单个核细胞促血浆凝固活性监测急性排斥反应的实验研究①
作者：许秀芳 石 镜 李温斌 陈宝田
单位：北京心肺血管疾病研究所细胞免疫室，北京100029
关键词：皮肤移植；急性排斥反应；PCA
中国免疫学杂志/990609 摘 要 目的：探讨将外周血单个核细胞(PBMNC)的促血浆凝固活性(PCA)用于急性排斥反应(AGR)监测的可能性。方法：将新西兰白兔随机分为3组：第1组做自体皮肤移植(8只)，第2、3组做异体皮肤移植(8、3只)，第3组于术前1 d至术后7 d皮下注射环孢霉素A 5 mg/(kg.d)。术后每天观察移植皮片的变化。术前1 d及术后隔日取耳缘静脉血测PCA和激活淋巴细胞计数，同时取移植皮肤组织作病理检查。结果：同种异体皮肤移植动物在出现AGR前，其PBMNC离体后不经培养即表现较强的促凝活性(SPCA)，经供体抗原刺激后的PCA(DAgPCA)活性也于AGR 前开始增强，而且表明具有抗原特异性。结论：PCA检测方法在AGR早期监测方面有一定的应用前景。
, 百拇医药
中国图书分类号 R392.7
Study on monitoring acute graft rejection by PCA of MNC
XU Xiu-Fang, SHI Jing, LI Wen-Bin et al.
Department of Cellular Immunology, Beijing Heart Lung and Blood Vessel Institute, Beijing 100029
Abstract Objective:The sequential changes of procoagulant activity(PCA) level in mononuclear cells (MNC) of rabbits which received skin allograft were studied in the paper in order to assess it as a marker for monitoring of acute graft rejection (AGR). Methods:New Zealand white rabbits(NZW)were random divided into three groups: rabbits in group 1(control) received autogenous skin transplants; rabbits in group 2, 3 received allogenic skin transplants(a grey rabbit as a donor), and rabbits in group 3 were treated with cyclosporin A (CsA) at 5 mg/(kg.d) once daily subcutaneously for up to 9 days since the day before operation. Heparinized peripheral blood was drawn from each animal on the day of the operation and every other day after the operation. MNC were separated by Ficoll-Hypaque before PCA measurement. The activated lymphocytes were counted at the same time. Morphologic changes of the skin grafts were observed every day after transplant operation. Results:PBMNC of the animals which received allograft had larger amounts of PCA before the day of AGR, in addition, donor antigen during culture of PBMNC further enhanced PCA(DAgPCA) level in animals with AGR. Conclusion:PCA may be as markers of AGR. DAgPCA is a specific marker.
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Key words Skin allograft Acute graft rejection PCA
脏器移植面临的一个重要问题是急性排斥反应(AGR)，选择非创伤性的免疫检测指标及早期预测AGR一直是人们关注的热点。在AGR的早期，受者的淋巴细胞与移植物表面的异己抗原相遇后，T淋巴细胞受到该抗原刺激而被激活。激活的T淋巴细胞诱导单核巨噬细胞产生凝血激酶样物质或称细胞相关因子，它是一种膜脂蛋白，能激活凝血系统,表现PCA活性[1]。
本文拟以同种异体皮肤移植的新西兰白兔(New Zealand white rabbits,NZW)作为检测对象，进一步观察发生AGR前后的免疫反应过程中外周血单个核细胞PCA水平的动态变化规律，以探讨PCA作为急性排斥反应检测指标的可能性。
1 材料与方法
1.1 实验动物 皮肤移植受者：NZW，雌雄不限，青壮年兔，19只。皮肤移植皮片供者：青紫兰灰兔,2只。正常兔血浆供者：NZW，雌雄不限,青壮年兔，6只。以上所用27只兔均购自中国药品生物制品检定所实验动物繁育场，于一级动物室喂养。无关抗原供者：大鼠，1只，约250 g，Wistar系，由本所动物室提供。
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1.2 皮肤移植手术及药物处理 麻醉：氯胺酮44 mg/kg， 腹腔注射。皮肤移植[2]：自体皮肤移植：剪下8只白兔3 cm×3 cm全层皮片分别作原位移植，为第1组。同种异体皮肤移植：将灰兔皮肤3 cm×3 cm大小分别移植在11只白兔背部皮床，其中8只不给免疫抑制药为第2组，3只于术前1 d至术后7 d 每天皮下注射环孢霉素A 5 mg/(kg.d)为第3组。
1.3 检查方法
1.3.1 肉眼观察及照相 移植后每天早晚各观察皮片1次并摄像记录。移植皮片存活的表现：粉红色、皮薄、质柔软；发生AGR时皮片的表现：皮片变硬、点状或片状发黑[3]。观察同时照相。
1.3.2 移植皮片病理标本检查 移植后隔日取全层皮片少许置于10%福尔马林中固定，待做普通病理检查。
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1.3.3 PCA的测定操作 实验用的血浆制备和PCA测定参照武建国的方法[4]。单个核细胞悬液制备：移植术当天及术后1、3、5、7、9、11、13 d取移植受者NZW耳缘静脉血各2 ml分离单个核细胞，加RPMI 1640，制成1×107 ml-1细胞悬液[4]。供体抗原的制备：用供体耳静脉血，分离MNC制备出供体抗原。大鼠抗原的制备：以大鼠脾脏MNC制备大鼠抗原(RAg)。MNC的处理：1×107 ml-1MNC悬液加于微孔培养板孔内，每只动物的MNC分装8孔，分为4组(a 、b 、c 、d)，每组2孔。a组细胞即刻测PCA；b组细胞孔内加RPMI 1640；c组细胞孔内加供体抗原；d组细胞孔内加大鼠抗原，b 、 c 、d 3组细胞置37℃水浴温育2 h。PCA测定：a 、b 、c 、d 各组细胞1 000 r/min，离心20 min，弃尽上清后，分别加混合血浆和CaCl2，立即记时，记录血浆凝固时间(以秒为单位)。各组的血浆凝固时间分别以a 、 b 、 c 、 d表示。血浆复钙时间(A)测定：混合血浆加CaCl2后，立即记时，记录血浆凝固时间[4]。
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1.3.4 PCA百分率计算方法 自然PCA(Spontaneous PCA, SPCA)
1.4 激活淋巴细胞百分率(Actlym%)测定 MNC悬液制备完成后立即涂片，显微镜下观察计数淋巴细胞率。
1.5 统计学处理 各组动物各时间段的SPCA%及Actlym%、DAgPCA%、RAgPCA%等测值及出现AGR时间以均值±标准差表示,SPCA与CPCA和SPCA与Actlym作直线相关和直线回归分析。
2 结果
2.1 移植皮片生长情况 确定AGR的肉眼观察指标是移植皮片变硬及出现黑点。自体皮片移植组,皮片生长良好,8 d伤口痊愈,皮片颜色和硬度始终正常,未出现AGR；同种异体移植皮片发生AGR的时间:未给CsA的第2组为(7.75±0.71) d，给CsA的第3组为(11.67±0.58) d。
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2.2 各组SPCA%、CPCA%、Actlym%和DAgPCA%的水平动态 第1组受者术后SPCA%、CPCA%和Actlym% 3项指标始终无明显升高；第2组和第3组受者术后SPCA%、CPCA% 、Actlym%和DAgPCA%在AGR出现前2～3 d开始升高，于AGR当天或前1 d达高峰，该4项指标在此之前均维持在基础水平，见图1。
图1 3组动物DAgPCA%变化时间曲线
Fig.1 Changes of DAgPCA% in three groups
Note:vertical line shows the time of AGR
对19只动物共112次的测定值所作的相关分析表明SPCA%和Actlym%呈显著正相关(r=0.923,P<0.001,Y=1.244X+2.268)。 SPCA%与CPCA%测值呈显著正相关(r=0.972,P<0.001,Y=1.641X-10.341),回归方程显示SPCA较CPCA敏感。
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2.3 RAgPCA%的水平动态 各组术后RAgPCA%均保持在基础水平，无升高趋势。
2.4 病理检查 病理报告同种移植术后第1天和自体移植术后第1天相似,都是无明显淋巴细胞浸润,同种移植皮片于AGR发生前2～3 d血管增多,有散在的单个核细胞浸润,AGR发生时即第2组术后第7天和第3组术后第11天可见真皮广泛的单个核细胞浸润;自体移植皮片于术后第7天无明显单个核细胞浸润。
3 讨论
器官移植术后须监测AGR的发生,对于某些器官(例如心脏)移植受者,目前还主要依靠心肌心内膜活检来诊断AGR。
免疫学工作者们在致力于探讨器官移植AGR的无创伤性免疫学监测指标,例如血清白细胞介素2受体(sIL-2R)等，但是至今尚未被临床工作者采纳，其原因可考虑这些免疫指标测定值个体差异甚大,不易划出“正常值”和“AGR参考值”之间的界限，而且在感染时这些指标也升高,迄今所见文献上发表的免疫指标除CD4/CD8之外都不能鉴别AGR和感染。本文期望采用经改进PCA法来找出解决上述问题的途径。
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有人认为MNC经体外培养后产生PCA活性，本文称这种PCA为CPCA。我们的实验表明刚分离出来的PBMNC即可测出PCA，本文称之为SPCA，并发现SPCA与CPCA呈显著正相关。因为SPCA有所需时间短、操作简便及反应灵敏等优点,所以今后可选用SPCA。由于SPCA属于非特异性指标，所以单根据SPCA升高并不能确认AGR的发生。SPCA与其他免疫学指标一样，由于其基础测值个体差异较大，使临床工作者难于判断某一次检测结果的临床意义。本文的数据显示出，各个体的SPCA时间曲线图形很相似，可考虑将某个体的基础测值即术后第1天的测值作为自身正常参照值，用以衡量以后的测值是否升高及升高的幅度。
我们用供体抗原刺激PBMNC 2 h(37℃)之后测定PCA(DAgPCA),结果显示自体移植受者的DAgPCA都不升高,而同种移植的第2组动物在AGR发生前2～3 d DAgPCA就开始升高,并迅速达到高峰,第3组动物在用CsA期间DAgPCA不升高，而在停药后出现AGR前2～3 d测值升高，在AGR前1 d或当天达高峰。用非供体抗原(大鼠抗原)刺激各组受者的MNC后测PCA则始终无升高趋势。
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Fieguth等确认激活淋巴细胞率可反映心脏移植AGR[5]。我们在测SPCA的同时作了Actlym率计数,发现二者呈显著正相关。期望在今后的临床工作中同时测SPCA与Actlym率,互相验证以弥补技术操作误差带来的不良影响。
因此建立一假设，即在移植受者发生AGR前，SPCA和DAgPCA升高；在受者发生感染而未发生AGR时，SPCA升高而 DAgPCA不升高。本研究室正在以动物实验考证这一假设。
①本课题受到北京市科学技术委员会资助(No.853670700)
作者简介：许秀芳，女，28岁，硕士，主要从事细胞免疫学研究；
石 镜，女，61岁，硕士生导师，副研究员，主要从事细胞免疫学研究
4 参考文献
, http://www.100md.com
1 Edgington T S,Heikki H.Allogeneic induction of the human T cellinstructed monocyte procoagulant response is rapid and is elicited by HLA-DR.J Exp Med，1983;158:96
2 邢 新，许丰勋，郭恩覃.异种、同种及自体皮肤移植后组织形态及血管变化的比较.中华整形烧伤外科杂志，1993;9(2)：115
3 郑怀恩,程天民, 林 远et al.重度放烧复合伤大鼠异体植皮后皮肤病理学观察. 中华整形烧伤外科杂志，1991;7(2):116
4 武建国主编.实用临床免疫学检验.南京:江苏科学技术出版社,1989：158
5 Fieguth H G, Haverich A,Schafers H J et al. Cytoimmunologic monitoring for the noninvasive diagnosis of cardiac rejection.Transplant Proc，1987;19:2541
[收稿1997-12-18 二次修回1998-05-25], 百拇医药
单位：北京心肺血管疾病研究所细胞免疫室，北京100029
关键词：皮肤移植；急性排斥反应；PCA
中国免疫学杂志/990609 摘 要 目的：探讨将外周血单个核细胞(PBMNC)的促血浆凝固活性(PCA)用于急性排斥反应(AGR)监测的可能性。方法：将新西兰白兔随机分为3组：第1组做自体皮肤移植(8只)，第2、3组做异体皮肤移植(8、3只)，第3组于术前1 d至术后7 d皮下注射环孢霉素A 5 mg/(kg.d)。术后每天观察移植皮片的变化。术前1 d及术后隔日取耳缘静脉血测PCA和激活淋巴细胞计数，同时取移植皮肤组织作病理检查。结果：同种异体皮肤移植动物在出现AGR前，其PBMNC离体后不经培养即表现较强的促凝活性(SPCA)，经供体抗原刺激后的PCA(DAgPCA)活性也于AGR 前开始增强，而且表明具有抗原特异性。结论：PCA检测方法在AGR早期监测方面有一定的应用前景。
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中国图书分类号 R392.7
Study on monitoring acute graft rejection by PCA of MNC
XU Xiu-Fang, SHI Jing, LI Wen-Bin et al.
Department of Cellular Immunology, Beijing Heart Lung and Blood Vessel Institute, Beijing 100029
Abstract Objective:The sequential changes of procoagulant activity(PCA) level in mononuclear cells (MNC) of rabbits which received skin allograft were studied in the paper in order to assess it as a marker for monitoring of acute graft rejection (AGR). Methods:New Zealand white rabbits(NZW)were random divided into three groups: rabbits in group 1(control) received autogenous skin transplants; rabbits in group 2, 3 received allogenic skin transplants(a grey rabbit as a donor), and rabbits in group 3 were treated with cyclosporin A (CsA) at 5 mg/(kg.d) once daily subcutaneously for up to 9 days since the day before operation. Heparinized peripheral blood was drawn from each animal on the day of the operation and every other day after the operation. MNC were separated by Ficoll-Hypaque before PCA measurement. The activated lymphocytes were counted at the same time. Morphologic changes of the skin grafts were observed every day after transplant operation. Results:PBMNC of the animals which received allograft had larger amounts of PCA before the day of AGR, in addition, donor antigen during culture of PBMNC further enhanced PCA(DAgPCA) level in animals with AGR. Conclusion:PCA may be as markers of AGR. DAgPCA is a specific marker.
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Key words Skin allograft Acute graft rejection PCA
脏器移植面临的一个重要问题是急性排斥反应(AGR)，选择非创伤性的免疫检测指标及早期预测AGR一直是人们关注的热点。在AGR的早期，受者的淋巴细胞与移植物表面的异己抗原相遇后，T淋巴细胞受到该抗原刺激而被激活。激活的T淋巴细胞诱导单核巨噬细胞产生凝血激酶样物质或称细胞相关因子，它是一种膜脂蛋白，能激活凝血系统,表现PCA活性[1]。
本文拟以同种异体皮肤移植的新西兰白兔(New Zealand white rabbits,NZW)作为检测对象，进一步观察发生AGR前后的免疫反应过程中外周血单个核细胞PCA水平的动态变化规律，以探讨PCA作为急性排斥反应检测指标的可能性。
1 材料与方法
1.1 实验动物 皮肤移植受者：NZW，雌雄不限，青壮年兔，19只。皮肤移植皮片供者：青紫兰灰兔,2只。正常兔血浆供者：NZW，雌雄不限,青壮年兔，6只。以上所用27只兔均购自中国药品生物制品检定所实验动物繁育场，于一级动物室喂养。无关抗原供者：大鼠，1只，约250 g，Wistar系，由本所动物室提供。
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1.2 皮肤移植手术及药物处理 麻醉：氯胺酮44 mg/kg， 腹腔注射。皮肤移植[2]：自体皮肤移植：剪下8只白兔3 cm×3 cm全层皮片分别作原位移植，为第1组。同种异体皮肤移植：将灰兔皮肤3 cm×3 cm大小分别移植在11只白兔背部皮床，其中8只不给免疫抑制药为第2组，3只于术前1 d至术后7 d 每天皮下注射环孢霉素A 5 mg/(kg.d)为第3组。
1.3 检查方法
1.3.1 肉眼观察及照相 移植后每天早晚各观察皮片1次并摄像记录。移植皮片存活的表现：粉红色、皮薄、质柔软；发生AGR时皮片的表现：皮片变硬、点状或片状发黑[3]。观察同时照相。
1.3.2 移植皮片病理标本检查 移植后隔日取全层皮片少许置于10%福尔马林中固定，待做普通病理检查。
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1.3.3 PCA的测定操作 实验用的血浆制备和PCA测定参照武建国的方法[4]。单个核细胞悬液制备：移植术当天及术后1、3、5、7、9、11、13 d取移植受者NZW耳缘静脉血各2 ml分离单个核细胞，加RPMI 1640，制成1×107 ml-1细胞悬液[4]。供体抗原的制备：用供体耳静脉血，分离MNC制备出供体抗原。大鼠抗原的制备：以大鼠脾脏MNC制备大鼠抗原(RAg)。MNC的处理：1×107 ml-1MNC悬液加于微孔培养板孔内，每只动物的MNC分装8孔，分为4组(a 、b 、c 、d)，每组2孔。a组细胞即刻测PCA；b组细胞孔内加RPMI 1640；c组细胞孔内加供体抗原；d组细胞孔内加大鼠抗原，b 、 c 、d 3组细胞置37℃水浴温育2 h。PCA测定：a 、b 、c 、d 各组细胞1 000 r/min，离心20 min，弃尽上清后，分别加混合血浆和CaCl2，立即记时，记录血浆凝固时间(以秒为单位)。各组的血浆凝固时间分别以a 、 b 、 c 、 d表示。血浆复钙时间(A)测定：混合血浆加CaCl2后，立即记时，记录血浆凝固时间[4]。
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1.3.4 PCA百分率计算方法 自然PCA(Spontaneous PCA, SPCA)
1.4 激活淋巴细胞百分率(Actlym%)测定 MNC悬液制备完成后立即涂片，显微镜下观察计数淋巴细胞率。
1.5 统计学处理 各组动物各时间段的SPCA%及Actlym%、DAgPCA%、RAgPCA%等测值及出现AGR时间以均值±标准差表示,SPCA与CPCA和SPCA与Actlym作直线相关和直线回归分析。
2 结果
2.1 移植皮片生长情况 确定AGR的肉眼观察指标是移植皮片变硬及出现黑点。自体皮片移植组,皮片生长良好,8 d伤口痊愈,皮片颜色和硬度始终正常,未出现AGR；同种异体移植皮片发生AGR的时间:未给CsA的第2组为(7.75±0.71) d，给CsA的第3组为(11.67±0.58) d。
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2.2 各组SPCA%、CPCA%、Actlym%和DAgPCA%的水平动态 第1组受者术后SPCA%、CPCA%和Actlym% 3项指标始终无明显升高；第2组和第3组受者术后SPCA%、CPCA% 、Actlym%和DAgPCA%在AGR出现前2～3 d开始升高，于AGR当天或前1 d达高峰，该4项指标在此之前均维持在基础水平，见图1。
图1 3组动物DAgPCA%变化时间曲线
Fig.1 Changes of DAgPCA% in three groups
Note:vertical line shows the time of AGR
对19只动物共112次的测定值所作的相关分析表明SPCA%和Actlym%呈显著正相关(r=0.923,P<0.001,Y=1.244X+2.268)。 SPCA%与CPCA%测值呈显著正相关(r=0.972,P<0.001,Y=1.641X-10.341),回归方程显示SPCA较CPCA敏感。
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2.3 RAgPCA%的水平动态 各组术后RAgPCA%均保持在基础水平，无升高趋势。
2.4 病理检查 病理报告同种移植术后第1天和自体移植术后第1天相似,都是无明显淋巴细胞浸润,同种移植皮片于AGR发生前2～3 d血管增多,有散在的单个核细胞浸润,AGR发生时即第2组术后第7天和第3组术后第11天可见真皮广泛的单个核细胞浸润;自体移植皮片于术后第7天无明显单个核细胞浸润。
3 讨论
器官移植术后须监测AGR的发生,对于某些器官(例如心脏)移植受者,目前还主要依靠心肌心内膜活检来诊断AGR。
免疫学工作者们在致力于探讨器官移植AGR的无创伤性免疫学监测指标,例如血清白细胞介素2受体(sIL-2R)等，但是至今尚未被临床工作者采纳，其原因可考虑这些免疫指标测定值个体差异甚大,不易划出“正常值”和“AGR参考值”之间的界限，而且在感染时这些指标也升高,迄今所见文献上发表的免疫指标除CD4/CD8之外都不能鉴别AGR和感染。本文期望采用经改进PCA法来找出解决上述问题的途径。
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有人认为MNC经体外培养后产生PCA活性，本文称这种PCA为CPCA。我们的实验表明刚分离出来的PBMNC即可测出PCA，本文称之为SPCA，并发现SPCA与CPCA呈显著正相关。因为SPCA有所需时间短、操作简便及反应灵敏等优点,所以今后可选用SPCA。由于SPCA属于非特异性指标，所以单根据SPCA升高并不能确认AGR的发生。SPCA与其他免疫学指标一样，由于其基础测值个体差异较大，使临床工作者难于判断某一次检测结果的临床意义。本文的数据显示出，各个体的SPCA时间曲线图形很相似，可考虑将某个体的基础测值即术后第1天的测值作为自身正常参照值，用以衡量以后的测值是否升高及升高的幅度。
我们用供体抗原刺激PBMNC 2 h(37℃)之后测定PCA(DAgPCA),结果显示自体移植受者的DAgPCA都不升高,而同种移植的第2组动物在AGR发生前2～3 d DAgPCA就开始升高,并迅速达到高峰,第3组动物在用CsA期间DAgPCA不升高，而在停药后出现AGR前2～3 d测值升高，在AGR前1 d或当天达高峰。用非供体抗原(大鼠抗原)刺激各组受者的MNC后测PCA则始终无升高趋势。
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Fieguth等确认激活淋巴细胞率可反映心脏移植AGR[5]。我们在测SPCA的同时作了Actlym率计数,发现二者呈显著正相关。期望在今后的临床工作中同时测SPCA与Actlym率,互相验证以弥补技术操作误差带来的不良影响。
因此建立一假设，即在移植受者发生AGR前，SPCA和DAgPCA升高；在受者发生感染而未发生AGR时，SPCA升高而 DAgPCA不升高。本研究室正在以动物实验考证这一假设。
①本课题受到北京市科学技术委员会资助(No.853670700)
作者简介：许秀芳，女，28岁，硕士，主要从事细胞免疫学研究；
石 镜，女，61岁，硕士生导师，副研究员，主要从事细胞免疫学研究
4 参考文献
, http://www.100md.com
1 Edgington T S,Heikki H.Allogeneic induction of the human T cellinstructed monocyte procoagulant response is rapid and is elicited by HLA-DR.J Exp Med，1983;158:96
2 邢 新，许丰勋，郭恩覃.异种、同种及自体皮肤移植后组织形态及血管变化的比较.中华整形烧伤外科杂志，1993;9(2)：115
3 郑怀恩,程天民, 林 远et al.重度放烧复合伤大鼠异体植皮后皮肤病理学观察. 中华整形烧伤外科杂志，1991;7(2):116
4 武建国主编.实用临床免疫学检验.南京:江苏科学技术出版社,1989：158
5 Fieguth H G, Haverich A,Schafers H J et al. Cytoimmunologic monitoring for the noninvasive diagnosis of cardiac rejection.Transplant Proc，1987;19:2541
[收稿1997-12-18 二次修回1998-05-25], 百拇医药