抗β2GPI抗体与抗磷脂抗体综合征的相关性研究①
作者：曹文华 杨翰仪
单位：曹文华 杨翰仪 (白求恩医科大学基础生物化学与分子生物学教研室，长春130021)
关键词：β2糖尿白-Ⅰ；抗磷脂抗体综合征；抗β2糖蛋白-Ⅰ抗体
中国免疫学杂志/990517 摘 要 目的：探讨αβ2GPI在抗磷脂抗体综合征中诱导抗体产生的机制。方法：随机抽取活动期SLE患者60例，采用ELISA法测定血清中αβ2GPI。结果：发现与正常对照组相比SLE组αβ2GPI水平明显升高(P<0.001)。以x+3s为正常值上限，阳性率高达95%，显示αβ2GPI与SLE有显著相关性。结论：αβ2GPI是抗磷脂肮体综合征的重要标志。
中国图书分类号 Q513.2 R593.2
, http://www.100md.com
Association of anti-β2 glycoprotein I antibodies with antiphospholipid syndrome
CAO Wen-Hua , YANG Han-Yi.
Department of Biochemistry and Molecular Biology ,Norman Bethune University of Medical Sciences ,Changchun 130021
Abstract Objective: To in vestigate the role of αβ2GPI in antiphospholipid syndrome. Methods: An αβ2GPI ELISA was established to study the sera of 60 SLE patients, as well as 80 health bolld donors. Results: Elevated level of αβ2GPI was found in SLE group. The positive rate in SLE group is 95%. Conclusion: The result indicated αβ2GPI maybe a useful marker for the antiphospholipid syndrome.
, 百拇医药
Key words β2GPI Antiphospholipid syndrome(APS) αβ2GPI
抗磷脂抗体综合征(Antiphospho1ipid syndrome,APS)是80年代初发现的一种较为常见的自身免疫性疾病。APS患者实验室检查有高滴度的抗磷脂抗体(Antiphospholipid antibodies，APLAs)。APS典型的临床表现是系统性红斑狼疮(SLE)[1]。
目前国内外APS的检测主要测定的是ACA，但常规的ACA检测的方法中由于封闭液中有β2-糖蛋白-I(β2GPI)作为蛋白辅助因子的干扰，使得测定抗体的成分较复杂。为了更深入探讨和明确β2GPI在APS中诱导抗体产生的机制，我们在分离纯化人β2GPI的基础上，建立了测定单纯αβ2GPI的ELISA方法，并对αβ2GPI与APS的相关性进行了研究。
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1 材料与方法
1.1 研究对象 病例组为活动期SLE患者60例；对照组为不同年龄组正常健康体检者80名。
1.2 材料与试剂 人新鲜血浆(长春市中心血站)；Heparin Sepharose CL-6B(Pharmacia公司)；SDS-PAGE低分子量蛋白标准品(上海丽珠东风生物技术公司)；β2GPI标准品(牛津大学Yu Bingbin博士惠赠)；牛血清白蛋白(上海生物化学研究所)；羊抗人IgG-HRP(军事医学科学院微生物流行病研究所)；96孔酶标板(Nunc)；其它试剂均为国产分析纯。
1.3 方法
1.3.1 β2GPI的分离提取及鉴定 参考文献[2]，人血浆经高氯酸沉淀除杂蛋白，4℃ 12 000 r/min高速离心得上清。浓缩后上Heparin Sepharose CL-6B亲和层析柱，进行梯度洗脱。收集0.25 mol/L NaCl浓度下的洗脱峰，透析后冷冻干燥得β2GPI纯品。SDS-PAGE法测定纯度及分子量。
, 百拇医药
1.3.2 aβ2GPI ELISA法的确立 参照常规的ACA测定方法[3]，用含10 μg/ml β2GPI的pH 7.2 PBS 100 μl包被96孔板，4℃过夜。常法洗涤后用1%BSA封闭2 h。洗涤后加1∶50稀释的待测血清100 μl，37℃作用后洗涤。再加入羊抗人IgG-HRP(1∶800)，37℃孵育0.5 h，洗涤后加底物(OPD-H2O2)溶液，避光显色20 min,2 mol/L H2SO4终止反应，492 nm测吸光度(A)值。
1.3.3 数据处理方法及阳性标准 采用t检验；正常对照组均值加3倍标准差(x+3s)为正常上限。
2 结果
2.1 β2GPI的纯度及分子量 β2GPI经SDS-PAGE鉴定为一条带，与牛津大学标准品位置一致，分子量为46 kD，见图1。
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图1 纯化β2GPI的SDS-PAGE图谱
Fig.1 SDS-PAGE of purified β2GPI
Note：lane 1. low molecular weight protein marker; lane 2. standard β2GPI; lane 3. purified β2GPI
2.2 αβ2GPI的测定结果及阳性率 正常对照组均值为x＝0.732±0.048。以此为标准，SLE组αβ2GPI水平明显增高(P<0.001)。以0.732+3×0.048为正常上限，SLE组阳性率为95%(57/60)。
3 讨论
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1986年正式命名抗磷脂抗体综合征(APS)以来，国外学者对这种累及多器官的自身免疫性疾病进行的研究证实APS多伴有APLAs的异常，对大量临床资料的回顾性分析表明SLE患者的IgG型APLAs阳性率为6%～73%，平均为34%[4]。
十年多的研究中，临床上多采用测定ACA的ELISA法来进行APS的诊断，然而ACA测定的标准化问题一直困扰着人们[5]。虽然近年国外成立了一些ACA标准化实验室，但目前为止ACA测定的标准化问题仍未彻底解决,严重影响了APS的研究。
ACA检测方法的特异性和重复性都不甚满意，这其中一个很重要的原因是β2GPI的影响。自从1990年发现β2GPI是ACA与CL体外结合所必需的蛋白辅助因子以来[6，7]，ACA检测系统中采用的封闭液和包被液均含有小牛血清(其中含β2GPI)。这使得ACA检测系统中的抗原成分十分复杂，有单纯的CL、β2GPI、还有二者形成的复合物，而且其中β2GPI的量很难控制。测定的抗体也包含着多种复杂的成分：有直接针对CL的抗体，有针对二者复合物的抗体，还包含了αβ2GPI。我们认为，为进一步揭示β2GPI在APS中诱导抗体产生的机制，研究测定αβ2GPI与APS的关系是很有必要的。
, 百拇医药
目前国内有关APS的研究报道较少，有ACA检测试剂盒出品及少量的研究报道[8]。尚无有关αβ2GPI的测定及其与APS的关系的报道，本文采用自建的ELISA方法测定了SLE患者血清中的αβ2GPI水平，发现临床上具有典型症状的SLE患者中αβ2GPI水平明显升高，提示αβ2GPI与SLE等APS相关疾病具有很强的相关性，αβ2GPI很可能成为APS的标记分子。以x+3s为正常值上限，SLE病人血清中αβ2GPI阳性率高达95%，远远高于本课题组ACA检测的阳性率(待发表)。而且研究中发现与ACA的测定相比，αβ2GPI测定的重复性更好，特异性更高(待发表)。这些结果进一步提示αβ2GPI与APS的相关性很可能比ACA更密切，αβ2GPI很可能会成为SLE等APS相关疾病诊断和研究分析的重要的实验室指标。鉴于β2GPI在APS中诱导抗体产生的过程中起重要的作用以及αβ2GPI与APS的相关性比ACA更为密切，我们推测αβ2GPI很可能在APS的病理过程中起着某种关键性的作用，这一点尚有待于进一步深入研究证实。
, 百拇医药
①本课题受国家自然科学基金资助(No.39570317)
作者简介：曹文华，女30岁，生物化学与分子生物学专业博士；
杨翰仪，女，63岁，博士生导师，主要研究方向为神经生化及分子免疫
4 参考文献
[1] Hughes G R.The antiphospholipid syndrome: Ten years on APS. Lancet, 1993;342 (3):341
[2] Wurm H. β2GPI interaction with phospholipid vesicles. Int J Biochem, 1984;16(5):511
[3] Loizon S, McCrea J D, Rudge A C et al. Measurement of anticardiolipin antibodies by an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) : Standardization and quantitation of results. Clin Exp Immunol,1985;62(4):738
, 百拇医药
[4] Horbach D A, van Oort E，Donders R C et al. Lupus anticoagulant is the strongest risk factor for both venous and arterial thrombosis in patients with systemic lupus erythematosus. Comparison between different assays for the detection of antiphospholipid antibodies. Thromb Haemost, 1996;76(6):916
[5] Reber G,Arvieux J, Comby E et al. Multicenter evaluation of nine commercial kits for the quantitation of anticardiolipin antibodies. Thromb Haemost, 1995;73(3)：444
, 百拇医药
[6] McNeil H P,Smpson R J,Chesterman C N et al. Antiphospholipid antibodies are directed agangainstnst a complex antigen that includes a lipid binding inhibitor of coagulation: β2 Glycoprotein I(apolipoprotein H).Proc Natl Acad Sci USA,1990;87(11):4120
[7] Tincan A,Spatola L, Balestrieri G. β2GPI cofactor and ACA.Isr J Med Sci, 1995;31(1):17
[8] 吴 敌，宋春伶，许二赫et al. 抗心肌磷脂抗体与缺血性脑血管病关系的研究.中国免疫学杂志，1997;13(1):54
〔收稿1997-08-28 修回1998-03-14〕, 百拇医药
单位：曹文华 杨翰仪 (白求恩医科大学基础生物化学与分子生物学教研室，长春130021)
关键词：β2糖尿白-Ⅰ；抗磷脂抗体综合征；抗β2糖蛋白-Ⅰ抗体
中国免疫学杂志/990517 摘 要 目的：探讨αβ2GPI在抗磷脂抗体综合征中诱导抗体产生的机制。方法：随机抽取活动期SLE患者60例，采用ELISA法测定血清中αβ2GPI。结果：发现与正常对照组相比SLE组αβ2GPI水平明显升高(P<0.001)。以x+3s为正常值上限，阳性率高达95%，显示αβ2GPI与SLE有显著相关性。结论：αβ2GPI是抗磷脂肮体综合征的重要标志。
中国图书分类号 Q513.2 R593.2
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Association of anti-β2 glycoprotein I antibodies with antiphospholipid syndrome
CAO Wen-Hua , YANG Han-Yi.
Department of Biochemistry and Molecular Biology ,Norman Bethune University of Medical Sciences ,Changchun 130021
Abstract Objective: To in vestigate the role of αβ2GPI in antiphospholipid syndrome. Methods: An αβ2GPI ELISA was established to study the sera of 60 SLE patients, as well as 80 health bolld donors. Results: Elevated level of αβ2GPI was found in SLE group. The positive rate in SLE group is 95%. Conclusion: The result indicated αβ2GPI maybe a useful marker for the antiphospholipid syndrome.
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Key words β2GPI Antiphospholipid syndrome(APS) αβ2GPI
抗磷脂抗体综合征(Antiphospho1ipid syndrome,APS)是80年代初发现的一种较为常见的自身免疫性疾病。APS患者实验室检查有高滴度的抗磷脂抗体(Antiphospholipid antibodies，APLAs)。APS典型的临床表现是系统性红斑狼疮(SLE)[1]。
目前国内外APS的检测主要测定的是ACA，但常规的ACA检测的方法中由于封闭液中有β2-糖蛋白-I(β2GPI)作为蛋白辅助因子的干扰，使得测定抗体的成分较复杂。为了更深入探讨和明确β2GPI在APS中诱导抗体产生的机制，我们在分离纯化人β2GPI的基础上，建立了测定单纯αβ2GPI的ELISA方法，并对αβ2GPI与APS的相关性进行了研究。
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1 材料与方法
1.1 研究对象 病例组为活动期SLE患者60例；对照组为不同年龄组正常健康体检者80名。
1.2 材料与试剂 人新鲜血浆(长春市中心血站)；Heparin Sepharose CL-6B(Pharmacia公司)；SDS-PAGE低分子量蛋白标准品(上海丽珠东风生物技术公司)；β2GPI标准品(牛津大学Yu Bingbin博士惠赠)；牛血清白蛋白(上海生物化学研究所)；羊抗人IgG-HRP(军事医学科学院微生物流行病研究所)；96孔酶标板(Nunc)；其它试剂均为国产分析纯。
1.3 方法
1.3.1 β2GPI的分离提取及鉴定 参考文献[2]，人血浆经高氯酸沉淀除杂蛋白，4℃ 12 000 r/min高速离心得上清。浓缩后上Heparin Sepharose CL-6B亲和层析柱，进行梯度洗脱。收集0.25 mol/L NaCl浓度下的洗脱峰，透析后冷冻干燥得β2GPI纯品。SDS-PAGE法测定纯度及分子量。
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1.3.2 aβ2GPI ELISA法的确立 参照常规的ACA测定方法[3]，用含10 μg/ml β2GPI的pH 7.2 PBS 100 μl包被96孔板，4℃过夜。常法洗涤后用1%BSA封闭2 h。洗涤后加1∶50稀释的待测血清100 μl，37℃作用后洗涤。再加入羊抗人IgG-HRP(1∶800)，37℃孵育0.5 h，洗涤后加底物(OPD-H2O2)溶液，避光显色20 min,2 mol/L H2SO4终止反应，492 nm测吸光度(A)值。
1.3.3 数据处理方法及阳性标准 采用t检验；正常对照组均值加3倍标准差(x+3s)为正常上限。
2 结果
2.1 β2GPI的纯度及分子量 β2GPI经SDS-PAGE鉴定为一条带，与牛津大学标准品位置一致，分子量为46 kD，见图1。
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图1 纯化β2GPI的SDS-PAGE图谱
Fig.1 SDS-PAGE of purified β2GPI
Note：lane 1. low molecular weight protein marker; lane 2. standard β2GPI; lane 3. purified β2GPI
2.2 αβ2GPI的测定结果及阳性率 正常对照组均值为x＝0.732±0.048。以此为标准，SLE组αβ2GPI水平明显增高(P<0.001)。以0.732+3×0.048为正常上限，SLE组阳性率为95%(57/60)。
3 讨论
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1986年正式命名抗磷脂抗体综合征(APS)以来，国外学者对这种累及多器官的自身免疫性疾病进行的研究证实APS多伴有APLAs的异常，对大量临床资料的回顾性分析表明SLE患者的IgG型APLAs阳性率为6%～73%，平均为34%[4]。
十年多的研究中，临床上多采用测定ACA的ELISA法来进行APS的诊断，然而ACA测定的标准化问题一直困扰着人们[5]。虽然近年国外成立了一些ACA标准化实验室，但目前为止ACA测定的标准化问题仍未彻底解决,严重影响了APS的研究。
ACA检测方法的特异性和重复性都不甚满意，这其中一个很重要的原因是β2GPI的影响。自从1990年发现β2GPI是ACA与CL体外结合所必需的蛋白辅助因子以来[6，7]，ACA检测系统中采用的封闭液和包被液均含有小牛血清(其中含β2GPI)。这使得ACA检测系统中的抗原成分十分复杂，有单纯的CL、β2GPI、还有二者形成的复合物，而且其中β2GPI的量很难控制。测定的抗体也包含着多种复杂的成分：有直接针对CL的抗体，有针对二者复合物的抗体，还包含了αβ2GPI。我们认为，为进一步揭示β2GPI在APS中诱导抗体产生的机制，研究测定αβ2GPI与APS的关系是很有必要的。
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目前国内有关APS的研究报道较少，有ACA检测试剂盒出品及少量的研究报道[8]。尚无有关αβ2GPI的测定及其与APS的关系的报道，本文采用自建的ELISA方法测定了SLE患者血清中的αβ2GPI水平，发现临床上具有典型症状的SLE患者中αβ2GPI水平明显升高，提示αβ2GPI与SLE等APS相关疾病具有很强的相关性，αβ2GPI很可能成为APS的标记分子。以x+3s为正常值上限，SLE病人血清中αβ2GPI阳性率高达95%，远远高于本课题组ACA检测的阳性率(待发表)。而且研究中发现与ACA的测定相比，αβ2GPI测定的重复性更好，特异性更高(待发表)。这些结果进一步提示αβ2GPI与APS的相关性很可能比ACA更密切，αβ2GPI很可能会成为SLE等APS相关疾病诊断和研究分析的重要的实验室指标。鉴于β2GPI在APS中诱导抗体产生的过程中起重要的作用以及αβ2GPI与APS的相关性比ACA更为密切，我们推测αβ2GPI很可能在APS的病理过程中起着某种关键性的作用，这一点尚有待于进一步深入研究证实。
, 百拇医药
①本课题受国家自然科学基金资助(No.39570317)
作者简介：曹文华，女30岁，生物化学与分子生物学专业博士；
杨翰仪，女，63岁，博士生导师，主要研究方向为神经生化及分子免疫
4 参考文献
[1] Hughes G R.The antiphospholipid syndrome: Ten years on APS. Lancet, 1993;342 (3):341
[2] Wurm H. β2GPI interaction with phospholipid vesicles. Int J Biochem, 1984;16(5):511
[3] Loizon S, McCrea J D, Rudge A C et al. Measurement of anticardiolipin antibodies by an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) : Standardization and quantitation of results. Clin Exp Immunol,1985;62(4):738
, 百拇医药
[4] Horbach D A, van Oort E，Donders R C et al. Lupus anticoagulant is the strongest risk factor for both venous and arterial thrombosis in patients with systemic lupus erythematosus. Comparison between different assays for the detection of antiphospholipid antibodies. Thromb Haemost, 1996;76(6):916
[5] Reber G,Arvieux J, Comby E et al. Multicenter evaluation of nine commercial kits for the quantitation of anticardiolipin antibodies. Thromb Haemost, 1995;73(3)：444
, 百拇医药
[6] McNeil H P,Smpson R J,Chesterman C N et al. Antiphospholipid antibodies are directed agangainstnst a complex antigen that includes a lipid binding inhibitor of coagulation: β2 Glycoprotein I(apolipoprotein H).Proc Natl Acad Sci USA,1990;87(11):4120
[7] Tincan A,Spatola L, Balestrieri G. β2GPI cofactor and ACA.Isr J Med Sci, 1995;31(1):17
[8] 吴 敌，宋春伶，许二赫et al. 抗心肌磷脂抗体与缺血性脑血管病关系的研究.中国免疫学杂志，1997;13(1):54
〔收稿1997-08-28 修回1998-03-14〕, 百拇医药