CD3ε胞浆区Tyr突变阻断下游的细胞凋亡信号传递①
作者：何亦平 刘彦信 肖声 刘士廉 郑德先
单位：何亦平 刘彦信 肖 声 刘士廉 郑德先(中国医科院基础医学所中国协和医科大学基础医学院医学分子生物学国家重点实验室，北京100005)
关键词：细胞凋亡信号；酪氨酸突变；CD3ε分子
中国免疫学杂志/990104
摘 要 目的：利用稳定表达CD8ε融合分子的细胞凋亡模型，研究其CD3ε-ITAM中两个酪氨酸的突变对细胞凋亡信号传递及相关基因表达的影响。方法：将稳定表达CD8ε融合分子及其3种突变分子的T淋巴细胞分别用抗CD8单抗刺激后，检测4种细胞蛋白酪氨酸磷酸化和胞浆Ca2+浓度的变化以及细胞凋亡相关基因表达。结果：抗体刺激后，表达CD8ε的细胞与表达其3种突变分子的细胞相比，其蛋白磷酸化增加，胞浆Ca2+浓度升高；立早基因nur77和细胞凋亡基因fas表达水平升高。结论：首次发现CD3ε-ITAM中两个酪氨酸的突变阻断了CD3介导的凋亡信号传导途径，并影响nur77和fas基因的表达。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.12
Mutation of tyrosines in the cytoplasmic domain of CD3ε
blocks the apoptotic signaling pathway of T lymphocytes
HE Yi-Ping,LIU Yan-Xin,XIAO Sheng et al.
National Laboratories of Medical Molecular Biology,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100005
Abstract Objective：To study the effect of the mutation of two tyrosines in CD3ε-ITAM on apoptotic signaling pathway by using the cell lines stably expressed CD8ε chimera molecule and its mutants of tyrosines to phenolanalines in CD3ε-ITAM as models.Methods：The cells were stimulated with anti-CD8 monoclonal antibody and the protein phosphorylation was analyzed by Western-blot,concentration of Ca2+ analyzed by flow cytometry and nur77 and fas gene expressions determined by Northern-blot and RT-PCR respectively.Results:It was showed that the protein phosphorylations and intracellular concentrations of Ca2+ were increased,nur77 and fas gene expressions upregulated in the cells with expression of CD8ε+,but not in the cells with the expression of CD8ε mutants.Conclusion:It was found at the first time that mutation of any one of the two tyrosines in CD3ε-ITAM blocks the apoptotic signaling pathway mediated by CD3ε molecule.
, 百拇医药
Key words Cell apoptotic signaling Mutation of tyrosines CD3ε molecule
T淋巴细胞抗原受体(TCR)与CD3分子各亚单位(CD3γ、δ、ε和ζ)形成稳定的复合物，传递外界抗原刺激信号，引起细胞的激活或凋亡。T细胞激活和凋亡信号的传递主要是通过CD3ε和CD3ζ两个亚单位传递的，CD3ε和CD3ζ胞浆区含有保守的免疫受体酪氨酸激活基序(immune receptor tyrosine-based activation motif，即YXXL(X)YXXL/I7-8，简称为ITAM)，TCR/CD3的刺激信号使ITAM中的酪氨酸快速磷酸化，其下游的蛋白酪氨酸激酶(PTKs)，如ZAP-70、Lck和Fyn等与酪氨酸结合而活化，从而诱导一系列胞内生化事件，如相关蛋白的磷酸化、胞浆Ca2+浓度升高、Ras-GTP积累、转录因子活化等，最终激活一系列基因表达，使T细胞激活[1]。
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本实验室以往的研究中，构建了CD8α胞外区、跨膜区和CD3ε胞浆区(含ITAM)的融合基因(CD8ε)，并转染CD8阴性的Jurkat细胞，经G-418筛选获得了稳定表达CD8ε的细胞株(命名为T-JK)，用抗CD8单抗刺激能诱导T-JK细胞凋亡[2]。将此融合基因胞浆区ITAM中两个酪氨酸分别突变或同时突变为苯丙氨酸的CD8ε(Y170F)、CD8ε(Y181F)和CD8ε(Y170F/Y181F)分别转染Jurkat T细胞，获得稳定表达的各细胞株分别命名为T1-JK、T2-JK和T3-JK。在同样条件下，抗CD8单抗刺激不能引起T1-JK、T2-JK和T3-JK细胞凋亡[2，3]。此结果表明CD3εITAM中的两个酪氨酸不仅在介导细胞激活中，而且在介导细胞凋亡中均起必不可少的作用。但CD3ε介导的T细胞凋亡的信号传递途径仍不明了，本文进一步探讨了CD3εITAM中两个酪氨酸位点的突变对下游细胞凋亡信号的影响。
1 材料与方法
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1.1 蛋白酪氨酸磷酸化的检测 本实验室已经构建的野生型CD8ε、突变型CD8ε(Y170F)、CD8ε(Y181F)和CD8ε(Y170F/Y181F)融合基因转染CD8-Jurkat细胞后，所获得的4株稳定表达上述融合蛋白的细胞株分别命名为T-JK、T1-JK、T2-JK和T3-JK[3]。取1×106细胞，用PBS洗1次，离心弃上清，细胞悬浮于100 μl含20 μg/ml抗CD8单抗并已预热至37℃的PBS中，细胞刺激3 min后，加入1 ml预冷的PBS终止刺激。同时设不经抗体刺激的阴性对照。离心收集细胞，按常规方法裂解细胞，总蛋白经SDS-PAGE电泳分离，转印至NC膜，用抗磷酸化酪氨酸(PTyr)单抗(PY20)进行Western蛋白免疫印迹，用碱性磷酸酶显色系统(B.M公司)显色。
1.2 胞浆Ca2+浓度的检测 1×106细胞用Hank's平衡盐水(HBSS)洗2次，再将细胞悬浮于1 ml HBSS，加入5 μl Ca2+探针Fluo-3/AM(Molecular Probes公司，1 mmol溶于DMSO)，使终浓度为5 μmol/L，于37℃保温30～60 min。HBSS洗1次，细胞再悬浮于HBSS中。先不加抗体，以流式细胞仪分析胞浆Ca2+浓度。然后加入含抗CD8单抗的PBS(抗体终浓度为20 μg/ml)，刺激细胞1 min，立即用流式细胞仪分析Ca2+浓度的变化。
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1.3 nur77基因表达的检测 将5×106各转染细胞不经抗体刺激或于150 μg/ml抗CD8单抗包被过的培养皿中刺激1、2和4 h后，离心收集细胞并提取总RNA，进行甲醛凝胶电泳后，按常规方法转至NC膜。以nur77 cDNA片段为模板，随机引物法标记探针。65℃预杂交液(0.25 mol Na2HPO4,pH7.4,7%SDS)中杂交30 min，加入标记好的探针杂交过夜。然后按常规进行洗膜，X光片曝光，洗片和观察杂交结果。
1.4 fas基因表达的检测 5×106转染细胞不经抗体刺激或于150 μg/ml抗CD8单抗包被过的培养皿中刺激4 h，离心收集细胞，用一步法提取总RNA。按下述方法进行RT-PCR反应：总RNA 3 μg(8 μl),Oligo(dT)2.5 μl和ddH2O 4.0 μl，混匀，离心，于95℃加热2～3 min后取出，缓慢冷却至室温。加入1.0 μl RNasin(50单位)、2.5 μl 10×逆转录反应缓冲液、2.5 μl 10×dNTP、2.5 μl BSA(1 mg/ml)和2.0 μl MMLV逆转录酶(Biolab，100单位)，置37℃水浴反应1.5 h。接着进行PCR反应，fas的引物为：
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fas: P1: 5′-CCGCCGCTCGAGTTATCGTCCAAAA-3′
P2: 5′-CGGCTCGAGTTATCCTTCCTCTTTGC-3′；
GAPDH：P1: 5′-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3′
P2: 5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。
PCR的条件为：2.5 μl 10×PCR缓冲液、1.5 μl dNTP、2.5 μl DMSO、1.0 μl P1、1.0 μl P2、3.0 μl逆转录产物、加双蒸水至总体积25.0 μl。94℃变性4 min，加入0.3 μl Taq酶，以50.0 μl矿物油覆盖。按94℃变性40 s、58℃退火1 min、72℃延伸40 s的条件，进行30个循环反应。同时以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)cDNA引物进行PCR，作为内对照。
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2 结果
2.1 4株转染细胞内蛋白酪氨酸的磷酸化 如图1所示，4株转染细胞经抗CD8单抗刺激后，蛋白质酪氨酸磷酸化增加，但T-JK细胞的磷酸化蛋白的种类和强度都高于3株表达CD8ε突变体的细胞。在T1-JK和T2-JK细胞中，其ITAM中的一个酪氨酸突变即可影响蛋白质的酪氨酸磷酸化。但在未受抗体刺激时，T1-JK和T2-JK细胞与野生型T-JK细胞相比，各有一种蛋白质发生显著的酪氨酸磷酸化，提示两个酪氨酸可能有不完全相同的功能。
图1 抗CD8单抗刺激前后4株转染细胞内蛋白质酪氨酸磷酸化的分析结果
Fig.1 Protein phosphorylation in transfectants stimulated with anti-CD8 mAb
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Note:1, 3, 5 and 7. T-JK, T1-JK, T2-JK and T3-JK cells without Ab Stimulation. 2, 4, 6 and 8. T-JK, T1-JK, T2-JK and T3-JK cells stimulated with Ab
2.2 4株转染细胞内Ca2+浓度的变化 将4株转染细胞先经Ca2+探针Fluo-3/AM处理，再用抗CD8单抗刺激1 min，以流式细胞仪测定抗体刺激前后细胞的荧光强度表示胞浆Ca2+浓度的变化。结果如图2所示，抗体刺激后，只有T-JK细胞胞浆Ca2+浓度迅速升高，T3-JK细胞没有变化，表明CD8ε的ITAM中两个酪氨酸同时突变，阻断了抗体刺激信号引起的Ca2+浓度变化。但有趣的是，在只有一个酪氨酸突变的T1-JK和T2-JK细胞中，胞浆Ca2+浓度略有下降，提示这两个酪氨酸的信号传递功能并不完全相同，也不是二者功能的简单叠加。 
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图2 各转染细胞抗体刺激前(一)后(…)胞浆Ca2+浓度变化
Fig.2 Concentration of intracellular Ca2+ in the transfectants stimulated with (一) and without (…) anti-CD8 mAb
Note:A,B,C and D.T-JK,T1-JK,T2-JK and T3-JK cells respectively
2.3 4株转染细胞内nur77基因的表达 Northern印迹的结果如图3所示，未受抗CD8抗体刺激的4株转染细胞均无nur77 mRNA表达。抗体刺激1 h后，T-JK细胞中即有nur77 mRNA高表达；刺激2 h后nur77 mRNA的表达量达到最高；刺激4 h后仍能检测到nur77 mRNA。其余3株表达CD8ε突变体的细胞在抗体刺激后，nur77 mRNA的表达均没有明显升高，提示CD8ε的ITAM中酪氨酸的突变可阻断抗体的刺激信号。
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图3 抗体刺激后各转染细胞中nur77基因的表达
Fig.3 nur77 gene expression in transfectants stimulated with Ab
Note:1-4,5-8,9-12 and 13-16.T-JK,T1-JK,T2-JK and T3-JK cells stimulated with anti-CD8 mAb for 0,1,2 and 4 h respectively
2.4 4株转染细胞内fas基因的表达 4株转染细胞用150 μg/μl抗CD8单抗刺激4 h后，提取总RNA并进行RT-PCR和琼脂糖电泳。用GAPDH作内对照，检测4株转染细胞内fas基因的表达，结果如图4所示。在不受刺激的情况下，各转染细胞都有很微弱的fas mRNA表达。但在抗体刺激后，只有T-JK细胞的fas mRNA的表达量显著增高，其余3株转染细胞的fas mRNA表达量均无明显变化。提示CD8ε的ITAM中，两个酪氨酸中的任何一个发生突变，均可阻断细胞凋亡信号的传递，以及凋亡信号引起的下游凋亡基因fas的表达。
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图4 抗体刺激各转染细胞中fas mRNA的表达
Fig.4 fas mRNA expression in transfectants stimulated with and without Ab
Note:T-JK,T1-JK,T2-JK and T3-JK.4 cell lines respectively
3 讨论
nur77是属于核甾醇类受体家族的转录因子，它能够以单体或与其它因子结合的形式而发挥作用。在不同类型的细胞中，nur77能被不同信号所诱导而使细胞产生不同的效应[4]。nur77 也在细胞凋亡中起作用，但不同信号诱导表达的nur77 mRNA的结构不同，全长nur77 mRNA可使细胞凋亡，而缺少poly(A)+的mRNA则可调节细胞激活[5]。用减法杂交和反义RNA的方法，Woronicz等发现，TCR/CD3诱导的细胞凋亡依赖于立早基因nur77的表达，诱导细胞激活或凋亡的信号都能作用于nur77启动子上游的不同区域而激活nur77基因表达[5，6]。本研究结果表明，在TCR/CD3诱导的细胞凋亡过程中，蛋白质的酪氨酸磷酸化、细胞内Ca2+浓度的升高、nur77的表达与CD3ε-ITAM中两个酪氨酸位点的完整性是密切相关的。Woronicz的实验也表明，抗CD3单抗诱导的高浓度的Ca2+信号能诱导高水平nur77表达[5]，这与本实验的结果是一致的。
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fas是最重要的细胞凋亡基因之一。在未成熟胸腺细胞凋亡中，fas的表达并非必不可少，但激活T细胞、T细胞杂交瘤和肿瘤细胞的细胞凋亡都是通过fas及其配体FasL相互作用的途径而实现的。
fas基因在细胞凋亡中的表达调控目前还鲜有报道，在凋亡中，转录因子nur77所调节的靶基因尚未确定，但Ju等认为nur77可能上调FasL的表达[7]。本研究的实验结果进一步证实nur77是TCR/CD3介导的凋亡信号和细胞凋亡相关基因表达的桥梁。而且，实验结果也表明，在T-JK细胞中，nur77可能有上调fas基因表达的作用。考虑到fas与FasL相互作用非常密切，二者的表达受到相同转录因子的调节也是可能的。
本文首次证明CD3ε-ITAM中任何一个酪氨酸突变或两个酪氨酸同时突变都阻断凋亡信号传递而抑制T淋巴细胞凋亡。只有在完整的ITAM存在的情况下，才能诱导高水平的nur77基因表达，fas mRNA的表达水平也随之增加。CD3ε既能传递细胞激活的信号，又能传递细胞凋亡的信号，表明其上游信号是共同的，而nur77可能是调节细胞激活和凋亡的关键基因。nur77基因表达和fas与FasL表达调控机制的研究将有助于揭示细胞激活和凋亡调控过程的分子机制。
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①国家自然科学基金(批准号39470160)，卫生部基金(94-1-017)和中国医学科学院基金(931008)
作者简介：何亦平，男，25岁，硕士，主要研究细胞凋亡信号传递；
指导教师，郑德先，男，教授，博士生导师，主要研究生物化学和分子生物学
4 参考文献
[1] Weiss A. T cell antigen receptor signal transduction: a tale of tails and cytoplasmic protein tyrosine kinases. Cell, 1993；73:209
[2] 郑德先，郑 勇,Terhorst C et al.CD8α和CD3ε的融合分子介导T淋巴细胞凋亡.科学通报，1997;42(1)：84
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[3] 何亦平，刘彦信，郑 勇 et al.CD3ε胞浆区两个酪氨酸共同介导T淋巴细胞凋亡.科学通报，1998;43(12):1299
[4] Hazel T G，Nathans D,Lau L F et al.A gene inducible by serum growth factors encodes a member of the steroid and thyroid hormone receptor superfamily.Proc Natl Acad Sci USA,1988;85:8444
[5] Liu Z G,Smith S W,McLaughlin K A et al.Apoptotic signals delivered through the T-cell receptor of a T-cell hybrid require the immediate-early gene nur77.Nature,1994;367:291
, 百拇医药
[6] Woronicz J D，Lina A,Calnan B J et al.Regulation of the Nur77 orphan steroid receptor in activation-induced apoptosis.Mol Cell Biol,1995;11:6364
[7] Ju S T,Panka D J,Cui H et al.Fas(CD95)/FasL interactions required for programmed cell death after T-cell activation.Nature,1995;373:444
〔收稿1997-09-06 修回1998-02-05〕, http://www.100md.com
单位：何亦平 刘彦信 肖 声 刘士廉 郑德先(中国医科院基础医学所中国协和医科大学基础医学院医学分子生物学国家重点实验室，北京100005)
关键词：细胞凋亡信号；酪氨酸突变；CD3ε分子
中国免疫学杂志/990104
摘 要 目的：利用稳定表达CD8ε融合分子的细胞凋亡模型，研究其CD3ε-ITAM中两个酪氨酸的突变对细胞凋亡信号传递及相关基因表达的影响。方法：将稳定表达CD8ε融合分子及其3种突变分子的T淋巴细胞分别用抗CD8单抗刺激后，检测4种细胞蛋白酪氨酸磷酸化和胞浆Ca2+浓度的变化以及细胞凋亡相关基因表达。结果：抗体刺激后，表达CD8ε的细胞与表达其3种突变分子的细胞相比，其蛋白磷酸化增加，胞浆Ca2+浓度升高；立早基因nur77和细胞凋亡基因fas表达水平升高。结论：首次发现CD3ε-ITAM中两个酪氨酸的突变阻断了CD3介导的凋亡信号传导途径，并影响nur77和fas基因的表达。
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中国图书分类号 R392.12
Mutation of tyrosines in the cytoplasmic domain of CD3ε
blocks the apoptotic signaling pathway of T lymphocytes
HE Yi-Ping,LIU Yan-Xin,XIAO Sheng et al.
National Laboratories of Medical Molecular Biology,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100005
Abstract Objective：To study the effect of the mutation of two tyrosines in CD3ε-ITAM on apoptotic signaling pathway by using the cell lines stably expressed CD8ε chimera molecule and its mutants of tyrosines to phenolanalines in CD3ε-ITAM as models.Methods：The cells were stimulated with anti-CD8 monoclonal antibody and the protein phosphorylation was analyzed by Western-blot,concentration of Ca2+ analyzed by flow cytometry and nur77 and fas gene expressions determined by Northern-blot and RT-PCR respectively.Results:It was showed that the protein phosphorylations and intracellular concentrations of Ca2+ were increased,nur77 and fas gene expressions upregulated in the cells with expression of CD8ε+,but not in the cells with the expression of CD8ε mutants.Conclusion:It was found at the first time that mutation of any one of the two tyrosines in CD3ε-ITAM blocks the apoptotic signaling pathway mediated by CD3ε molecule.
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Key words Cell apoptotic signaling Mutation of tyrosines CD3ε molecule
T淋巴细胞抗原受体(TCR)与CD3分子各亚单位(CD3γ、δ、ε和ζ)形成稳定的复合物，传递外界抗原刺激信号，引起细胞的激活或凋亡。T细胞激活和凋亡信号的传递主要是通过CD3ε和CD3ζ两个亚单位传递的，CD3ε和CD3ζ胞浆区含有保守的免疫受体酪氨酸激活基序(immune receptor tyrosine-based activation motif，即YXXL(X)YXXL/I7-8，简称为ITAM)，TCR/CD3的刺激信号使ITAM中的酪氨酸快速磷酸化，其下游的蛋白酪氨酸激酶(PTKs)，如ZAP-70、Lck和Fyn等与酪氨酸结合而活化，从而诱导一系列胞内生化事件，如相关蛋白的磷酸化、胞浆Ca2+浓度升高、Ras-GTP积累、转录因子活化等，最终激活一系列基因表达，使T细胞激活[1]。
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本实验室以往的研究中，构建了CD8α胞外区、跨膜区和CD3ε胞浆区(含ITAM)的融合基因(CD8ε)，并转染CD8阴性的Jurkat细胞，经G-418筛选获得了稳定表达CD8ε的细胞株(命名为T-JK)，用抗CD8单抗刺激能诱导T-JK细胞凋亡[2]。将此融合基因胞浆区ITAM中两个酪氨酸分别突变或同时突变为苯丙氨酸的CD8ε(Y170F)、CD8ε(Y181F)和CD8ε(Y170F/Y181F)分别转染Jurkat T细胞，获得稳定表达的各细胞株分别命名为T1-JK、T2-JK和T3-JK。在同样条件下，抗CD8单抗刺激不能引起T1-JK、T2-JK和T3-JK细胞凋亡[2，3]。此结果表明CD3εITAM中的两个酪氨酸不仅在介导细胞激活中，而且在介导细胞凋亡中均起必不可少的作用。但CD3ε介导的T细胞凋亡的信号传递途径仍不明了，本文进一步探讨了CD3εITAM中两个酪氨酸位点的突变对下游细胞凋亡信号的影响。
1 材料与方法
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1.1 蛋白酪氨酸磷酸化的检测 本实验室已经构建的野生型CD8ε、突变型CD8ε(Y170F)、CD8ε(Y181F)和CD8ε(Y170F/Y181F)融合基因转染CD8-Jurkat细胞后，所获得的4株稳定表达上述融合蛋白的细胞株分别命名为T-JK、T1-JK、T2-JK和T3-JK[3]。取1×106细胞，用PBS洗1次，离心弃上清，细胞悬浮于100 μl含20 μg/ml抗CD8单抗并已预热至37℃的PBS中，细胞刺激3 min后，加入1 ml预冷的PBS终止刺激。同时设不经抗体刺激的阴性对照。离心收集细胞，按常规方法裂解细胞，总蛋白经SDS-PAGE电泳分离，转印至NC膜，用抗磷酸化酪氨酸(PTyr)单抗(PY20)进行Western蛋白免疫印迹，用碱性磷酸酶显色系统(B.M公司)显色。
1.2 胞浆Ca2+浓度的检测 1×106细胞用Hank's平衡盐水(HBSS)洗2次，再将细胞悬浮于1 ml HBSS，加入5 μl Ca2+探针Fluo-3/AM(Molecular Probes公司，1 mmol溶于DMSO)，使终浓度为5 μmol/L，于37℃保温30～60 min。HBSS洗1次，细胞再悬浮于HBSS中。先不加抗体，以流式细胞仪分析胞浆Ca2+浓度。然后加入含抗CD8单抗的PBS(抗体终浓度为20 μg/ml)，刺激细胞1 min，立即用流式细胞仪分析Ca2+浓度的变化。
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1.3 nur77基因表达的检测 将5×106各转染细胞不经抗体刺激或于150 μg/ml抗CD8单抗包被过的培养皿中刺激1、2和4 h后，离心收集细胞并提取总RNA，进行甲醛凝胶电泳后，按常规方法转至NC膜。以nur77 cDNA片段为模板，随机引物法标记探针。65℃预杂交液(0.25 mol Na2HPO4,pH7.4,7%SDS)中杂交30 min，加入标记好的探针杂交过夜。然后按常规进行洗膜，X光片曝光，洗片和观察杂交结果。
1.4 fas基因表达的检测 5×106转染细胞不经抗体刺激或于150 μg/ml抗CD8单抗包被过的培养皿中刺激4 h，离心收集细胞，用一步法提取总RNA。按下述方法进行RT-PCR反应：总RNA 3 μg(8 μl),Oligo(dT)2.5 μl和ddH2O 4.0 μl，混匀，离心，于95℃加热2～3 min后取出，缓慢冷却至室温。加入1.0 μl RNasin(50单位)、2.5 μl 10×逆转录反应缓冲液、2.5 μl 10×dNTP、2.5 μl BSA(1 mg/ml)和2.0 μl MMLV逆转录酶(Biolab，100单位)，置37℃水浴反应1.5 h。接着进行PCR反应，fas的引物为：
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fas: P1: 5′-CCGCCGCTCGAGTTATCGTCCAAAA-3′
P2: 5′-CGGCTCGAGTTATCCTTCCTCTTTGC-3′；
GAPDH：P1: 5′-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3′
P2: 5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。
PCR的条件为：2.5 μl 10×PCR缓冲液、1.5 μl dNTP、2.5 μl DMSO、1.0 μl P1、1.0 μl P2、3.0 μl逆转录产物、加双蒸水至总体积25.0 μl。94℃变性4 min，加入0.3 μl Taq酶，以50.0 μl矿物油覆盖。按94℃变性40 s、58℃退火1 min、72℃延伸40 s的条件，进行30个循环反应。同时以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)cDNA引物进行PCR，作为内对照。
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2 结果
2.1 4株转染细胞内蛋白酪氨酸的磷酸化 如图1所示，4株转染细胞经抗CD8单抗刺激后，蛋白质酪氨酸磷酸化增加，但T-JK细胞的磷酸化蛋白的种类和强度都高于3株表达CD8ε突变体的细胞。在T1-JK和T2-JK细胞中，其ITAM中的一个酪氨酸突变即可影响蛋白质的酪氨酸磷酸化。但在未受抗体刺激时，T1-JK和T2-JK细胞与野生型T-JK细胞相比，各有一种蛋白质发生显著的酪氨酸磷酸化，提示两个酪氨酸可能有不完全相同的功能。
图1 抗CD8单抗刺激前后4株转染细胞内蛋白质酪氨酸磷酸化的分析结果
Fig.1 Protein phosphorylation in transfectants stimulated with anti-CD8 mAb
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Note:1, 3, 5 and 7. T-JK, T1-JK, T2-JK and T3-JK cells without Ab Stimulation. 2, 4, 6 and 8. T-JK, T1-JK, T2-JK and T3-JK cells stimulated with Ab
2.2 4株转染细胞内Ca2+浓度的变化 将4株转染细胞先经Ca2+探针Fluo-3/AM处理，再用抗CD8单抗刺激1 min，以流式细胞仪测定抗体刺激前后细胞的荧光强度表示胞浆Ca2+浓度的变化。结果如图2所示，抗体刺激后，只有T-JK细胞胞浆Ca2+浓度迅速升高，T3-JK细胞没有变化，表明CD8ε的ITAM中两个酪氨酸同时突变，阻断了抗体刺激信号引起的Ca2+浓度变化。但有趣的是，在只有一个酪氨酸突变的T1-JK和T2-JK细胞中，胞浆Ca2+浓度略有下降，提示这两个酪氨酸的信号传递功能并不完全相同，也不是二者功能的简单叠加。
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图2 各转染细胞抗体刺激前(一)后(…)胞浆Ca2+浓度变化
Fig.2 Concentration of intracellular Ca2+ in the transfectants stimulated with (一) and without (…) anti-CD8 mAb
Note:A,B,C and D.T-JK,T1-JK,T2-JK and T3-JK cells respectively
2.3 4株转染细胞内nur77基因的表达 Northern印迹的结果如图3所示，未受抗CD8抗体刺激的4株转染细胞均无nur77 mRNA表达。抗体刺激1 h后，T-JK细胞中即有nur77 mRNA高表达；刺激2 h后nur77 mRNA的表达量达到最高；刺激4 h后仍能检测到nur77 mRNA。其余3株表达CD8ε突变体的细胞在抗体刺激后，nur77 mRNA的表达均没有明显升高，提示CD8ε的ITAM中酪氨酸的突变可阻断抗体的刺激信号。
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图3 抗体刺激后各转染细胞中nur77基因的表达
Fig.3 nur77 gene expression in transfectants stimulated with Ab
Note:1-4,5-8,9-12 and 13-16.T-JK,T1-JK,T2-JK and T3-JK cells stimulated with anti-CD8 mAb for 0,1,2 and 4 h respectively
2.4 4株转染细胞内fas基因的表达 4株转染细胞用150 μg/μl抗CD8单抗刺激4 h后，提取总RNA并进行RT-PCR和琼脂糖电泳。用GAPDH作内对照，检测4株转染细胞内fas基因的表达，结果如图4所示。在不受刺激的情况下，各转染细胞都有很微弱的fas mRNA表达。但在抗体刺激后，只有T-JK细胞的fas mRNA的表达量显著增高，其余3株转染细胞的fas mRNA表达量均无明显变化。提示CD8ε的ITAM中，两个酪氨酸中的任何一个发生突变，均可阻断细胞凋亡信号的传递，以及凋亡信号引起的下游凋亡基因fas的表达。
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图4 抗体刺激各转染细胞中fas mRNA的表达
Fig.4 fas mRNA expression in transfectants stimulated with and without Ab
Note:T-JK,T1-JK,T2-JK and T3-JK.4 cell lines respectively
3 讨论
nur77是属于核甾醇类受体家族的转录因子，它能够以单体或与其它因子结合的形式而发挥作用。在不同类型的细胞中，nur77能被不同信号所诱导而使细胞产生不同的效应[4]。nur77 也在细胞凋亡中起作用，但不同信号诱导表达的nur77 mRNA的结构不同，全长nur77 mRNA可使细胞凋亡，而缺少poly(A)+的mRNA则可调节细胞激活[5]。用减法杂交和反义RNA的方法，Woronicz等发现，TCR/CD3诱导的细胞凋亡依赖于立早基因nur77的表达，诱导细胞激活或凋亡的信号都能作用于nur77启动子上游的不同区域而激活nur77基因表达[5，6]。本研究结果表明，在TCR/CD3诱导的细胞凋亡过程中，蛋白质的酪氨酸磷酸化、细胞内Ca2+浓度的升高、nur77的表达与CD3ε-ITAM中两个酪氨酸位点的完整性是密切相关的。Woronicz的实验也表明，抗CD3单抗诱导的高浓度的Ca2+信号能诱导高水平nur77表达[5]，这与本实验的结果是一致的。
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fas是最重要的细胞凋亡基因之一。在未成熟胸腺细胞凋亡中，fas的表达并非必不可少，但激活T细胞、T细胞杂交瘤和肿瘤细胞的细胞凋亡都是通过fas及其配体FasL相互作用的途径而实现的。
fas基因在细胞凋亡中的表达调控目前还鲜有报道，在凋亡中，转录因子nur77所调节的靶基因尚未确定，但Ju等认为nur77可能上调FasL的表达[7]。本研究的实验结果进一步证实nur77是TCR/CD3介导的凋亡信号和细胞凋亡相关基因表达的桥梁。而且，实验结果也表明，在T-JK细胞中，nur77可能有上调fas基因表达的作用。考虑到fas与FasL相互作用非常密切，二者的表达受到相同转录因子的调节也是可能的。
本文首次证明CD3ε-ITAM中任何一个酪氨酸突变或两个酪氨酸同时突变都阻断凋亡信号传递而抑制T淋巴细胞凋亡。只有在完整的ITAM存在的情况下，才能诱导高水平的nur77基因表达，fas mRNA的表达水平也随之增加。CD3ε既能传递细胞激活的信号，又能传递细胞凋亡的信号，表明其上游信号是共同的，而nur77可能是调节细胞激活和凋亡的关键基因。nur77基因表达和fas与FasL表达调控机制的研究将有助于揭示细胞激活和凋亡调控过程的分子机制。
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①国家自然科学基金(批准号39470160)，卫生部基金(94-1-017)和中国医学科学院基金(931008)
作者简介：何亦平，男，25岁，硕士，主要研究细胞凋亡信号传递；
指导教师，郑德先，男，教授，博士生导师，主要研究生物化学和分子生物学
4 参考文献
[1] Weiss A. T cell antigen receptor signal transduction: a tale of tails and cytoplasmic protein tyrosine kinases. Cell, 1993；73:209
[2] 郑德先，郑 勇,Terhorst C et al.CD8α和CD3ε的融合分子介导T淋巴细胞凋亡.科学通报，1997;42(1)：84
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[3] 何亦平，刘彦信，郑 勇 et al.CD3ε胞浆区两个酪氨酸共同介导T淋巴细胞凋亡.科学通报，1998;43(12):1299
[4] Hazel T G，Nathans D,Lau L F et al.A gene inducible by serum growth factors encodes a member of the steroid and thyroid hormone receptor superfamily.Proc Natl Acad Sci USA,1988;85:8444
[5] Liu Z G,Smith S W,McLaughlin K A et al.Apoptotic signals delivered through the T-cell receptor of a T-cell hybrid require the immediate-early gene nur77.Nature,1994;367:291
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[6] Woronicz J D，Lina A,Calnan B J et al.Regulation of the Nur77 orphan steroid receptor in activation-induced apoptosis.Mol Cell Biol,1995;11:6364
[7] Ju S T,Panka D J,Cui H et al.Fas(CD95)/FasL interactions required for programmed cell death after T-cell activation.Nature,1995;373:444
〔收稿1997-09-06 修回1998-02-05〕, http://www.100md.com