一种可同时检测抗双链和单链DNA抗体的快速斑点免疫金渗滤试验
作者：兰小鹏 涂向东 黄俏佳 冯修高 唐玉钗 朱忠勇 周明宣① 陈学香①
单位：兰小鹏 涂向东 黄俏佳 冯修高 唐玉钗 朱忠勇 周明宣① 陈学香①(南京军区福州总医院全军医学检验中心，福州350001)
关键词：抗双链DNA抗体；抗单链DNA抗体；斑点免疫金渗滤试验
中国免疫学杂志/990509 摘 要 目的：建立一种可同时检测抗双链DNA(ds-DNA)和单链DNA(ss-DNA)抗体的快速斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)。方法：将ds-DNA和ss-DNA抗原结合在同一检测盒内，采用胶体金标记和快速膜斑点渗滤技术，同时检测抗ds-DNA和ss-DNA抗体。结果：DIGFA既可同步又可区别检测两种DNA抗体，且检测ds-DNA抗体的敏感性优于酶联免疫吸附法(ELISA)。结论：DIGFA简便、快速、可靠，是一种实用的DNA抗体检测方法。
, 百拇医药
中国图书分类号 R446.62
A rapid dot immunogold filtration assay for the simultaneous detection of ds-DNA and ss-DNA antibodies
LAN Xiao-Peng,TU Xiang-Dong,HUANG Qiao-Jia et al.
Medical Laboratory Centre,Fuzhou General Hospital,Fuzhou 350001
Abstract Objective:To develope a rapid dot immunogold filtration assay(DIGFA)for the simultaneous detection of antidouble stranded DNA (ds-DNA) and single-stranded DNA(ss-DNA) antibodies.Methods:ds-DNA and ss-DNA antigens being incorporated in a sam test kit, a novel DIGFA for the simultaneous detection of anti-ds-DNA and ss-DNA antibodies was established.Results:The test showed that the DIGFA could not only distinguish anti-ds-DNA from anti-ss-DNA antibodies but also simplify the procedure of the detection.The DIGFA was more sensitive and specific than enzyme-linked immunoabsorbent assay(ELISA).Conclusion:The DIGFA described was rapid,simple and repreducible and was a practical assay for the detection of anti-ds-DNA and ss-DNA antibodies.
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Key words Anti-ds-DNA antibodies Anti-ss-DNA antibodies Dot immunogold filtration assay
DNA抗体可分为抗双链DNA(ds-DNA)和单链DNA(ss-DNA)两种，前者一般仅见于全身性红斑狼疮(SLE)，具有较高的特异性；后者可见于多种自身免疫性疾病，特异性较低。二者结合起来，有助于SLE和多种自身免疫病的诊断及鉴别诊断。本研究将ds-DNA和ss-DNA组合在同一个检测盒内，采用胶体金标记和快速膜斑点渗滤技术，建立了一种可同时检测抗ds-DNA和ss-DNA抗体的快速斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold filtration assay,DIGFA)。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和材料 含质粒pBR322的大肠杆菌(福建医学院包幼迪教授惠赠)。MagicTM DNA纯化系统(Promega产品)。卵亲和素、光敏生物素(军事医学科学院产品)。小牛胸腺DNA(CT.DNA，华美产品)。葡萄球菌蛋白A(SPA，上海生物制品研究所产品)。牛血清白蛋白(BSA，德国Boehringer产品)。硝酸纤维素膜(NC 0.45 μm，黄岩生化材料厂产品)。抗ds-DNA和ss-DNA抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海二医大科技服务部)。
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1.2 血清标本 确诊的SLE病人50例；混合结缔组织病(MCTD)10例；类风湿性关节炎(RA)15例；硬皮病(PSS)12例；干燥综合征(SS)8例；多发性肌炎(PM)和皮肌炎(DM)14例；慢性肝病(CLD)20例；正常人200例，常规取静脉血，分离血清。
1.3 ds-DNA的提取及生物素标记 见文献[1，2]。
1.4 ss-DNA的制备 取CT.DNA 10 ml、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，在4℃连续搅拌24 h，待完全溶解后，置100℃水浴10 min，再迅速转移至冰浴中冷却，放4℃备用。
1.5 ds-DNA和ss-DNA抗原膜的制备 ds-DNA抗原点的制备见文献[2]。在膜的另一处用ss-DNA(50 μg/ml)直接点样。在ds-DNA和ss-DNA两点之间，包被一杠状的人IgG(100 μg/ml)，2%BSA封闭。
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1.6 抗ds-DNA和ss-DNA抗体检测盒的制备 参见文献[3]。
1.7 胶体金标记SPA的制备 参见文献[4]。
1.8 DIGFA检测方法 见文献[3]。结果判断：反应孔内出现一红色杠和两个斑点：抗ds-DNA阳性或抗ds-DNA和ss-DNA均为阳性；出现一红色杠和一个斑点：单项抗ss-DNA阳性；只出现红色杠：抗ds-DNA 和ss-DNA均为阴性；无任何显示为检测无效。
1.9 ELISA法测抗ds-DNA和ss-DNA抗体 按试剂盒的操作说明书进行。
2 结果
2.1 中和试验 ds-DNA和ss-DNA抗体均阳性及单项ss-DNA抗体阳性的血清分别加入ds-DNA和ss-DNA，在37℃中和1 h，加3%聚乙二醇，离心沉淀，上清液再用DIGFA检测，结果两种抗体均阳性的血清用ds-DNA中和后，ds-DNA抗体变为阴性，ss-DNA抗体仍为阳性，而用ss-DNA中和后则二者均变为阴性。单项ss-DNA抗体阳性的血清只能被ss-DNA中和。
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2.2 稳定性和重复性试验 检测盒分置4℃和室温保存，每隔1 w检测同一份抗ds-DNA和ss-DNA阳性的血清，结果4℃存放一年、室温半年，其结果均未改变。取强阳性和弱阳性血清各5份，分别重复测定5次，每次相隔1 w，测定结果也相同。
2.3 临床应用 用DIGFA检测了329份血清，结果见表1，在79例非SLE的自身免疫病人中，ds-DNA和ss-DNA抗体同时阳性的仅1例(1.2%)，ss-DNA抗体单项阳性17例(21.5%)；可见ds-DNA和ss-DNA抗体同时阳性一般仅见于SLE，而单项ss-DNA抗体阳性可见于非SLE的自身免疫病及少数正常人。
2.4 方法比较 各组血清标本同时用DIGFA和ELISA进行测定，结果见表1。DIGFA检测ds-DNANote:the digit in table indicated the positive number and positive rate(in brace)抗体的阳性率高于ELISA(经配对计数资料的t检验，P<0.05)，DIGFA的特异性也优于ELISA。
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表1 DIGFA和ELISA检测抗ds-DNA和ss-DNA抗体结果
Tab.1 The result of detection of anti-ds-DNA and ss-DNA antibodies by DIGFA and ELISA Group
n
DIGFA
ELISA
Anti-ds-DNA
and anti-ss-DNA
Anti-ss-DNA
Anti-ds-DNA
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Anti-ss-DNA
SLE
50
31(62.0)
6(12.0)
27(54.0)
32(64.0)
MCTD
10
1(10.0)
2(20.0)
1(10.0)
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3(30.0)
RA
15
0
4(26.6)
2(13.3)
5(33.3)
PSS
12
0
3(25.0)
1(8.3)
4(33.3)
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SS
8
0
2(25.0)
1(12.5)
2(25.0)
PM/DM
14
0
4(28.6)
2(14.3)
5(35.7)
CLD
, 百拇医药
20
0
2(10.0)
1(5.0)
2(10.0)
Normal
200
0
8(4.0)
5(2.5)
11(5.5)
3 讨论
文献表明抗ds-DNA与ss-DNA抗体有交叉反应，即ds-DNA抗体不仅可以与ds-DNA结合，还可以与ss-DNA结合，但ss-DNA抗体只能与ss-DNA结合[5，6]。结果显示当ds-DNA抗体阳性的时候，其ss-DNA抗体必然阳性，但ss-DNA抗体阳性时，ds-DNA抗体不一定阳性；ds-DNA抗体既可被ds-DNA又可被ss-DNA抑制，而ss-DNA抗体只能被ss-DNA所抑制,结果证实了两种抗体的交叉反应性。由于DNA是一种特殊的抗原分子，因此这种交叉反应机理还不完全清楚，可能是因为抗ds-DNA抗体的特异性不仅与ds-DNA分子中的碱基序列，而且与ds-DNA分子的空间构像有关。而抗ss-DNA抗体可能主要是针对碱基的。在高度螺旋化的ds-DNA分子中，疏水碱基位于分子中心，只暴露在距离不到1 nm的DNA分子双螺旋化所形成的沟槽内，因此单纯针对碱基的抗体无法进入这种又窄又深的沟槽，不能与之结合。我们曾报道用纯化的细菌质粒ds-DNA作为抗原来检测ds-DNA抗体[2，3]。考虑到原有的单纯以ss-DNA作为抗原来检测ss-DNA抗体的方法并不是检测真正意义上的抗ss-DNA抗体，而是包括了能与ss-DNA交叉反应的抗ds-DNA抗体，因此为了区别这两种抗体并简化其检测方法，我们在原有工作的基础上将ss-DNA和ds-DNA结合在同一检测盒内NC膜的不同位点上，同时检测ds-DNA和ss-DNA抗体，使原来需要分别检测的两个项目合二为一，在2 min内一次操作即可完成。结果显示，DIGFA不仅简便、快速，而且敏感性高、特异性强、方法稳定，是一种实用的DNA抗体检测方法。
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①福州总医院内科，福州350001
作者简介：兰小鹏，男，博士生，副主任技师，主要从事自身免疫和自身抗体方面的研究；
朱忠勇，男，主任技师，教授，硕士生导师，主要从事血液遗传等方面的研究
4 参考文献
[1] 徐 洵，刘震乾编.DNA重组技术.北京：科学出版社，1989:274-275
[2] 兰小鹏，朱忠勇.一种新的检测抗双链DNA抗体的斑点免疫结合试验.中华医学检验杂志，1995；17(3)：133
[3] 兰小鹏，黄俏佳，叶小芬 et al.用快速斑点免疫金渗滤法检测抗双链DNA抗体.中华医学检验杂志，1996；19(2)：92
, 百拇医药
[4] Slot J W.A new method of preparing gold probes for multiple labelling cytochemistry.Eur J Cell Biol,1985;38:87
[5] Emlen W,Jarusiripipat P,burdick G.A new ELISA for the detection of double-stranded DNA antibodies.J Immunol Methods,1990;132:91
[6] 兰小鹏.抗双链DNA抗体研究的若干进展.国外医学*免疫学分册，1994；17(6)：304
〔收稿1997-09-05 修回1998-05-06〕, 百拇医药
单位：兰小鹏 涂向东 黄俏佳 冯修高 唐玉钗 朱忠勇 周明宣① 陈学香①(南京军区福州总医院全军医学检验中心，福州350001)
关键词：抗双链DNA抗体；抗单链DNA抗体；斑点免疫金渗滤试验
中国免疫学杂志/990509 摘 要 目的：建立一种可同时检测抗双链DNA(ds-DNA)和单链DNA(ss-DNA)抗体的快速斑点免疫金渗滤试验(DIGFA)。方法：将ds-DNA和ss-DNA抗原结合在同一检测盒内，采用胶体金标记和快速膜斑点渗滤技术，同时检测抗ds-DNA和ss-DNA抗体。结果：DIGFA既可同步又可区别检测两种DNA抗体，且检测ds-DNA抗体的敏感性优于酶联免疫吸附法(ELISA)。结论：DIGFA简便、快速、可靠，是一种实用的DNA抗体检测方法。
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中国图书分类号 R446.62
A rapid dot immunogold filtration assay for the simultaneous detection of ds-DNA and ss-DNA antibodies
LAN Xiao-Peng,TU Xiang-Dong,HUANG Qiao-Jia et al.
Medical Laboratory Centre,Fuzhou General Hospital,Fuzhou 350001
Abstract Objective:To develope a rapid dot immunogold filtration assay(DIGFA)for the simultaneous detection of antidouble stranded DNA (ds-DNA) and single-stranded DNA(ss-DNA) antibodies.Methods:ds-DNA and ss-DNA antigens being incorporated in a sam test kit, a novel DIGFA for the simultaneous detection of anti-ds-DNA and ss-DNA antibodies was established.Results:The test showed that the DIGFA could not only distinguish anti-ds-DNA from anti-ss-DNA antibodies but also simplify the procedure of the detection.The DIGFA was more sensitive and specific than enzyme-linked immunoabsorbent assay(ELISA).Conclusion:The DIGFA described was rapid,simple and repreducible and was a practical assay for the detection of anti-ds-DNA and ss-DNA antibodies.
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Key words Anti-ds-DNA antibodies Anti-ss-DNA antibodies Dot immunogold filtration assay
DNA抗体可分为抗双链DNA(ds-DNA)和单链DNA(ss-DNA)两种，前者一般仅见于全身性红斑狼疮(SLE)，具有较高的特异性；后者可见于多种自身免疫性疾病，特异性较低。二者结合起来，有助于SLE和多种自身免疫病的诊断及鉴别诊断。本研究将ds-DNA和ss-DNA组合在同一个检测盒内，采用胶体金标记和快速膜斑点渗滤技术，建立了一种可同时检测抗ds-DNA和ss-DNA抗体的快速斑点免疫金渗滤试验(Dot immunogold filtration assay,DIGFA)。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和材料 含质粒pBR322的大肠杆菌(福建医学院包幼迪教授惠赠)。MagicTM DNA纯化系统(Promega产品)。卵亲和素、光敏生物素(军事医学科学院产品)。小牛胸腺DNA(CT.DNA，华美产品)。葡萄球菌蛋白A(SPA，上海生物制品研究所产品)。牛血清白蛋白(BSA，德国Boehringer产品)。硝酸纤维素膜(NC 0.45 μm，黄岩生化材料厂产品)。抗ds-DNA和ss-DNA抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海二医大科技服务部)。
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1.2 血清标本 确诊的SLE病人50例；混合结缔组织病(MCTD)10例；类风湿性关节炎(RA)15例；硬皮病(PSS)12例；干燥综合征(SS)8例；多发性肌炎(PM)和皮肌炎(DM)14例；慢性肝病(CLD)20例；正常人200例，常规取静脉血，分离血清。
1.3 ds-DNA的提取及生物素标记 见文献[1，2]。
1.4 ss-DNA的制备 取CT.DNA 10 ml、0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)中，在4℃连续搅拌24 h，待完全溶解后，置100℃水浴10 min，再迅速转移至冰浴中冷却，放4℃备用。
1.5 ds-DNA和ss-DNA抗原膜的制备 ds-DNA抗原点的制备见文献[2]。在膜的另一处用ss-DNA(50 μg/ml)直接点样。在ds-DNA和ss-DNA两点之间，包被一杠状的人IgG(100 μg/ml)，2%BSA封闭。
, 百拇医药
1.6 抗ds-DNA和ss-DNA抗体检测盒的制备 参见文献[3]。
1.7 胶体金标记SPA的制备 参见文献[4]。
1.8 DIGFA检测方法 见文献[3]。结果判断：反应孔内出现一红色杠和两个斑点：抗ds-DNA阳性或抗ds-DNA和ss-DNA均为阳性；出现一红色杠和一个斑点：单项抗ss-DNA阳性；只出现红色杠：抗ds-DNA 和ss-DNA均为阴性；无任何显示为检测无效。
1.9 ELISA法测抗ds-DNA和ss-DNA抗体 按试剂盒的操作说明书进行。
2 结果
2.1 中和试验 ds-DNA和ss-DNA抗体均阳性及单项ss-DNA抗体阳性的血清分别加入ds-DNA和ss-DNA，在37℃中和1 h，加3%聚乙二醇，离心沉淀，上清液再用DIGFA检测，结果两种抗体均阳性的血清用ds-DNA中和后，ds-DNA抗体变为阴性，ss-DNA抗体仍为阳性，而用ss-DNA中和后则二者均变为阴性。单项ss-DNA抗体阳性的血清只能被ss-DNA中和。
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2.2 稳定性和重复性试验 检测盒分置4℃和室温保存，每隔1 w检测同一份抗ds-DNA和ss-DNA阳性的血清，结果4℃存放一年、室温半年，其结果均未改变。取强阳性和弱阳性血清各5份，分别重复测定5次，每次相隔1 w，测定结果也相同。
2.3 临床应用 用DIGFA检测了329份血清，结果见表1，在79例非SLE的自身免疫病人中，ds-DNA和ss-DNA抗体同时阳性的仅1例(1.2%)，ss-DNA抗体单项阳性17例(21.5%)；可见ds-DNA和ss-DNA抗体同时阳性一般仅见于SLE，而单项ss-DNA抗体阳性可见于非SLE的自身免疫病及少数正常人。
2.4 方法比较 各组血清标本同时用DIGFA和ELISA进行测定，结果见表1。DIGFA检测ds-DNANote:the digit in table indicated the positive number and positive rate(in brace)抗体的阳性率高于ELISA(经配对计数资料的t检验，P<0.05)，DIGFA的特异性也优于ELISA。
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表1 DIGFA和ELISA检测抗ds-DNA和ss-DNA抗体结果
Tab.1 The result of detection of anti-ds-DNA and ss-DNA antibodies by DIGFA and ELISA Group
n
DIGFA
ELISA
Anti-ds-DNA
and anti-ss-DNA
Anti-ss-DNA
Anti-ds-DNA
, http://www.100md.com
Anti-ss-DNA
SLE
50
31(62.0)
6(12.0)
27(54.0)
32(64.0)
MCTD
10
1(10.0)
2(20.0)
1(10.0)
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3(30.0)
RA
15
0
4(26.6)
2(13.3)
5(33.3)
PSS
12
0
3(25.0)
1(8.3)
4(33.3)
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SS
8
0
2(25.0)
1(12.5)
2(25.0)
PM/DM
14
0
4(28.6)
2(14.3)
5(35.7)
CLD
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20
0
2(10.0)
1(5.0)
2(10.0)
Normal
200
0
8(4.0)
5(2.5)
11(5.5)
3 讨论
文献表明抗ds-DNA与ss-DNA抗体有交叉反应，即ds-DNA抗体不仅可以与ds-DNA结合，还可以与ss-DNA结合，但ss-DNA抗体只能与ss-DNA结合[5，6]。结果显示当ds-DNA抗体阳性的时候，其ss-DNA抗体必然阳性，但ss-DNA抗体阳性时，ds-DNA抗体不一定阳性；ds-DNA抗体既可被ds-DNA又可被ss-DNA抑制，而ss-DNA抗体只能被ss-DNA所抑制,结果证实了两种抗体的交叉反应性。由于DNA是一种特殊的抗原分子，因此这种交叉反应机理还不完全清楚，可能是因为抗ds-DNA抗体的特异性不仅与ds-DNA分子中的碱基序列，而且与ds-DNA分子的空间构像有关。而抗ss-DNA抗体可能主要是针对碱基的。在高度螺旋化的ds-DNA分子中，疏水碱基位于分子中心，只暴露在距离不到1 nm的DNA分子双螺旋化所形成的沟槽内，因此单纯针对碱基的抗体无法进入这种又窄又深的沟槽，不能与之结合。我们曾报道用纯化的细菌质粒ds-DNA作为抗原来检测ds-DNA抗体[2，3]。考虑到原有的单纯以ss-DNA作为抗原来检测ss-DNA抗体的方法并不是检测真正意义上的抗ss-DNA抗体，而是包括了能与ss-DNA交叉反应的抗ds-DNA抗体，因此为了区别这两种抗体并简化其检测方法，我们在原有工作的基础上将ss-DNA和ds-DNA结合在同一检测盒内NC膜的不同位点上，同时检测ds-DNA和ss-DNA抗体，使原来需要分别检测的两个项目合二为一，在2 min内一次操作即可完成。结果显示，DIGFA不仅简便、快速，而且敏感性高、特异性强、方法稳定，是一种实用的DNA抗体检测方法。
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①福州总医院内科，福州350001
作者简介：兰小鹏，男，博士生，副主任技师，主要从事自身免疫和自身抗体方面的研究；
朱忠勇，男，主任技师，教授，硕士生导师，主要从事血液遗传等方面的研究
4 参考文献
[1] 徐 洵，刘震乾编.DNA重组技术.北京：科学出版社，1989:274-275
[2] 兰小鹏，朱忠勇.一种新的检测抗双链DNA抗体的斑点免疫结合试验.中华医学检验杂志，1995；17(3)：133
[3] 兰小鹏，黄俏佳，叶小芬 et al.用快速斑点免疫金渗滤法检测抗双链DNA抗体.中华医学检验杂志，1996；19(2)：92
, 百拇医药
[4] Slot J W.A new method of preparing gold probes for multiple labelling cytochemistry.Eur J Cell Biol,1985;38:87
[5] Emlen W,Jarusiripipat P,burdick G.A new ELISA for the detection of double-stranded DNA antibodies.J Immunol Methods,1990;132:91
[6] 兰小鹏.抗双链DNA抗体研究的若干进展.国外医学*免疫学分册，1994；17(6)：304
〔收稿1997-09-05 修回1998-05-06〕, 百拇医药