活化条件对细胞内免疫染色IFNγ和IL-4法检测人外周血Th1和Th2细胞的影响
作者：叶丽娅 王前奔 赵武述
单位：中日友好医院临床医学研究所免疫室，北京100029
关键词：IFNγ阳性细胞；IL-4阳性细胞；Th细胞亚群；酶联免疫斑点法
中国免疫学杂志/990613 摘 要 目的：研究细胞活化条件对Th1和Th2细胞测定的影响。方法：采用酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay， ELISPOT)测定活化细胞胞浆内的细胞因子。IFNγ阳性者为Th1细胞，IL-4阳性者为Th2细胞。结果：ionomycin+PMA，PHA+PMA或Ca2+载体+PMA刺激5 h，IL-4阳性率均在13%～14%；IFNγ阳性细胞分别为(7.34±4.71)%、(7.56±4.70)%和(8.97±5.60)%，而刺激16 h时，IFNγ阳性率分别变为(11.19±4.72)%、(6.88±1.75)%和(5.94±2.84)%，有明显差异。结论：活化条件影响Th细胞亚群的测定。
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中国图书分类号 R392.12
Effect of activation conditions on the detection of Th1 and Th2 cells in human
peripheral blood using intracellular immunostaining IFNγ and IL-4
YE Li-Ya, WANG Qian-Ben，ZHAO Wu-Shu.
Department of Immunology,China Japan Friendship Institute of Clinical Medical Sciences, Beijing 100029
Abstract Objective:The influence of activation conditions on the detection of Th1 and Th2 cells in human peripheral blood was examined.Method:Intracellular immunostaining assay determined the expression and secretion of IFN-γ and IL-4 at the single cell level. Results: IL-4 positive cell frequency was as high as 13% to 14% using biotin-streptavidin/alkline phosphates visualization system and IFN-γ positive cell frequencies were different with different stimulators and activation time.Conclusion:The detection of Th cell subsets was influenced by the activation conditions.
, 百拇医药
Key words IFN-γ positive cell IL-4 positive cell Th subset Biotin-strep tavidin/alkline
Th细胞亚群的失衡与感染性疾病、自身免疫病、过敏性疾病等多种疾病的发生有着密切的关系[1]。建立简单易行的检测Th细胞亚群的方法，是研究Th细胞亚群与疾病关系的基础 。我们曾用APAAP法检测了人外周血CD4 T细胞和PBMC中的Th细胞亚群[2]。在此基础上，本文运用生物素-链霉卵白素检测系统，比较了用 ionomycin+PMA、PHA+PMA和Ca2+ ionophore+PMA三种细胞刺激条件，以及两种不同刺激时间对测定的影响，以期获得检测 Th细胞亚群的最佳条件。
1 材料与方法
1.1 材料 IFNγ和IL-4单克隆抗体(购自美国R&D公司)，生物素-链霉卵白素碱性磷酸酶检测试剂盒〔购自美国LAB VISION公司产品)，皂素(sapo-nin)，莫能菌素(monensin)，PHA-P、依诺霉素(ionomy-
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cin)、Ca2+离子载体(Ca2+ionophore)和PMA(购自美国Sigma公司)。T细胞亚群测定盒(购自军科院)。
1.2 研究对象 16例健康志愿者，均为本院职工。男8例，女8例，年龄22～57岁，平均年龄37岁。
1.3 研究方法
1.3.1 准备 将PBMC调至1×106ml-1，在24孔细胞培养板上培养。分别加入ionomycin 3 μmol/L+PMA 1 ng+莫能菌素3 μmol/L，PHA 3 μg+PMA 1 ng+莫能菌素3 μmol/L或Ca2+ionophore 2 μmol/L+PMA 1 ng+莫能菌素3 μmol/L 。分别于第6小时和第16小时后测定Th1和Th2。将刺激后的细胞取出用PBS洗2遍涂片。
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1.3.2 细胞因子胞浆内染色 除改用生物素-链霉卵白素碱性磷酸酶显示外，其余操作均同前报道[2]。
1.3.3 T细胞亚群测定 用未刺激的PBMC涂片检测T细胞亚群。
2 结果
2.1 T细胞亚群测定 16例正常人CD3 T细胞(73.69±7.66)%，CD4 T细胞(44.50±6.24)%，CD8 T细胞为(26.94±5.70)%，CD4/CD8为(1.74±0.54)%。
2.2 PBMC中的IFNγ阳性和IL-4阳性细胞 不同刺激条件下，活化5 h和16 h，IFNγ阳性细胞的百分率及活化5 h IL-4阳性细胞之百分率，如表1所示。三种刺激条件下活化5 h，IL-4阳性细胞率相近，在13%～14%之间。活化条件影响不大，但三种刺激条件，对IFNγ阳性细胞率有影响，尤其是在活化16 h，ionomycin+PMA组是其它二组值的近2倍。
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表1 不同活化条件下正常人PBMC中IFNγ和IL-4阳性分泌细胞百分率(
±s)
Tab.1 Percentages of IFNγ secreting cells and IL-4 secreting cells in activated PBMC from normal subjects with different stimulations (±s) Stimulators
IFNγ positive cells(%) (n=16)
IL-4 positive cells(%) (n=10)
5 h
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16 h
5 h
Ionomycin+PMA
7.34±4.71
11.19±4.72
13.10±5.53
PHA+PMA
7.56±4.70
6.88±1.75
14.00±5.70
Ca2+ionophore+PMA
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8.97±5.06
5.94±2.84
14.20±5.57
2.3 IFNγ阳性和IL-4阳性细胞比 其结果如表2所示。在活化5 h时，三种刺激条件下IFNγ阳性细胞和IL-4阳性细胞之比无显著差异。表2 不同活化条件下正常人PBMC中IFNγ/IL-4(Th1/Th2)比值 (±s)
Tab.2 The ratio between IFNγ and IL-4 secreting cells in activated PBMC from normal subjects with different stimulations (±s) Stimulators
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IFNγ (5 h)/IL-4
Ionomycin+PMA
0.46±0.29
PHA+PMA
0.40±0.17
Ca2+ ionophore+PMA
0.59±0.32
3 讨论
人类PBMC活化后产生 IFNγ/IL-4的条件已有一些报道。Jung用1 μmol/L ionomycin 和1 ng/ml pmol/LA刺激正常 人PBMC在 6～8 h时 IFNγ分泌细胞阳性率最高，约为12%[3]，而Tang用 50 ng/ml pmol/LA和 2 μmol/L Ca2+离子载体刺激正常人 PBMC，在6 h时 INFγ约为12%[4]，我们曾用 PHA 3 μmol/L和 PMA 1 ng/ml 刺激正常人PBMC，在16 h时IFNγ分泌细胞阳性率为6%[2]。由于大部分报道证明IFNγ阳性分泌细胞出现的高峰为6 h和16 h左右，考虑到实验时间安排的方便，我们选择了5 h和16 h 2个时相，首次采用灵敏的生物素-链霉卵白素检测系统，比较了用 ionomycin和PMA联合刺激、PHA和PMA联合刺激、Ca2+离子载体和PMA联合刺激三种方法对IFNγ分泌细胞阳性率的影响，结果在5 h时三种方法之间没有显著差异,以Ca2+离子载体联合PMA刺激所得的值稍高(约为8.9%)。16 h时则以ionomycin和PMA联合刺激法所得IFNγ阳性分泌细胞最高(约为11%)，明显高于其它二种方法 (分别约为7%和6%) (P<0.01,P<0.001)，但仍略低于国外报道值。据国外报道，IL-4阳性分泌细胞无论何种刺激剂，都仅 在刺激后2～8 h出现，且阳性率仅为1%～2%[3,6]。我们也曾用APAAP法，以PHA 3 μmol/L和 PMA 1 ng/ml联合刺激，检测了11例正常人的IL-4阳性分泌细胞，结果为1%，与国外报道一致[2]。本文改用生物素-链霉卵白素检测系统在三种刺激条件下IL-4阳性细胞百分率，结果明 显提高至13%～14%，明显高于国外报道值，提示IL-4原先可能因为分泌量少、抗原信号较弱等 因素不易检出其阳性分泌细胞。采用更灵敏的放大系统后可以较容易地检出，且生物素-链霉卵白素检测系统不仅提高了阳性率，而且使阳性和阴性细胞更易区分。
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作者简介：叶丽娅，女，42岁，主管技师，主要从事临床免疫学工作；
王前奔，男，25岁，实习研究员，从事临床免疫学工作；
赵武述，男，58岁，研究员，博士生导师，主要从事免疫调节研究
4 参考文献
1 Romagnani S. TH1 and TH2 in human diseases.Clin Immuno Immunopathology,1996;80:225
2 王前奔，叶丽娅，赵武述.人外周血CD4 T细胞和PBMC中Th1和Th2细胞免疫组化检测的初步研究.中国免疫学杂志，1997；13(增)：5
3 Jung T,Schauer U, Heusser C et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.J Immunol Method,1993;159:197
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4 Tang M,Kemp A.Production and secretion of interferon-gamma(IFNγ) in children with atopic dermatitis.Clin Exp Immunol,1994;95:66
5 Kabilan L,Andersson G,Lolli F et al.Detection of intracellular expression and secretion of interferon-γ at the single-cell level after activation of human T cells with tetanus toxoid in vitro.Eur J Immunol,1990;20:1085
6 Andersson U,Andersson J,Lindfors A et al. Simultaneous production of interleukin 2,interleukin 4 and interferon-γ by activated human blood lymphocytes. Eur J Immunol,1990;20:1591
〔收稿1996-06-09 修回1997-10-27〕, 百拇医药
单位：中日友好医院临床医学研究所免疫室，北京100029
关键词：IFNγ阳性细胞；IL-4阳性细胞；Th细胞亚群；酶联免疫斑点法
中国免疫学杂志/990613 摘 要 目的：研究细胞活化条件对Th1和Th2细胞测定的影响。方法：采用酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay， ELISPOT)测定活化细胞胞浆内的细胞因子。IFNγ阳性者为Th1细胞，IL-4阳性者为Th2细胞。结果：ionomycin+PMA，PHA+PMA或Ca2+载体+PMA刺激5 h，IL-4阳性率均在13%～14%；IFNγ阳性细胞分别为(7.34±4.71)%、(7.56±4.70)%和(8.97±5.60)%，而刺激16 h时，IFNγ阳性率分别变为(11.19±4.72)%、(6.88±1.75)%和(5.94±2.84)%，有明显差异。结论：活化条件影响Th细胞亚群的测定。
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中国图书分类号 R392.12
Effect of activation conditions on the detection of Th1 and Th2 cells in human
peripheral blood using intracellular immunostaining IFNγ and IL-4
YE Li-Ya, WANG Qian-Ben，ZHAO Wu-Shu.
Department of Immunology,China Japan Friendship Institute of Clinical Medical Sciences, Beijing 100029
Abstract Objective:The influence of activation conditions on the detection of Th1 and Th2 cells in human peripheral blood was examined.Method:Intracellular immunostaining assay determined the expression and secretion of IFN-γ and IL-4 at the single cell level. Results: IL-4 positive cell frequency was as high as 13% to 14% using biotin-streptavidin/alkline phosphates visualization system and IFN-γ positive cell frequencies were different with different stimulators and activation time.Conclusion:The detection of Th cell subsets was influenced by the activation conditions.
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Key words IFN-γ positive cell IL-4 positive cell Th subset Biotin-strep tavidin/alkline
Th细胞亚群的失衡与感染性疾病、自身免疫病、过敏性疾病等多种疾病的发生有着密切的关系[1]。建立简单易行的检测Th细胞亚群的方法，是研究Th细胞亚群与疾病关系的基础 。我们曾用APAAP法检测了人外周血CD4 T细胞和PBMC中的Th细胞亚群[2]。在此基础上，本文运用生物素-链霉卵白素检测系统，比较了用 ionomycin+PMA、PHA+PMA和Ca2+ ionophore+PMA三种细胞刺激条件，以及两种不同刺激时间对测定的影响，以期获得检测 Th细胞亚群的最佳条件。
1 材料与方法
1.1 材料 IFNγ和IL-4单克隆抗体(购自美国R&D公司)，生物素-链霉卵白素碱性磷酸酶检测试剂盒〔购自美国LAB VISION公司产品)，皂素(sapo-nin)，莫能菌素(monensin)，PHA-P、依诺霉素(ionomy-
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cin)、Ca2+离子载体(Ca2+ionophore)和PMA(购自美国Sigma公司)。T细胞亚群测定盒(购自军科院)。
1.2 研究对象 16例健康志愿者，均为本院职工。男8例，女8例，年龄22～57岁，平均年龄37岁。
1.3 研究方法
1.3.1 准备 将PBMC调至1×106ml-1，在24孔细胞培养板上培养。分别加入ionomycin 3 μmol/L+PMA 1 ng+莫能菌素3 μmol/L，PHA 3 μg+PMA 1 ng+莫能菌素3 μmol/L或Ca2+ionophore 2 μmol/L+PMA 1 ng+莫能菌素3 μmol/L 。分别于第6小时和第16小时后测定Th1和Th2。将刺激后的细胞取出用PBS洗2遍涂片。
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1.3.2 细胞因子胞浆内染色 除改用生物素-链霉卵白素碱性磷酸酶显示外，其余操作均同前报道[2]。
1.3.3 T细胞亚群测定 用未刺激的PBMC涂片检测T细胞亚群。
2 结果
2.1 T细胞亚群测定 16例正常人CD3 T细胞(73.69±7.66)%，CD4 T细胞(44.50±6.24)%，CD8 T细胞为(26.94±5.70)%，CD4/CD8为(1.74±0.54)%。
2.2 PBMC中的IFNγ阳性和IL-4阳性细胞 不同刺激条件下，活化5 h和16 h，IFNγ阳性细胞的百分率及活化5 h IL-4阳性细胞之百分率，如表1所示。三种刺激条件下活化5 h，IL-4阳性细胞率相近，在13%～14%之间。活化条件影响不大，但三种刺激条件，对IFNγ阳性细胞率有影响，尤其是在活化16 h，ionomycin+PMA组是其它二组值的近2倍。
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表1 不同活化条件下正常人PBMC中IFNγ和IL-4阳性分泌细胞百分率(
±s)Tab.1 Percentages of IFNγ secreting cells and IL-4 secreting cells in activated PBMC from normal subjects with different stimulations (
±s) StimulatorsIFNγ positive cells(%) (n=16)
IL-4 positive cells(%) (n=10)
5 h
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16 h
5 h
Ionomycin+PMA
7.34±4.71
11.19±4.72
13.10±5.53
PHA+PMA
7.56±4.70
6.88±1.75
14.00±5.70
Ca2+ionophore+PMA
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5.94±2.84
14.20±5.57
2.3 IFNγ阳性和IL-4阳性细胞比 其结果如表2所示。在活化5 h时，三种刺激条件下IFNγ阳性细胞和IL-4阳性细胞之比无显著差异。表2 不同活化条件下正常人PBMC中IFNγ/IL-4(Th1/Th2)比值 (
±s)Tab.2 The ratio between IFNγ and IL-4 secreting cells in activated PBMC from normal subjects with different stimulations (
±s) Stimulators, http://www.100md.com
IFNγ (5 h)/IL-4
Ionomycin+PMA
0.46±0.29
PHA+PMA
0.40±0.17
Ca2+ ionophore+PMA
0.59±0.32
3 讨论
人类PBMC活化后产生 IFNγ/IL-4的条件已有一些报道。Jung用1 μmol/L ionomycin 和1 ng/ml pmol/LA刺激正常 人PBMC在 6～8 h时 IFNγ分泌细胞阳性率最高，约为12%[3]，而Tang用 50 ng/ml pmol/LA和 2 μmol/L Ca2+离子载体刺激正常人 PBMC，在6 h时 INFγ约为12%[4]，我们曾用 PHA 3 μmol/L和 PMA 1 ng/ml 刺激正常人PBMC，在16 h时IFNγ分泌细胞阳性率为6%[2]。由于大部分报道证明IFNγ阳性分泌细胞出现的高峰为6 h和16 h左右，考虑到实验时间安排的方便，我们选择了5 h和16 h 2个时相，首次采用灵敏的生物素-链霉卵白素检测系统，比较了用 ionomycin和PMA联合刺激、PHA和PMA联合刺激、Ca2+离子载体和PMA联合刺激三种方法对IFNγ分泌细胞阳性率的影响，结果在5 h时三种方法之间没有显著差异,以Ca2+离子载体联合PMA刺激所得的值稍高(约为8.9%)。16 h时则以ionomycin和PMA联合刺激法所得IFNγ阳性分泌细胞最高(约为11%)，明显高于其它二种方法 (分别约为7%和6%) (P<0.01,P<0.001)，但仍略低于国外报道值。据国外报道，IL-4阳性分泌细胞无论何种刺激剂，都仅 在刺激后2～8 h出现，且阳性率仅为1%～2%[3,6]。我们也曾用APAAP法，以PHA 3 μmol/L和 PMA 1 ng/ml联合刺激，检测了11例正常人的IL-4阳性分泌细胞，结果为1%，与国外报道一致[2]。本文改用生物素-链霉卵白素检测系统在三种刺激条件下IL-4阳性细胞百分率，结果明 显提高至13%～14%，明显高于国外报道值，提示IL-4原先可能因为分泌量少、抗原信号较弱等 因素不易检出其阳性分泌细胞。采用更灵敏的放大系统后可以较容易地检出，且生物素-链霉卵白素检测系统不仅提高了阳性率，而且使阳性和阴性细胞更易区分。
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作者简介：叶丽娅，女，42岁，主管技师，主要从事临床免疫学工作；
王前奔，男，25岁，实习研究员，从事临床免疫学工作；
赵武述，男，58岁，研究员，博士生导师，主要从事免疫调节研究
4 参考文献
1 Romagnani S. TH1 and TH2 in human diseases.Clin Immuno Immunopathology,1996;80:225
2 王前奔，叶丽娅，赵武述.人外周血CD4 T细胞和PBMC中Th1和Th2细胞免疫组化检测的初步研究.中国免疫学杂志，1997；13(增)：5
3 Jung T,Schauer U, Heusser C et al. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry.J Immunol Method,1993;159:197
, http://www.100md.com
4 Tang M,Kemp A.Production and secretion of interferon-gamma(IFNγ) in children with atopic dermatitis.Clin Exp Immunol,1994;95:66
5 Kabilan L,Andersson G,Lolli F et al.Detection of intracellular expression and secretion of interferon-γ at the single-cell level after activation of human T cells with tetanus toxoid in vitro.Eur J Immunol,1990;20:1085
6 Andersson U,Andersson J,Lindfors A et al. Simultaneous production of interleukin 2,interleukin 4 and interferon-γ by activated human blood lymphocytes. Eur J Immunol,1990;20:1591
〔收稿1996-06-09 修回1997-10-27〕, 百拇医药