卵巢癌标志物CA125酶联免疫吸附分析法的建立
作者：黄文林 王 雯 王晓静 崔素珍 马京民 王玉肖
单位：中国原子能科学研究院同位素研究所，北京102413
关键词：CA125；酶联免疫分析法；卵巢癌
中国免疫学杂志/990612 摘 要 目的：建立一种血清CA125的临床检测方法。方法：一株CA125单抗用于固相包被，另一株与辣根过氧化物酶偶联制备CA125的酶标记物，以四甲基联苯胺(TMB)为底物，采用一步法，建立了CA125的酶联免疫吸附分析法(ELISA)。结果：灵敏度为2.00 U/ml。批内CV值低于5.32% (n=22)，批间CV值低于7.39% (n=26)。测得回收率均值为100.9%，60例正常人血清的均值为9.20 U/ml，应用本法与IRMA方法同时测定33例病人血样，两者相关方程为Y=0.825X-10.39,相关系数r=0.960 0。结论： 该方法具有简便、快速和准确的特点，未见“HOOK”效应的影响，适于临床检测和科研应用。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R446.61
Measurement of CA125 in serum by an enzyme-linked immunosorbent assay
HUANG Wen-Lin , WANG Wen, WANG Xiao-Jing et al.
Department of Isotope, China Institute of Atomic Energy,Beijing102413
Abstract Objective:To develop a clinical method to measure ovarian cancer marker CA125 in serum. Methods：The one-step assay is based on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). One monoclonal antibody is employed for coating, another for labeling with horseradish peroxidase. Results：The minimum detectable dose is 2.00 U/ml and analytical recovery of CA125 is 91.1% to 107.4%. The between-runs CVs and the within-runs CVs of 3 samples are lower than 7.39% and 5.32% respectively. The average concentration of CA125 in sera from 60 healthy women is 9.20 U/ml. The correlation of results with CA125 IRMA is 0.960 0. Conclusion：The assay is a rapid, sensitive and precise method and simple to perform. It is suitable for clinical and research application.
, 百拇医药
Key words CA125 ELISA Ovarian cancer
卵巢癌是恶性度极高的妇科癌症。大多数卵巢癌均发现于晚期，其生存率较低。卵巢癌在早期被检测出来能大大降低死亡率，延长患者的生存时间，所以早期的诊断意义重大[1]。卵巢癌早期诊断的一种有效的方法是测定能灵敏反映卵巢癌病变的肿瘤相关抗原。CA125是与上皮型卵巢癌相伴随的表面抗原，它用于诊断卵巢癌的灵敏度为100%，疾病复发检测的灵敏度为81%[2]。CA125的酶联免疫分析的建立对卵巢癌早期诊断及卵巢癌患者的临床监测有着十分重要的意义。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器 辣根过氧化物酶、四甲基联苯胺、尿素过氧化物、Tween-20系Sigma公司的产品,酶标板为Nunc公司(丹麦)产品,CA125抗原、包被用和标记用CA125单克隆抗体(与AFP、CEA、PAP、PSA、CA199及CA153无交叉反应)均购于美国WHPM公司, CA125的IRMA商品药盒为日本Centocor公司生产,酶标仪及洗板机为奥地利SLT公司的产品。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 酶标记物的制备 采用高碘酸钠氧化法制备CA125的酶标记物[3], 经0.01 mol/L pH 7.4磷酸缓冲液透析过夜后,加入等量的甘油保存于-20℃备用。有效期可达一年。经稀释实验,最佳酶标记物工作浓度为1:2 000。
1.2.2 CA125单抗的包被 将200 μl含CA125包被单抗的pH 9.6碳酸缓冲液(2 μg/ml)加至聚苯乙烯板上,4℃冰箱内放置过夜,然后加入含3%牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液中，于37℃封闭2.0 h后,酶标板可用于免疫反应。
1.2.3 标准的配制 将CA125抗原溶于经灭活的新生小牛血清中,配制成含10.00、30.00、80.00、200.00、540.00 U/ml的标准。用日本Centocor公司的CA125 IRMA 药盒校正标准值。
, 百拇医药
1.2.4 底物溶液和中止剂 将四甲基联苯胺100 mg、尿素过氧化氢13 mg溶于1 000 ml pH 5.0磷酸-柠檬酸缓冲液中，即为底物溶液,中止剂为2 mol/L H2SO4。
1.2.5 酶联免疫吸附分析法(ELISA) 采用一步法加样程序。 50 μl待测样品或标准和150 μl酶标记物加入包被CA125的酶标板中, 37℃温育3.5 h,弃反应液,用0.01 mol/L pH 7.4磷酸缓冲液(含0.05%Tween-20)洗板4次, 加入200 μl底物溶液, 避光显色30 min,再加入50 μl的2 mol/L H2SO4中止显色, 于450 nm测定其吸光度OD值。绘制标准曲线，计算待测血样CA125的含量。
2 结果
2.1 方法学的建立
, 百拇医药
2.1.1 标准曲线及灵敏度 图1为典型的CA125酶联免疫吸附分析曲线。 同时测定20个零标准，求其OD 450均值加上2倍标准差(
+2s)，计算出本方法的灵敏度为2.00 U/ml。
图1 CA125酶免标准曲线
Fig.1 Standard curve of CA125
2.1.2 精密度 测定3个含有不同浓度的CA125人血清，观察批间、批内变异。结果见表1。
表1 批内与批间变异
Tab.1 Within-run and between-run
, 百拇医药
Within-run (n=22)
Between-run (n=26)
A
B
C
A
B
C
Average(U/ml)
27.67
75.49
199.31
, 百拇医药 25.22
80.40
186.95
SD(U/ml)
1.39
4.02
9.02
1.86
3.46
13.18
CV(%)
5.04
5.32
, http://www.100md.com
4.52
7.39
4.31
6.33
2.1.3 准确性 测定加入不同量的CA125标准品的样品，观察CA125的回收率，测得的回收率均值为100.9%(范围：91.1%～107.4%)。
2.1.4 稀释试验 取CA125含量较高的人血清，用小牛血清(零标准)进行倍比稀释。测定结果见表2。两样品的稀释倍数与测定值间的相关系数均大于0.990 0。表2 稀释试验
Tab.2 Samples dilution
1
1/2
, 百拇医药
1/4
1/8
1/16
r
Sample 1 (U/ml)
281.30
138.30
71.10
32.60
15.80
0.999 9
Sample 2 (U/ml)
, http://www.100md.com
82.10
45.70
24.60
10.20
4.00
0.996 5
2.1.5 动力学实验 采用一步法，反应体系在37℃分别温育1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，结果见图2，温育3.5 h免疫反应达到平衡，即为本方法的免疫反应时间。
图2 反应动力学
Fig.2 Reaction kinetics
, 百拇医药
2.2 正常参考值范围的确定 用本法测定了60例健康女性血样，CA125正常范围低于30.00 U/ml，均值为9.20 U/ml，与文献报道(<35.00 U/ml)一致[4]。
2.3 与国外厂商CA125 IRMA药盒的比较 我们就33例病人血样与Centocor公司的IRMA法进行了相关性比较。结果见图3，两者的相关方程为Y=0.825X-10.39，相关系数r=0.960 0。
图3 与IRMA法的相关性
Fig.3 Correlation with CA125 IRMA
3 讨论
为了观察CA125 ELISA一步法是否会产生“HOOK”效应，曾配制一系列高浓度CA125样品进行测定，结果见图4。实验表明：当CA125的浓度高至28 800.00 U/ml时，OD值没有随浓度的升高而降低。只是当其浓度高至4 000.00 U/ml时，出现测定值的平台区。由于少见CA125血清值高于4 000.00 U/ml的病例报道，故一步法的测定结果不会影响临床诊断的可靠性。
, 百拇医药
图4 HOOK效应的影响
Fig.4 Effect of HOOK
利用125I标记的CA125单抗示踪实验表明，在2 μg/ml的单抗浓度包被时，聚苯乙烯固相板表面能吸附30%的CA125单抗，补充被吸附的单抗后，包被溶液可重复利用。单克隆抗体包被量的放射性示踪实验，不仅能使我们了解到固相材料对蛋白的吸附能力，同时也使我们在实验的基础上去充分利用宝贵的单克隆抗体资源，尤其是那些规模较大的商品化生产。
在放射免疫分析中，NaN3作为一种最常用且有效的防腐剂，广泛地应用于标记物、抗体和标准的防腐。但在酶免分析中，它却抑制辣根过氧化物酶的活性而无法用于酶免药盒。在实验中我们发现了另外一种有机试剂Proclin 300取代NaN3能有效地用于酶免药盒的防腐而不干扰酶的活性。
作者简介：黄文林，男，29岁，工程师，主要研制免疫分析试剂盒；
, 百拇医药
王玉肖，女，61岁，研究员，硕士生导师
4 参考文献
1 Averette H E. Ovarian carcinoma：advances in diagnosis staging and treatment. Cancer,1990;65:703.
2 Rodrigues M,Ramos M G,Vieira M R. 放射免疫分析与相关技术进展.北京：原子能出版社，1996：184-186
3 郭春祥. 介绍一种简单，快速，高效的辣根过氧化物酶标记抗体的过碘酸钠法. 上海免疫学杂志，1993; 3(2)：97
4 Cruickshank D J.CA125-response assessment in epithelial ovarian cancer.Int J Cancer,1992;51:58
〔收稿1998-08-20 修回1998-11-11〕, 百拇医药
单位：中国原子能科学研究院同位素研究所，北京102413
关键词：CA125；酶联免疫分析法；卵巢癌
中国免疫学杂志/990612 摘 要 目的：建立一种血清CA125的临床检测方法。方法：一株CA125单抗用于固相包被，另一株与辣根过氧化物酶偶联制备CA125的酶标记物，以四甲基联苯胺(TMB)为底物，采用一步法，建立了CA125的酶联免疫吸附分析法(ELISA)。结果：灵敏度为2.00 U/ml。批内CV值低于5.32% (n=22)，批间CV值低于7.39% (n=26)。测得回收率均值为100.9%，60例正常人血清的均值为9.20 U/ml，应用本法与IRMA方法同时测定33例病人血样，两者相关方程为Y=0.825X-10.39,相关系数r=0.960 0。结论： 该方法具有简便、快速和准确的特点，未见“HOOK”效应的影响，适于临床检测和科研应用。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R446.61
Measurement of CA125 in serum by an enzyme-linked immunosorbent assay
HUANG Wen-Lin , WANG Wen, WANG Xiao-Jing et al.
Department of Isotope, China Institute of Atomic Energy,Beijing102413
Abstract Objective:To develop a clinical method to measure ovarian cancer marker CA125 in serum. Methods：The one-step assay is based on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). One monoclonal antibody is employed for coating, another for labeling with horseradish peroxidase. Results：The minimum detectable dose is 2.00 U/ml and analytical recovery of CA125 is 91.1% to 107.4%. The between-runs CVs and the within-runs CVs of 3 samples are lower than 7.39% and 5.32% respectively. The average concentration of CA125 in sera from 60 healthy women is 9.20 U/ml. The correlation of results with CA125 IRMA is 0.960 0. Conclusion：The assay is a rapid, sensitive and precise method and simple to perform. It is suitable for clinical and research application.
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Key words CA125 ELISA Ovarian cancer
卵巢癌是恶性度极高的妇科癌症。大多数卵巢癌均发现于晚期，其生存率较低。卵巢癌在早期被检测出来能大大降低死亡率，延长患者的生存时间，所以早期的诊断意义重大[1]。卵巢癌早期诊断的一种有效的方法是测定能灵敏反映卵巢癌病变的肿瘤相关抗原。CA125是与上皮型卵巢癌相伴随的表面抗原，它用于诊断卵巢癌的灵敏度为100%，疾病复发检测的灵敏度为81%[2]。CA125的酶联免疫分析的建立对卵巢癌早期诊断及卵巢癌患者的临床监测有着十分重要的意义。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器 辣根过氧化物酶、四甲基联苯胺、尿素过氧化物、Tween-20系Sigma公司的产品,酶标板为Nunc公司(丹麦)产品,CA125抗原、包被用和标记用CA125单克隆抗体(与AFP、CEA、PAP、PSA、CA199及CA153无交叉反应)均购于美国WHPM公司, CA125的IRMA商品药盒为日本Centocor公司生产,酶标仪及洗板机为奥地利SLT公司的产品。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 酶标记物的制备 采用高碘酸钠氧化法制备CA125的酶标记物[3], 经0.01 mol/L pH 7.4磷酸缓冲液透析过夜后,加入等量的甘油保存于-20℃备用。有效期可达一年。经稀释实验,最佳酶标记物工作浓度为1:2 000。
1.2.2 CA125单抗的包被 将200 μl含CA125包被单抗的pH 9.6碳酸缓冲液(2 μg/ml)加至聚苯乙烯板上,4℃冰箱内放置过夜,然后加入含3%牛血清蛋白的磷酸盐缓冲液中，于37℃封闭2.0 h后,酶标板可用于免疫反应。
1.2.3 标准的配制 将CA125抗原溶于经灭活的新生小牛血清中,配制成含10.00、30.00、80.00、200.00、540.00 U/ml的标准。用日本Centocor公司的CA125 IRMA 药盒校正标准值。
, 百拇医药
1.2.4 底物溶液和中止剂 将四甲基联苯胺100 mg、尿素过氧化氢13 mg溶于1 000 ml pH 5.0磷酸-柠檬酸缓冲液中，即为底物溶液,中止剂为2 mol/L H2SO4。
1.2.5 酶联免疫吸附分析法(ELISA) 采用一步法加样程序。 50 μl待测样品或标准和150 μl酶标记物加入包被CA125的酶标板中, 37℃温育3.5 h,弃反应液,用0.01 mol/L pH 7.4磷酸缓冲液(含0.05%Tween-20)洗板4次, 加入200 μl底物溶液, 避光显色30 min,再加入50 μl的2 mol/L H2SO4中止显色, 于450 nm测定其吸光度OD值。绘制标准曲线，计算待测血样CA125的含量。
2 结果
2.1 方法学的建立
, 百拇医药
2.1.1 标准曲线及灵敏度 图1为典型的CA125酶联免疫吸附分析曲线。 同时测定20个零标准，求其OD 450均值加上2倍标准差(
+2s)，计算出本方法的灵敏度为2.00 U/ml。图1 CA125酶免标准曲线
Fig.1 Standard curve of CA125
2.1.2 精密度 测定3个含有不同浓度的CA125人血清，观察批间、批内变异。结果见表1。
表1 批内与批间变异
Tab.1 Within-run and between-run
, 百拇医药
Within-run (n=22)
Between-run (n=26)
A
B
C
A
B
C
Average(U/ml)
27.67
75.49
199.31
, 百拇医药 25.22
80.40
186.95
SD(U/ml)
1.39
4.02
9.02
1.86
3.46
13.18
CV(%)
5.04
5.32
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4.52
7.39
4.31
6.33
2.1.3 准确性 测定加入不同量的CA125标准品的样品，观察CA125的回收率，测得的回收率均值为100.9%(范围：91.1%～107.4%)。
2.1.4 稀释试验 取CA125含量较高的人血清，用小牛血清(零标准)进行倍比稀释。测定结果见表2。两样品的稀释倍数与测定值间的相关系数均大于0.990 0。表2 稀释试验
Tab.2 Samples dilution
1
1/2
, 百拇医药
1/4
1/8
1/16
r
Sample 1 (U/ml)
281.30
138.30
71.10
32.60
15.80
0.999 9
Sample 2 (U/ml)
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82.10
45.70
24.60
10.20
4.00
0.996 5
2.1.5 动力学实验 采用一步法，反应体系在37℃分别温育1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h，结果见图2，温育3.5 h免疫反应达到平衡，即为本方法的免疫反应时间。
图2 反应动力学
Fig.2 Reaction kinetics
, 百拇医药
2.2 正常参考值范围的确定 用本法测定了60例健康女性血样，CA125正常范围低于30.00 U/ml，均值为9.20 U/ml，与文献报道(<35.00 U/ml)一致[4]。
2.3 与国外厂商CA125 IRMA药盒的比较 我们就33例病人血样与Centocor公司的IRMA法进行了相关性比较。结果见图3，两者的相关方程为Y=0.825X-10.39，相关系数r=0.960 0。
图3 与IRMA法的相关性
Fig.3 Correlation with CA125 IRMA
3 讨论
为了观察CA125 ELISA一步法是否会产生“HOOK”效应，曾配制一系列高浓度CA125样品进行测定，结果见图4。实验表明：当CA125的浓度高至28 800.00 U/ml时，OD值没有随浓度的升高而降低。只是当其浓度高至4 000.00 U/ml时，出现测定值的平台区。由于少见CA125血清值高于4 000.00 U/ml的病例报道，故一步法的测定结果不会影响临床诊断的可靠性。
, 百拇医药
图4 HOOK效应的影响
Fig.4 Effect of HOOK
利用125I标记的CA125单抗示踪实验表明，在2 μg/ml的单抗浓度包被时，聚苯乙烯固相板表面能吸附30%的CA125单抗，补充被吸附的单抗后，包被溶液可重复利用。单克隆抗体包被量的放射性示踪实验，不仅能使我们了解到固相材料对蛋白的吸附能力，同时也使我们在实验的基础上去充分利用宝贵的单克隆抗体资源，尤其是那些规模较大的商品化生产。
在放射免疫分析中，NaN3作为一种最常用且有效的防腐剂，广泛地应用于标记物、抗体和标准的防腐。但在酶免分析中，它却抑制辣根过氧化物酶的活性而无法用于酶免药盒。在实验中我们发现了另外一种有机试剂Proclin 300取代NaN3能有效地用于酶免药盒的防腐而不干扰酶的活性。
作者简介：黄文林，男，29岁，工程师，主要研制免疫分析试剂盒；
, 百拇医药
王玉肖，女，61岁，研究员，硕士生导师
4 参考文献
1 Averette H E. Ovarian carcinoma：advances in diagnosis staging and treatment. Cancer,1990;65:703.
2 Rodrigues M,Ramos M G,Vieira M R. 放射免疫分析与相关技术进展.北京：原子能出版社，1996：184-186
3 郭春祥. 介绍一种简单，快速，高效的辣根过氧化物酶标记抗体的过碘酸钠法. 上海免疫学杂志，1993; 3(2)：97
4 Cruickshank D J.CA125-response assessment in epithelial ovarian cancer.Int J Cancer,1992;51:58
〔收稿1998-08-20 修回1998-11-11〕, 百拇医药