人淋巴毒素cDNA在大肠杆菌表达的研究①
作者：张津利 朱锡华
单位：张津利 朱锡华 (第三军医大学免疫学教研室，重庆400038)
关键词：人淋巴毒素；表达；大肠杆菌
中国免疫学杂志/990506
摘 要 目的：在大肠杆菌表达人淋巴毒素cDNA。方法：将本室克隆的人淋巴毒素cDNA亚克隆于原核表达载体pBV220,温控法诱导重组菌，SDS-PAGE和Western-blotting检测和鉴定结果，MTT比色法测定重组LT活性。结果：成功地表达了人淋巴毒素重组蛋白；重组蛋白占细菌总蛋白的12%，并具有细胞毒活性，活性单位相当于2×105 U/L菌液。结论：为重组LT的大量生产、临床应用，为进一步研究人LT的生物学功能奠定了基础。
中国图书分类号 Q785
, http://www.100md.com
Expression of cDNA for human lymphotoxin in E.coli
ZHANG Jin-Li，ZHU Xi-Hua.
Department of Immunology,the Third Military Medical University,Chongqing 400038
Abstract Objective:To express human lymphotoxin (LT or TNF-β) cDNA in E.coli.Method: A LT cDNA fragment isolated in this laboratory was subcloned into prokaryotic expression plasmid pBV220 and expressed in E.coli DH5α by temperature shifting from 30℃ to 42℃。The expressed protein(rLT) was confirmed by SDS-PAGE and Western blotting analysis,and its cytotoxic activity on L929 cells was evaluated by MTT colorimeric assay.Results: Recombinant LT had been successfully expressed in E.coli.It has a molecular weight 18～19 kD,approximating to its molecular mass calculated from the primary amino acid sequence,and showed positive reaction with anti-LT monoclonal antibodies and cytotoxic effect on L929 cells. The expressed protein band constituted 12% of total bacterial protein and the cytotoxic activity of rLT was 2×105 U /L of E.coli fermentation broth.Conclusion:These results paved the ways for production,clinical use and researches of LT.
, 百拇医药
Key words Human lymphotoxin Expression E.coli
淋巴毒素(Lymphotoxin,LT)又称肿瘤坏死因子β(TNF-β)，它可在体内或体外特异地杀伤多种肿瘤细胞，并具有抗病毒及免疫调节活性，因其细胞毒作用与TNF-α相似，而毒副作用大大低于TNF-α而倍受重视，是一种非常有前途的抗肿瘤和抗病毒生物制剂[1]。本实验将本室克隆的人淋巴毒素cDNA[2]构建于原核表达载体，以期在大肠杆菌表达人淋巴毒素(rLT)。
1 材料与方法
1.1 pBV-LT表达载体的构建 原核表达载体pBV220由中国预防医学科学院病毒所提供[3]，经内切酶SmaI切成双平端，同时将克隆于pUC18-LT中的去信号肽LTcDNA[2]经HindⅢ/Nco I双酶切，Klenow酶填平，载体与LTcDNA按常规方法连接并转化大肠杆菌DH5α，地高辛标记探针菌落原位杂交法初步筛选阳性重组子，可疑阳性重组子经酶切进一步鉴定并确定插入方向[4]，获得的正向阳性重组子命名为pBV-LT。
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1.2 人LT cDNA在大肠杆菌的诱导表达 将含有pBV-LT的DH5α在30℃培养过夜，按1∶100稀释至LB培养液中，继续在30℃摇床培养至OD0.4～0.6，迅速转至42℃摇床诱生2～6 h，同时作未诱生菌和空载体对照[3]。
1.3 重组人LT的检测与鉴定 于诱生不同时相离心收集菌体，以1×SDS上样缓冲液溶解并煮沸后行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，脱色后观察结果，并在DU-600型紫外分光光度计上作薄层扫描分析，以计算阳性蛋白带的相对比例。Western-blotting按常规方法进行，以抗LT McAb(宝灵曼产品)与转移至NC膜上的重组LT蛋白带作免疫印迹反应[4]。
1.4 重组LT活性测定 按文献方法分离包涵体[4]。收集42℃诱导5 h的细菌100 ml，离心后每克湿菌加3 ml TE Buffer悬浮，超声粉碎、变性、复性后浓缩至1 ml，过滤除菌、备用。MTT比色法测定LT对培养的L929细胞的细胞毒活性[5]，以已知活性单位的rTNF-α(本校大坪医院产品，活性单位20 000 U/ml)为阳性对照。
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2 结果
2.1 阳性重组子的筛选与鉴定 从108个pBV220/LT转化的菌落中经地高辛标记探针筛选出5个阳性菌落，质粒快速小量抽提后经RE酶切确认，这些阳性菌落均为带有插入片段的阳性重组子，其中1个为正向插入，4个为反向插入。
2.2 重组LT的表达与鉴定 pBV-LT经诱导后，在18～19 kD处出现一新的蛋白带，其表达高峰在诱导后4～6 h，包涵体样品在同样位置有一较浓的蛋白带，与文献报道的重组LT分子量大小一致[5]，薄层扫描分析表明，重组LT蛋白带占细菌总蛋白量的12%(图1A),Western-blotting显示，仅经诱导的pBV-LT在18～19 kD处有阳性反应，表明前述蛋白带确属人淋巴毒素蛋白(图1B)。
2.3 重组蛋白的生物学活性 经MTT比色法测定，rLT与rTNF-α活性单位相当，均为20 000 U/ml，此1 ml rLT为100 ml菌液所得，因此相当于2×105 U/L菌液。
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图1 重组LT的表达与鉴定
Fig.1 Expression and identification of rLT
Note:A.SDS-PAGE：Lanel,protein molecular weight markers,Lanes2 and3,pellet fraction of sonicated cells carrying the control plasmid(lane2) or pBV-LT(lane3).Lanes4,6,8 and Lanes5,7,9,total cell lysate of cells harboring pBV-LT grown at 30℃ or 42℃ for 2,4,6 h respectively.Lane10,total cell lysate of cells harboring pBV220 grown at 42℃ for 4 h.B.Western blotting.Lanes1,2,3 total cell lysate of cells harboring respectively pBV220(Lane 1,grown at 42℃ for 4 h)and pBV-LT(Lanes 2,3,grown at 42℃ for 4 and 6 h)
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3 讨论
本实验将本室克隆的人淋巴毒素cDNA构建于原核表达载体pBV220,筛选出的阳性重组子pBV-LT经温控诱导，成功地表达了人淋巴毒素重组蛋白，该重组蛋白占细菌总蛋白的12%，并具有细胞毒活性，其活性单位相当于2×105 U/L菌液。本实验为rLT的大量生产和临床应用，以及进一步研究LT的功能奠定了基础。
本实验rLT表达量占细胞总蛋白量的12%，尚有进一步提高的必要，试用合适的高效表达载体，调整SD与ATG间的距离可能是有效的途径。另外，据文献报道，人LTcDNA具有多态性，即在其成熟肽第26位氨基酸有天冬酰胺(Asn,密码子AAC)和酪氨酸(Thr，密码子TAC)之分，而26位为Thr的cDNA，其蛋白表达量明显高于该氨基酸为Asn者[6]，本实验克隆的人LTcDNA正好是后一种形式。因此，通过定点突变将该编码基因由AAC改为TAC，有可能提高rLT的表达水平，而建立高效的rLT纯化方法也是获得高活性重组蛋白的重要条件，这些均是下一步将要开展的工作。
, 百拇医药
①全军“八五”重点课题资助项目
作者简介：张津利，男，34岁，博士，主要从事细胞因子研究；
朱锡华，男，76岁，教授，博导，主要从事分子免疫学研究
4 参考文献
[1] Ruddle N H.Tumor necrosis factor(TNF-α)and lymphotoxin(TNF-β).Curr Opin Immunol,1992;4:327
[2] 张津利，朱锡华.人淋巴毒素cDNA克隆及在大肠杆菌表达的研究(博士论文摘要).第三军医大学学报，1997；19(1)：58
[3] 张智清，姚立红，侯云德.含PRPL启动子的原核表达载体的组建及其应用.病毒学报，1990；6(2)：111
, http://www.100md.com
[4] 金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992:602-691
[5] Schoenfeld H J,Poeschl B,Frey J R et al.Efficient purification of recombinant human tumor necrosis factor β from Escherichia coli yields biologically active protein with a trimeric structure that binds to both tumor necrosis factor receptors.J Bio Chem,1991;266:3863
[6] Messer G U,Spengler M C,Jung G et al.Polymorphic stucture of the tumor necrosis factor (TNF)locus:an NcoI polymorphism in the first intron of the human TNF-β gene correlates with a variant amino acid in position 26 and a reduced level of TNF-β production.J Exp Med,1991;173:209
〔收稿1997-03-16 修回1998-02-04〕, 百拇医药
单位：张津利 朱锡华 (第三军医大学免疫学教研室，重庆400038)
关键词：人淋巴毒素；表达；大肠杆菌
中国免疫学杂志/990506
摘 要 目的：在大肠杆菌表达人淋巴毒素cDNA。方法：将本室克隆的人淋巴毒素cDNA亚克隆于原核表达载体pBV220,温控法诱导重组菌，SDS-PAGE和Western-blotting检测和鉴定结果，MTT比色法测定重组LT活性。结果：成功地表达了人淋巴毒素重组蛋白；重组蛋白占细菌总蛋白的12%，并具有细胞毒活性，活性单位相当于2×105 U/L菌液。结论：为重组LT的大量生产、临床应用，为进一步研究人LT的生物学功能奠定了基础。
中国图书分类号 Q785
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Expression of cDNA for human lymphotoxin in E.coli
ZHANG Jin-Li，ZHU Xi-Hua.
Department of Immunology,the Third Military Medical University,Chongqing 400038
Abstract Objective:To express human lymphotoxin (LT or TNF-β) cDNA in E.coli.Method: A LT cDNA fragment isolated in this laboratory was subcloned into prokaryotic expression plasmid pBV220 and expressed in E.coli DH5α by temperature shifting from 30℃ to 42℃。The expressed protein(rLT) was confirmed by SDS-PAGE and Western blotting analysis,and its cytotoxic activity on L929 cells was evaluated by MTT colorimeric assay.Results: Recombinant LT had been successfully expressed in E.coli.It has a molecular weight 18～19 kD,approximating to its molecular mass calculated from the primary amino acid sequence,and showed positive reaction with anti-LT monoclonal antibodies and cytotoxic effect on L929 cells. The expressed protein band constituted 12% of total bacterial protein and the cytotoxic activity of rLT was 2×105 U /L of E.coli fermentation broth.Conclusion:These results paved the ways for production,clinical use and researches of LT.
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Key words Human lymphotoxin Expression E.coli
淋巴毒素(Lymphotoxin,LT)又称肿瘤坏死因子β(TNF-β)，它可在体内或体外特异地杀伤多种肿瘤细胞，并具有抗病毒及免疫调节活性，因其细胞毒作用与TNF-α相似，而毒副作用大大低于TNF-α而倍受重视，是一种非常有前途的抗肿瘤和抗病毒生物制剂[1]。本实验将本室克隆的人淋巴毒素cDNA[2]构建于原核表达载体，以期在大肠杆菌表达人淋巴毒素(rLT)。
1 材料与方法
1.1 pBV-LT表达载体的构建 原核表达载体pBV220由中国预防医学科学院病毒所提供[3]，经内切酶SmaI切成双平端，同时将克隆于pUC18-LT中的去信号肽LTcDNA[2]经HindⅢ/Nco I双酶切，Klenow酶填平，载体与LTcDNA按常规方法连接并转化大肠杆菌DH5α，地高辛标记探针菌落原位杂交法初步筛选阳性重组子，可疑阳性重组子经酶切进一步鉴定并确定插入方向[4]，获得的正向阳性重组子命名为pBV-LT。
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1.2 人LT cDNA在大肠杆菌的诱导表达 将含有pBV-LT的DH5α在30℃培养过夜，按1∶100稀释至LB培养液中，继续在30℃摇床培养至OD0.4～0.6，迅速转至42℃摇床诱生2～6 h，同时作未诱生菌和空载体对照[3]。
1.3 重组人LT的检测与鉴定 于诱生不同时相离心收集菌体，以1×SDS上样缓冲液溶解并煮沸后行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色，脱色后观察结果，并在DU-600型紫外分光光度计上作薄层扫描分析，以计算阳性蛋白带的相对比例。Western-blotting按常规方法进行，以抗LT McAb(宝灵曼产品)与转移至NC膜上的重组LT蛋白带作免疫印迹反应[4]。
1.4 重组LT活性测定 按文献方法分离包涵体[4]。收集42℃诱导5 h的细菌100 ml，离心后每克湿菌加3 ml TE Buffer悬浮，超声粉碎、变性、复性后浓缩至1 ml，过滤除菌、备用。MTT比色法测定LT对培养的L929细胞的细胞毒活性[5]，以已知活性单位的rTNF-α(本校大坪医院产品，活性单位20 000 U/ml)为阳性对照。
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2 结果
2.1 阳性重组子的筛选与鉴定 从108个pBV220/LT转化的菌落中经地高辛标记探针筛选出5个阳性菌落，质粒快速小量抽提后经RE酶切确认，这些阳性菌落均为带有插入片段的阳性重组子，其中1个为正向插入，4个为反向插入。
2.2 重组LT的表达与鉴定 pBV-LT经诱导后，在18～19 kD处出现一新的蛋白带，其表达高峰在诱导后4～6 h，包涵体样品在同样位置有一较浓的蛋白带，与文献报道的重组LT分子量大小一致[5]，薄层扫描分析表明，重组LT蛋白带占细菌总蛋白量的12%(图1A),Western-blotting显示，仅经诱导的pBV-LT在18～19 kD处有阳性反应，表明前述蛋白带确属人淋巴毒素蛋白(图1B)。
2.3 重组蛋白的生物学活性 经MTT比色法测定，rLT与rTNF-α活性单位相当，均为20 000 U/ml，此1 ml rLT为100 ml菌液所得，因此相当于2×105 U/L菌液。
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图1 重组LT的表达与鉴定
Fig.1 Expression and identification of rLT
Note:A.SDS-PAGE：Lanel,protein molecular weight markers,Lanes2 and3,pellet fraction of sonicated cells carrying the control plasmid(lane2) or pBV-LT(lane3).Lanes4,6,8 and Lanes5,7,9,total cell lysate of cells harboring pBV-LT grown at 30℃ or 42℃ for 2,4,6 h respectively.Lane10,total cell lysate of cells harboring pBV220 grown at 42℃ for 4 h.B.Western blotting.Lanes1,2,3 total cell lysate of cells harboring respectively pBV220(Lane 1,grown at 42℃ for 4 h)and pBV-LT(Lanes 2,3,grown at 42℃ for 4 and 6 h)
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3 讨论
本实验将本室克隆的人淋巴毒素cDNA构建于原核表达载体pBV220,筛选出的阳性重组子pBV-LT经温控诱导，成功地表达了人淋巴毒素重组蛋白，该重组蛋白占细菌总蛋白的12%，并具有细胞毒活性，其活性单位相当于2×105 U/L菌液。本实验为rLT的大量生产和临床应用，以及进一步研究LT的功能奠定了基础。
本实验rLT表达量占细胞总蛋白量的12%，尚有进一步提高的必要，试用合适的高效表达载体，调整SD与ATG间的距离可能是有效的途径。另外，据文献报道，人LTcDNA具有多态性，即在其成熟肽第26位氨基酸有天冬酰胺(Asn,密码子AAC)和酪氨酸(Thr，密码子TAC)之分，而26位为Thr的cDNA，其蛋白表达量明显高于该氨基酸为Asn者[6]，本实验克隆的人LTcDNA正好是后一种形式。因此，通过定点突变将该编码基因由AAC改为TAC，有可能提高rLT的表达水平，而建立高效的rLT纯化方法也是获得高活性重组蛋白的重要条件，这些均是下一步将要开展的工作。
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①全军“八五”重点课题资助项目
作者简介：张津利，男，34岁，博士，主要从事细胞因子研究；
朱锡华，男，76岁，教授，博导，主要从事分子免疫学研究
4 参考文献
[1] Ruddle N H.Tumor necrosis factor(TNF-α)and lymphotoxin(TNF-β).Curr Opin Immunol,1992;4:327
[2] 张津利，朱锡华.人淋巴毒素cDNA克隆及在大肠杆菌表达的研究(博士论文摘要).第三军医大学学报，1997；19(1)：58
[3] 张智清，姚立红，侯云德.含PRPL启动子的原核表达载体的组建及其应用.病毒学报，1990；6(2)：111
, http://www.100md.com
[4] 金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992:602-691
[5] Schoenfeld H J,Poeschl B,Frey J R et al.Efficient purification of recombinant human tumor necrosis factor β from Escherichia coli yields biologically active protein with a trimeric structure that binds to both tumor necrosis factor receptors.J Bio Chem,1991;266:3863
[6] Messer G U,Spengler M C,Jung G et al.Polymorphic stucture of the tumor necrosis factor (TNF)locus:an NcoI polymorphism in the first intron of the human TNF-β gene correlates with a variant amino acid in position 26 and a reduced level of TNF-β production.J Exp Med,1991;173:209
〔收稿1997-03-16 修回1998-02-04〕, 百拇医药