1%脱脂奶粉，0.01%Antifoam A， 0.02%叠氮钠)封闭2 h后，与Bcl-2单抗(1∶100，DoKo)孵育3 h，PBS洗3次，每次10 min，加入二抗为HRP-抗鼠IgG抗体(1∶1 000，华美产品)，室温下轻轻振荡1 h，缓冲液(150 mmol/L NaCl，50 mmol/L TrisCl，pH7.5)洗 3 次。用二氨基联苯胺(DAB)显色。
2 结果
2.1 凋亡细胞形态学观察 见表1。Ara-c组随Ara-c浓度升高，凋亡细胞增多，1 000 μg/ml时凋亡细胞达(45+6.2)%。G-CSF能拮抗低剂量Ara-c诱导的凋亡，但不能完全拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。IL-3+G-CSF能拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。
, 百拇医药
2.2 DNA凝胶电泳 Ara-c组(100 μg/ml)34例均发生DNA断裂，形成以200 bp左右为最小单位的典型DNA“梯形”图像。G-CSF组34例仅17例见到DNA“梯形”电泳图像，明显少于Ara-c组。IL-3+G-CSF组34例中9例见到较典型DNA“梯形”图像，明显低于前两组，见图1。对照组34例中未见DNA“梯形”图像。
图1 Ara-c诱导的白血病细胞凋亡
Fig.1 The apoptosis of leukemia cell induced by Ara-c
Note:1.DNA marker;2.Ara-c(100 μg/ml);3.G-CSF+Ara-c;4.IL-3+G-CSF+Ara-c
, 百拇医药 2.3 Bcl-2基因表达 对照组32例出现深棕色的Bcl-2表达蛋白带。Ara-c组19例存在染色变浅的表达蛋白带。G-CSF组26例出现Bcl-2表达蛋白带，其中大部分染色变浅。IL-3+G-CSF组24例存在Bcl-2表达蛋白带，表现同G-CSF组，见图2。
图2 蛋白印迹免疫法显示Bcl-2表达
Fig.2 The expression of Bcl-2 by immunoblotting
Note:A：1,3.control group;2.Ara-c(100 μg/ml);4.G-CSF+Ara-c;5,6.IL-3+G-CSF+Ara-c；B：the content of β-actin as control
表1 IL-3、G-CSF拮抗Ara-c诱导细胞凋亡率
, 百拇医药
Tab.1 IL-3，G-CSF inhibit the rate of cell apoptosis induced by Ara-c Group
The content of Ara-c(μg/ml)
10
P
100
P
1 000
P
Ara-c
9.6±5.4
23.8±3.4
, http://www.100md.com
45.0±6.2
<0.01
<0.01
<0.05
G-CSF
3.1±1.6
8.5±2.8
37.0±7.4
<0.05
<0.05
<0.01
G-CSF+IL-3
, 百拇医药
2.5±1.8
6.8±3.0
18.4±5.2
3 讨论
近几年研究证明抗肿瘤化疗药物、肿瘤诱导分化剂、某些细胞因子等均可诱导某些种类的肿瘤细胞凋亡，从而发挥治疗作用。本文选用髓性白血病化疗中应用最为广泛的Ara-c作为凋亡诱导剂，并以10、100、1 000 μg/ml分别代表小剂量、常规剂量、中剂量Ara-c[1]，发现随Ara-c的浓度增高，凋亡细胞也随之增加。凋亡是Ara-c杀伤肿瘤细胞的重要机制之一，Ara-c杀灭肿瘤也不仅限于S期。化疗诱导的凋亡可能与其下调C-myc、Bcl-2的表达有关。Keith等发现Ara-c耐药白血病细胞株具有Bcl-2的高表达[2]。用反义寡核苷酸处理该细胞后，对Ara-c的敏感性明显增加，细胞增殖被抑制，细胞凋亡明显增多。本文也观察到在常规剂量Ara-c时Bcl-2基因蛋白表达明显减少，因此说明Ara-c诱导凋亡肯定与Bcl-2基因蛋白表达下调有关。是否如文献中报道的，有激活促凋亡基因Bax使其表达增加或减少Bcl-2基因蛋白与Bax蛋白结合形成异二聚体，减轻了Bax的促凋亡作用[3]，我们尚未作该方面的深入研究。IL-3又称多集落刺激因子(Multi-CSF)，具有作用的靶细胞起源早、范围广等特点。IL-3与G-CSF、GM-CSF及EPO之间有协同作用。有人报道在IL-3与G-CSF的协同作用下，G-CFU集落形成显著增多。G-CSF、GM-CSF、IL-3等造血刺激因子能为白血病细胞提供生长刺激信号、拮抗细胞凋亡[4]。该拮抗作用与上调Bcl-2基因表达增强抗药能力有关。本文也观察到G-CSF有拮抗Ara-c诱导白血病细胞凋亡作用，但不能完全拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。而IL-3与G-CSF的协同作用基本能拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。同时也观察到G-CSF及IL-3+G-CSF均能明显使Bcl-2基因蛋白表达增加，而抑制了凋亡的发生，与文献报道一致。因此提示临床工作中足量使用Ara-c尤为重要。在条件许可下尽量使用较大剂量Ara-c，能提高化疗的疗效。同时提醒，适量、适时、慎重使用各种细胞刺激因子与化疗的成败有一定的关系。
, http://www.100md.com
作者简介：俞 康，男，36岁，副主任医师，副教授，主要从事实验血液学和临床血液学工作
4 参考文献
[1] 达万明.体外快速测定急性白血病细胞药物敏感性的初步报告.中华内科杂志，1982; 21(2)：109
[2] Keith F J,Bradbung D A,Zhu Y M et al. Inhibition of bcl-2 with antisense oligonucleotides induces apoptosis and increase the sensitivity of AML blasts to Ara-c.Leukemia，1995；8:131
[3] Hanada M,Aime-sempe C,Sato T et al. Structure function analysis of bcl-2 protein identification of conserved domains important for homodimerization with bcl-2 and heterodimerization with Bax. J Biol Chem，1995；270:11962
[4] 杨开颜，俞 康，沈志坚 et al.GM-CSF对TNF诱导白血病细胞凋亡的抑制作用.上海免疫学杂志，1997；17(3)：182
〔收稿1998-08-21 修回1998-11-16〕, 百拇医药
单位：俞 康 吴建波 沈志坚 胡晓霞 (温州医学院附属第一医院血液学研究室，温州 325000)；郭守芳 (吉林省中医中药研究院，长春130021)
关键词：凋亡；白细胞介素3；粒细胞集落刺激因子
中国免疫学杂志/990511 摘 要 目的：研究不同Ara-c浓度时白血病细胞凋亡的情况和G-CSF、IL-3+G-CSF对其的拮抗作用。方法：分别用不同剂量Ara-c诱导白血病细胞凋亡，同时加G-CSF、IL-3+G-CSF作为拮抗剂，分G-CSF、IL-3+G-CSF、Ara-c三组。通过形态学、DNA电泳、蛋白电泳免疫印迹法观察白血病细胞的凋亡情况。结果：随着Ara-c剂量的增加，凋亡细胞数增高。G-CSF能拮抗低剂量及常规剂量Ara-c诱导的凋亡，但不能完全拮抗中剂量Ara-c，而IL-3+G-CSF能拮抗中剂量Ara-c。Bcl-2表达蛋白IL-3+G-CSF组高于G-CSF组，G-CSF组高于Ara-c组。结论：IL-3、G-CSF能拮抗Ara-c诱导的白血病细胞凋亡。调节Bcl-2基因的表达是细胞因子拮抗凋亡的机制之一。临床应合理、适时地使用细胞因子。
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中国图书分类号 R733.702 R331.1
The inhibitory effect of IL-3, G-CSF on
the apoptosis of leukemia cell induced by Ara-c
YU Kang, WU Jian-Bo, SHEN Zhi-Jian et al.
Department of Hematology of the First Hospital Wenzhou Medical College, Wenzhou 325000
Abstract Objective: To study apoptosis of leukemia cell under vary concentratin of Ara-c and the inhibitory effect of G-CSF,IL-3+G-CSF. Methods: Observed the number of apoptotic cell in leukemia induced by vary concentration of Ara-c in morphology, DNA electrophoresis, immunoblotting. There were three groups: Ara-c, G-CSF and IL-3+G-CSF. Results: The number of apoptotic cell was increased while the dose of Ara-c araised. CSF can inhibit apoptosis by low and regular dose Ara-c, but can not complete inhibit the middle dose Ara-c. IL-3+G-CSF can do it. The protein expressed by Bcl-2 in IL-3+G-CSF group is higher than that in G-CSF group, G-CSF group is lower than Ara-c group. Conclusion: This indicate that IL-3, G-CSF can inhibit apoptosis of leukemia cell induced by Ara-c and regulation of Bcl-2 gene expression is the one of mechanism of cytokine inhibiting apoptosis. The results suggest that cytokine be used reasonably and timely in order to gain more effective chemical treatment.
, 百拇医药
Key words Apoptosis IL-3 G-CSF
阿糖胞苷(Ara-c)是在髓细胞白血病化疗中广为使用的抗代谢药物，近年研究表明，作用于核酸代谢不同环节的药物均能诱导肿瘤细胞的凋亡，凋亡亦是抗肿瘤药物杀灭肿瘤细胞的重要机制之一，而促细胞生长因子包括白介素3(IL-3)、粒细胞集落生长因子(G-CSF)均有明显抑制凋亡的作用。为探讨更合理地应用化疗药物及细胞生长因子，本文研究了不同浓度的Ara-c诱导新鲜白血病细胞的凋亡及IL-3、G-CSF对凋亡的拮抗作用。
1 材料与方法
1.1 研究对象 选择经骨髓形态学及组织化学、免疫组织化学分型(按白血病国内诊断标准)确诊的未治疗者，M1 2例、M2 10例、M3 4例、M4 14例、M5 4例。
, 百拇医药
1.2 实验方法 取肝素抗凝骨髓5 ml，用Ficoll(上海试剂二厂)分离单个核细胞，用15%FCS(华美产品)、RPMI 1640培养液(GIBCO产品)调整细胞浓度为1×107 ml-1，置24孔培养板(丹麦NUNCLON)中。用RPMI 1640配制Ara-c溶液(上海联华制药厂)，加入Ara-c组培养孔中，使各孔终浓度分别为10、100、1 000 μg/ml。IL-3+G-CSF组和G-CSF组则再加IL-3(上海源东产品)，使其终浓度为1×104 U/ml。Ara-c组加入等量的RPMI 1640，37℃ 5%CO2培养24 h。
形态学观察：收集培养细胞，离心涂片，Wright-Giemsa染色光镜下观察计数300个细胞，发现有核固缩、染色体凝聚和凋亡小体形成等特征，为凋亡细胞，并计算百分率。
细胞DNA电泳：分别收集各组含100 μg/ml Ara-c 孔的细胞。PBS洗涤2次，用Sep Genen DNA提取试剂盒(Promega产品)提取DNA。紫外分光光度计定量后，取样与加样缓冲液混合后，10%聚丙烯凝胶电泳，银染观察。
, 百拇医药
蛋白印迹免疫检测：分别收集各组含100 μg/ml Ara-c孔的细胞。PBS洗 3 次，用1 ml细胞溶解液溶解(2%SDS，0.15 mol/L NaCl， 10 μmol Tris，1 mmol/L EDTA)4℃ 30 min，用总蛋白测定试剂盒(Sigma)分光光度计测定含量，每份取50 μg，煮沸变性于10% SDS-PAGE电泳，电泳后电转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，并用封闭液(1%脱脂奶粉，0.01%Antifoam A， 0.02%叠氮钠)封闭2 h后，与Bcl-2单抗(1∶100，DoKo)孵育3 h，PBS洗3次，每次10 min，加入二抗为HRP-抗鼠IgG抗体(1∶1 000，华美产品)，室温下轻轻振荡1 h，缓冲液(150 mmol/L NaCl，50 mmol/L TrisCl，pH7.5)洗 3 次。用二氨基联苯胺(DAB)显色。
2 结果
2.1 凋亡细胞形态学观察 见表1。Ara-c组随Ara-c浓度升高，凋亡细胞增多，1 000 μg/ml时凋亡细胞达(45+6.2)%。G-CSF能拮抗低剂量Ara-c诱导的凋亡，但不能完全拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。IL-3+G-CSF能拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。
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2.2 DNA凝胶电泳 Ara-c组(100 μg/ml)34例均发生DNA断裂，形成以200 bp左右为最小单位的典型DNA“梯形”图像。G-CSF组34例仅17例见到DNA“梯形”电泳图像，明显少于Ara-c组。IL-3+G-CSF组34例中9例见到较典型DNA“梯形”图像，明显低于前两组，见图1。对照组34例中未见DNA“梯形”图像。
图1 Ara-c诱导的白血病细胞凋亡
Fig.1 The apoptosis of leukemia cell induced by Ara-c
Note:1.DNA marker;2.Ara-c(100 μg/ml);3.G-CSF+Ara-c;4.IL-3+G-CSF+Ara-c
, 百拇医药 2.3 Bcl-2基因表达 对照组32例出现深棕色的Bcl-2表达蛋白带。Ara-c组19例存在染色变浅的表达蛋白带。G-CSF组26例出现Bcl-2表达蛋白带，其中大部分染色变浅。IL-3+G-CSF组24例存在Bcl-2表达蛋白带，表现同G-CSF组，见图2。
图2 蛋白印迹免疫法显示Bcl-2表达
Fig.2 The expression of Bcl-2 by immunoblotting
Note:A：1,3.control group;2.Ara-c(100 μg/ml);4.G-CSF+Ara-c;5,6.IL-3+G-CSF+Ara-c；B：the content of β-actin as control
表1 IL-3、G-CSF拮抗Ara-c诱导细胞凋亡率
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Tab.1 IL-3，G-CSF inhibit the rate of cell apoptosis induced by Ara-c Group
The content of Ara-c(μg/ml)
10
P
100
P
1 000
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Ara-c
9.6±5.4
23.8±3.4
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45.0±6.2
<0.01
<0.01
<0.05
G-CSF
3.1±1.6
8.5±2.8
37.0±7.4
<0.05
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<0.01
G-CSF+IL-3
, 百拇医药
2.5±1.8
6.8±3.0
18.4±5.2
3 讨论
近几年研究证明抗肿瘤化疗药物、肿瘤诱导分化剂、某些细胞因子等均可诱导某些种类的肿瘤细胞凋亡，从而发挥治疗作用。本文选用髓性白血病化疗中应用最为广泛的Ara-c作为凋亡诱导剂，并以10、100、1 000 μg/ml分别代表小剂量、常规剂量、中剂量Ara-c[1]，发现随Ara-c的浓度增高，凋亡细胞也随之增加。凋亡是Ara-c杀伤肿瘤细胞的重要机制之一，Ara-c杀灭肿瘤也不仅限于S期。化疗诱导的凋亡可能与其下调C-myc、Bcl-2的表达有关。Keith等发现Ara-c耐药白血病细胞株具有Bcl-2的高表达[2]。用反义寡核苷酸处理该细胞后，对Ara-c的敏感性明显增加，细胞增殖被抑制，细胞凋亡明显增多。本文也观察到在常规剂量Ara-c时Bcl-2基因蛋白表达明显减少，因此说明Ara-c诱导凋亡肯定与Bcl-2基因蛋白表达下调有关。是否如文献中报道的，有激活促凋亡基因Bax使其表达增加或减少Bcl-2基因蛋白与Bax蛋白结合形成异二聚体，减轻了Bax的促凋亡作用[3]，我们尚未作该方面的深入研究。IL-3又称多集落刺激因子(Multi-CSF)，具有作用的靶细胞起源早、范围广等特点。IL-3与G-CSF、GM-CSF及EPO之间有协同作用。有人报道在IL-3与G-CSF的协同作用下，G-CFU集落形成显著增多。G-CSF、GM-CSF、IL-3等造血刺激因子能为白血病细胞提供生长刺激信号、拮抗细胞凋亡[4]。该拮抗作用与上调Bcl-2基因表达增强抗药能力有关。本文也观察到G-CSF有拮抗Ara-c诱导白血病细胞凋亡作用，但不能完全拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。而IL-3与G-CSF的协同作用基本能拮抗中剂量Ara-c诱导的凋亡。同时也观察到G-CSF及IL-3+G-CSF均能明显使Bcl-2基因蛋白表达增加，而抑制了凋亡的发生，与文献报道一致。因此提示临床工作中足量使用Ara-c尤为重要。在条件许可下尽量使用较大剂量Ara-c，能提高化疗的疗效。同时提醒，适量、适时、慎重使用各种细胞刺激因子与化疗的成败有一定的关系。
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作者简介：俞 康，男，36岁，副主任医师，副教授，主要从事实验血液学和临床血液学工作
4 参考文献
[1] 达万明.体外快速测定急性白血病细胞药物敏感性的初步报告.中华内科杂志，1982; 21(2)：109
[2] Keith F J,Bradbung D A,Zhu Y M et al. Inhibition of bcl-2 with antisense oligonucleotides induces apoptosis and increase the sensitivity of AML blasts to Ara-c.Leukemia，1995；8:131
[3] Hanada M,Aime-sempe C,Sato T et al. Structure function analysis of bcl-2 protein identification of conserved domains important for homodimerization with bcl-2 and heterodimerization with Bax. J Biol Chem，1995；270:11962
[4] 杨开颜，俞 康，沈志坚 et al.GM-CSF对TNF诱导白血病细胞凋亡的抑制作用.上海免疫学杂志，1997；17(3)：182
〔收稿1998-08-21 修回1998-11-16〕, 百拇医药