小鼠胸腺树突状细胞系的克隆化及基本鉴定
作者：①裴丽红 刘祝公 陈慰峰
单位：北京医科大学免疫学系，北京100083
关键词：胸腺；树突状细胞；细胞克隆；细胞因子
中国免疫学杂志/990605 摘 要 目的：应用单细胞培养系统，对本室建成的胸腺基质细胞系MTSC4进行细胞克隆化并鉴定。方法：在单个细胞培养中，扩增由一个细胞长成的克隆，并使之稳定生长后，进行表面标志分子和倍增时间检查，并以其分泌的细胞因子测定其生物学特性及功能。结果：获得14个细胞克隆，它们均表达树突状细胞抗原和MHC-Ⅱ类分子，均无角蛋白，表明各克隆均为树突状细胞，起始的MTSC4也是树突状细胞系。检测了细胞倍增时间和IL-6、趋化因子等细胞因子，从倍增时间和因子产生能力看，各克隆差异很大。结论：从MTSC4细胞系克隆出性状及功能都均一的细胞克隆来看，各克隆间的细胞特性有明显区别。
中国图书分类号 R392.11
, http://www.100md.com
Manipulation of mouse thymic dendritic cell clones and their characteristics
PEI Li-Hong, LIU Zhu-Gong， CHEN Wei-Feng.
Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083
Abstract Objective:An attempt to develop stable mouse thymic dendritic cell clones with homogeneous characteristics was investigated by adaptation of single cell culture system.Methods:A single cell obtained from the dilution of the established mouse thymic dendritic cell line(MTSC4) was cultured in the well of V-bottomed microtiter plates until the cell cluster was grown up. The grown cell cluster was expanded as single cell clone with stable proliferation capacity.The cloned cells were characterized for their biologic properties and the profile of cytokine production.Results:A total of 14 MTSC4 clones with stable proliferation have been developed.All the cloned cells expressed MHC class II molecules and most were NLDC145+.None of the cloned cells were keratin negative.The double time and IL-6 as well as chemokine production varies among different clones.Conclusion:The mouse thymic dendritic cell clones derived from respective(MTSC4) cell line have successfully been established.The biologic characteristics and cytokine production capacity were varied among different cell clones.
, 百拇医药
Key words Thymus Dendritic cell Cell clone Cytokine
T细胞在胸腺内通过与微环境的相互作用成熟分化。由上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞及树突状细胞(Dendritic cell, DC)等基质细胞和其分泌的因子及其产生的细胞外基质构成的胸腺微环境，诱导并调节胸腺细胞的增殖与分化[1]。不同发育阶段的T细胞位于胸腺内不同部位，而不同部位胸腺微环境基质细胞的来源、结构和功能也各不相同。因此，对胸腺基质细胞的类型、分布、功能及与T细胞相互作用的效应的研究，是了解T细胞发育过程和机理所必须的。体外建立胸腺基质细胞系并进行功能分析成为研究胸腺微环境作用的重要手段之一。我室由常规方法建立了14株小鼠胸腺基质细胞系[2]，细胞系的建立起源于多细胞培养，在成系过程中(一般须一年)虽有优势生长选择，而使成系的细胞群相当均一，但难免混有不同类型细胞，或同一类型细胞出现突变，可能显示不同特点。为精确了解单一亚群树突状细胞对T细胞发育的作用，我们克隆得到了多个胸腺树突状细胞株并进行了鉴定。
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1 材料与方法
1.1 培养基及试剂 DMEM(GIBCO)+10%NCS, 0.05%胰蛋白酶(DIFCO)+0.02%EDTA(北京化工厂), PBS等。
1.2 抗体 大鼠抗小鼠角蛋白抗体， FITC标记的羊抗大鼠IgG(购自Sigma公司)，大鼠抗小鼠树突状细胞抗体N418、抗MHC Class I及Class II抗体(由本室杂交瘤细胞分泌)。
1.3 小鼠胸腺基质细胞系MTSC4的建立 取4周龄正常Balb/c小鼠的胸腺，剪成糊状，贴壁细胞体外长期培养，建成小鼠胸腺基质细胞系，命名为MTSC4。
1.4 小鼠胸腺基质细胞系MTSC4的克隆化 对数生长期的MTSC4消化后，稀释成80个细胞/10 ml，以每孔100 μl加入96孔板中，37℃静置2 h后, 镜下观察并标记含单个细胞的孔。经3 w后，部分单个细胞已增殖为细胞岛，消化后扩增并冻存。各克隆细胞以2.5×104ml-1培养6 d，收集上清，-20℃冻存。
, 百拇医药
1.5 细胞表面标记的分析 将长有克隆细胞的盖片经冷丙酮固定后，分别滴加抗keratin、NLDC145 抗DC mAb、抗MHC Class I及抗MHC Class II等抗体，4℃过夜结合，PBS冲洗后，滴加FITC标记的羊抗大鼠IgG，37℃孵育30 min，充分清洗，荧光显微镜检查。
1.6 克隆细胞的倍增时间 将克隆细胞以5 000个细胞/孔加入24孔板，37℃培养，逐日用胰酶联合EDTA消化3孔细胞，显微镜下计数每孔平均细胞数，连续计数 8 d。
1.7 细胞因子检测 IL-6：96孔板每孔加入经不同比例稀释的rIL-6标准品及各克隆上清、DMEM(阴性对照)。IL-6依赖株7TD1经含2%NCS的PBS洗2遍后，37℃孵育30 min，配成5×104ml-1，每孔100 μl加在96孔板各孔中，37℃孵育68 h后，离心弃上清，加入1 mg/ml的MTT液50 μl/孔，37℃孵育4 h后，离心弃上清，加盐酸异丙醇120 μl/孔，ELISA-READER用双波长法(570 nm及630 nm)测OD值[3，4]。化学趋化因子：采用Boyden小室法[5]，下室加入各克隆上清及阳性对照肽(FMLP)或阴性对照液(DMEM)，上室加入小鼠末梢血粒细胞悬液，中间隔以3 μm孔径的polycarbonate膜，37℃孵育，2 h后将膜取出，刮去膜上表面的细胞，经固定、染色后，高倍镜下计数膜下表面的粒细胞数，计算趋化指数(Chemotactic Index,CI)。
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2 结果
2.1 MTSC4的克隆化细胞的获得 用有限稀释法克隆化MTSC4细胞，共获得14个细胞克隆，分别命名为MTSC4-1至MTSC4-14，克隆效率约为40%。这些克隆经半年的克隆化培养已能稳定生长，至今已连续培养1.5年。
2.2 MTSC4各克隆细胞表面标记的分析 结果见表1。在14个克隆中，各克隆均表达树突状细胞抗原而不表达角蛋白，表明为树突状细胞(DC)来源。各克隆均表达MHC Class II抗原而不表达MHC Class I抗原，也符合DC特点。但各克隆表达的DC抗原及MHC Class II 抗原强度有明显差异。
表1 MTSC4细胞克隆的表面分子测定
Tab.1 Detection of surface molecules of MTSC4 clones Cell clones
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Keratin
DC
MHC I
MHC II
4(1)
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ND
ND
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Note:ND:not detect；-: there was no any fluorescent lights emitting;+:there were fluorescent lights emitting definitely in a low and not dazzling level;++:there were fluorescent lights emitting definitely in a moderate and dazzling level;+++:there were fluorescent lights emitting definitely in a strong and very dazzling level
, 百拇医药
2.3 各克隆倍增时间测定 各克隆2～5 d内大致呈对数生长，培养至第7、8天时，细胞数目几乎不再增加。镜下观察无细胞重叠，表现为接触性抑制，其倍增时间在16～36 h之间，平均约(24.6±7.3) h，见表2。
表2 MTSC4细胞克隆的倍数时间及细胞因子产生
Tab.2 Doubling time and cytokine production of MTSC4 clones Cell clones
Doubling time
(h)
IL-6 activity
(U/ml)
Chemotactic activity
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(CI)
4(1)
36
86
10.00
4(2)
25
104
7.75
4(3)
38
156
13.10
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4(4)
20
386
3.88
4(5)
17
300
13.60
4(6)
26
271
2.70
4(7)
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22
278
5.75
4(8)
19
13
1.58
4(9)
19
128
7.25
4(10)
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178
<1.00
4(11)
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9.18
4(12)
16
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4(13)
29
181
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34
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2.4 细胞因子测定 IL-6活性：大部分克隆上清可支持IL-6依赖株7TD1的增殖，且增殖程度与上清的稀释度呈剂量依赖关系。以不同稀释度的rIL-6作出标准曲线作为对照，运用Probit分析法计算IL-6活性，结果见表2。各克隆均能分泌IL-6，但活性水平差异很大，介于13～386 U/ml之间。化学趋化因子活性：以DMEM+10%NCS为阴性对照，以FMLP为阳性对照，采用3 μm孔径的polycarbonate膜，测定各克隆上清的趋化活性,结果见表2。各克隆分泌趋化因子能力差异更大，从测不出至CI为13.6。
3 讨论
, 百拇医药
1980年，Nussenzweig等首先在小鼠胸腺培养的细胞中观察到树突状细胞[6]，此后Pelletier等对体外条件下的人胸腺DC进行了研究[7]。本室通过胸腺贴壁细胞的体外长期培养，建成了一株树突状细胞系，命名为MTSC4，至今已4年。
考虑到MTSC4中可能混杂有其他类型细胞，在体外试验中，可能不能精确反映其与胸腺细胞相互作用的功能,因此，我们用有限稀释法将其克隆化，共得到14个克隆。在克隆化过程中不需外源性因子的支持，从而为以后获得单克隆基质细胞的技术提供了实验依据。
对14个克隆进行表面分子的测定，发现各克隆的分子表达有所不同。角蛋白是公认的上皮细胞的标志，各克隆均为角蛋白阴性，证实其为非上皮细胞来源。抗DC单抗的鉴定结果进一步证实了各克隆均为树突状细胞。一些克隆有MHC II类抗原的高表达(如4-1、4-7、4-10、4-14)，这与DC表面有Ia的密集分布相吻合，但有些克隆表达较低。MHC I类分子表达于所有核细胞表面，而各克隆MHC I类分子阴性可能与细胞长期体外培养下某些分子表达下调甚至停止表达有关。
, 百拇医药
观察14个克隆的生长状态，表明细胞存在接触性抑制现象。各克隆的倍增时间长短不一。最短为16 h，最长达36 h，提示克隆间存在着异质性，我室已建立多种细胞因子(如IL-1，2，3，4，6，7，GM-CSF，趋化因子等)的生物学检测方法。本室曾经对MTSC4进行了一系列鉴定，发现其能分泌多种细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-7、CSF、IFN及趋化因子。已发现IL-6 能影响胸腺细胞的增殖和分化，而趋化因子可能在Pro-T 从骨髓向胸腺迁移以及胸腺细胞在胸腺内定向发育中起作用，故我们选择性地检测了各克隆的IL-6和趋化因子活性。对于IL-6及趋化因子分泌活性的研究显示，各克隆间细胞因子的分泌存在着较大差异，但各克隆均可分泌IL-6，有的克隆(如4-4、4-5)IL-6 水平较高，而趋化因子有的克隆分泌较高(如4-3和4-5)，有的(如4-10、4-12～4-14)则几乎无趋化活性。因此所得的14个克隆成为研究细胞自分泌因子网络调节的很好系统，不同克隆分泌趋化因子能力不同，可用PCR方法显示其差异，以克隆新型趋化因子。
, 百拇医药 从所获14个克隆特性分析，证明本室所建小鼠胸腺树突状细胞系(MTSC4)为匀质的DC细胞群，不混杂有其他类型细胞，但各克隆间的特性有明显差异，是来源于不同DC亚群，或体外长期培养导致细胞突变所致，目前尚不能定论。
①本研究受ICGEB基金资助
作者简介：裴丽红，女，27岁，硕士；
刘祝公，男，28岁，博士；
指导教师，陈慰峰，男，61岁，教授，博士生导师，主要研究T细胞发育等
4 参考文献
1 Sprent J, Lo D, Gao E K et al. T cell selection in the thymus. Immunol Rev, 1988;101:173
, 百拇医药
2 舒石庄,陈慰峰,刘祝公 et al. 八株小鼠胸腺基质细胞系的建立和鉴定.北京医科大学学报,1993; 25(4):237
3 刘祝公,陈慰蜂,曹良弦 et al. 小鼠胸腺树突状细胞自发分泌多种细胞因子.实验生物新报,1994; 27(1):92
4 Chen W F, Fan W, Cao L X et al. Multiple types of cytokines constitutively produced by an eastablished murine thymic epithelial cell line. Eur Cytokine Netw, 1992; 3:43
5 Boyden S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med, 1962; 115:453
, 百拇医药
6 Nussenzweig M C, Steinman R M, Gutchinov B et al. Dendritic cells are accessory cells for the development of anti-trinitropheny cytotoxic T lymphocytes. J Exp Med， 1980;152:1070
7 Pelletier M O, Tautu C, Landry D et al. Characterization of human thymic dendritic cells in culture. Immunology,1986;58:263
〔收稿1997-07-10 修回1998-03-23〕, http://www.100md.com
单位：北京医科大学免疫学系，北京100083
关键词：胸腺；树突状细胞；细胞克隆；细胞因子
中国免疫学杂志/990605 摘 要 目的：应用单细胞培养系统，对本室建成的胸腺基质细胞系MTSC4进行细胞克隆化并鉴定。方法：在单个细胞培养中，扩增由一个细胞长成的克隆，并使之稳定生长后，进行表面标志分子和倍增时间检查，并以其分泌的细胞因子测定其生物学特性及功能。结果：获得14个细胞克隆，它们均表达树突状细胞抗原和MHC-Ⅱ类分子，均无角蛋白，表明各克隆均为树突状细胞，起始的MTSC4也是树突状细胞系。检测了细胞倍增时间和IL-6、趋化因子等细胞因子，从倍增时间和因子产生能力看，各克隆差异很大。结论：从MTSC4细胞系克隆出性状及功能都均一的细胞克隆来看，各克隆间的细胞特性有明显区别。
中国图书分类号 R392.11
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Manipulation of mouse thymic dendritic cell clones and their characteristics
PEI Li-Hong, LIU Zhu-Gong， CHEN Wei-Feng.
Department of Immunology, Beijing Medical University, Beijing 100083
Abstract Objective:An attempt to develop stable mouse thymic dendritic cell clones with homogeneous characteristics was investigated by adaptation of single cell culture system.Methods:A single cell obtained from the dilution of the established mouse thymic dendritic cell line(MTSC4) was cultured in the well of V-bottomed microtiter plates until the cell cluster was grown up. The grown cell cluster was expanded as single cell clone with stable proliferation capacity.The cloned cells were characterized for their biologic properties and the profile of cytokine production.Results:A total of 14 MTSC4 clones with stable proliferation have been developed.All the cloned cells expressed MHC class II molecules and most were NLDC145+.None of the cloned cells were keratin negative.The double time and IL-6 as well as chemokine production varies among different clones.Conclusion:The mouse thymic dendritic cell clones derived from respective(MTSC4) cell line have successfully been established.The biologic characteristics and cytokine production capacity were varied among different cell clones.
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Key words Thymus Dendritic cell Cell clone Cytokine
T细胞在胸腺内通过与微环境的相互作用成熟分化。由上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞及树突状细胞(Dendritic cell, DC)等基质细胞和其分泌的因子及其产生的细胞外基质构成的胸腺微环境，诱导并调节胸腺细胞的增殖与分化[1]。不同发育阶段的T细胞位于胸腺内不同部位，而不同部位胸腺微环境基质细胞的来源、结构和功能也各不相同。因此，对胸腺基质细胞的类型、分布、功能及与T细胞相互作用的效应的研究，是了解T细胞发育过程和机理所必须的。体外建立胸腺基质细胞系并进行功能分析成为研究胸腺微环境作用的重要手段之一。我室由常规方法建立了14株小鼠胸腺基质细胞系[2]，细胞系的建立起源于多细胞培养，在成系过程中(一般须一年)虽有优势生长选择，而使成系的细胞群相当均一，但难免混有不同类型细胞，或同一类型细胞出现突变，可能显示不同特点。为精确了解单一亚群树突状细胞对T细胞发育的作用，我们克隆得到了多个胸腺树突状细胞株并进行了鉴定。
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1 材料与方法
1.1 培养基及试剂 DMEM(GIBCO)+10%NCS, 0.05%胰蛋白酶(DIFCO)+0.02%EDTA(北京化工厂), PBS等。
1.2 抗体 大鼠抗小鼠角蛋白抗体， FITC标记的羊抗大鼠IgG(购自Sigma公司)，大鼠抗小鼠树突状细胞抗体N418、抗MHC Class I及Class II抗体(由本室杂交瘤细胞分泌)。
1.3 小鼠胸腺基质细胞系MTSC4的建立 取4周龄正常Balb/c小鼠的胸腺，剪成糊状，贴壁细胞体外长期培养，建成小鼠胸腺基质细胞系，命名为MTSC4。
1.4 小鼠胸腺基质细胞系MTSC4的克隆化 对数生长期的MTSC4消化后，稀释成80个细胞/10 ml，以每孔100 μl加入96孔板中，37℃静置2 h后, 镜下观察并标记含单个细胞的孔。经3 w后，部分单个细胞已增殖为细胞岛，消化后扩增并冻存。各克隆细胞以2.5×104ml-1培养6 d，收集上清，-20℃冻存。
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1.5 细胞表面标记的分析 将长有克隆细胞的盖片经冷丙酮固定后，分别滴加抗keratin、NLDC145 抗DC mAb、抗MHC Class I及抗MHC Class II等抗体，4℃过夜结合，PBS冲洗后，滴加FITC标记的羊抗大鼠IgG，37℃孵育30 min，充分清洗，荧光显微镜检查。
1.6 克隆细胞的倍增时间 将克隆细胞以5 000个细胞/孔加入24孔板，37℃培养，逐日用胰酶联合EDTA消化3孔细胞，显微镜下计数每孔平均细胞数，连续计数 8 d。
1.7 细胞因子检测 IL-6：96孔板每孔加入经不同比例稀释的rIL-6标准品及各克隆上清、DMEM(阴性对照)。IL-6依赖株7TD1经含2%NCS的PBS洗2遍后，37℃孵育30 min，配成5×104ml-1，每孔100 μl加在96孔板各孔中，37℃孵育68 h后，离心弃上清，加入1 mg/ml的MTT液50 μl/孔，37℃孵育4 h后，离心弃上清，加盐酸异丙醇120 μl/孔，ELISA-READER用双波长法(570 nm及630 nm)测OD值[3，4]。化学趋化因子：采用Boyden小室法[5]，下室加入各克隆上清及阳性对照肽(FMLP)或阴性对照液(DMEM)，上室加入小鼠末梢血粒细胞悬液，中间隔以3 μm孔径的polycarbonate膜，37℃孵育，2 h后将膜取出，刮去膜上表面的细胞，经固定、染色后，高倍镜下计数膜下表面的粒细胞数，计算趋化指数(Chemotactic Index,CI)。
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2 结果
2.1 MTSC4的克隆化细胞的获得 用有限稀释法克隆化MTSC4细胞，共获得14个细胞克隆，分别命名为MTSC4-1至MTSC4-14，克隆效率约为40%。这些克隆经半年的克隆化培养已能稳定生长，至今已连续培养1.5年。
2.2 MTSC4各克隆细胞表面标记的分析 结果见表1。在14个克隆中，各克隆均表达树突状细胞抗原而不表达角蛋白，表明为树突状细胞(DC)来源。各克隆均表达MHC Class II抗原而不表达MHC Class I抗原，也符合DC特点。但各克隆表达的DC抗原及MHC Class II 抗原强度有明显差异。
表1 MTSC4细胞克隆的表面分子测定
Tab.1 Detection of surface molecules of MTSC4 clones Cell clones
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Keratin
DC
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2.3 各克隆倍增时间测定 各克隆2～5 d内大致呈对数生长，培养至第7、8天时，细胞数目几乎不再增加。镜下观察无细胞重叠，表现为接触性抑制，其倍增时间在16～36 h之间，平均约(24.6±7.3) h，见表2。
表2 MTSC4细胞克隆的倍数时间及细胞因子产生
Tab.2 Doubling time and cytokine production of MTSC4 clones Cell clones
Doubling time
(h)
IL-6 activity
(U/ml)
Chemotactic activity
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(CI)
4(1)
36
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2.4 细胞因子测定 IL-6活性：大部分克隆上清可支持IL-6依赖株7TD1的增殖，且增殖程度与上清的稀释度呈剂量依赖关系。以不同稀释度的rIL-6作出标准曲线作为对照，运用Probit分析法计算IL-6活性，结果见表2。各克隆均能分泌IL-6，但活性水平差异很大，介于13～386 U/ml之间。化学趋化因子活性：以DMEM+10%NCS为阴性对照，以FMLP为阳性对照，采用3 μm孔径的polycarbonate膜，测定各克隆上清的趋化活性,结果见表2。各克隆分泌趋化因子能力差异更大，从测不出至CI为13.6。
3 讨论
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1980年，Nussenzweig等首先在小鼠胸腺培养的细胞中观察到树突状细胞[6]，此后Pelletier等对体外条件下的人胸腺DC进行了研究[7]。本室通过胸腺贴壁细胞的体外长期培养，建成了一株树突状细胞系，命名为MTSC4，至今已4年。
考虑到MTSC4中可能混杂有其他类型细胞，在体外试验中，可能不能精确反映其与胸腺细胞相互作用的功能,因此，我们用有限稀释法将其克隆化，共得到14个克隆。在克隆化过程中不需外源性因子的支持，从而为以后获得单克隆基质细胞的技术提供了实验依据。
对14个克隆进行表面分子的测定，发现各克隆的分子表达有所不同。角蛋白是公认的上皮细胞的标志，各克隆均为角蛋白阴性，证实其为非上皮细胞来源。抗DC单抗的鉴定结果进一步证实了各克隆均为树突状细胞。一些克隆有MHC II类抗原的高表达(如4-1、4-7、4-10、4-14)，这与DC表面有Ia的密集分布相吻合，但有些克隆表达较低。MHC I类分子表达于所有核细胞表面，而各克隆MHC I类分子阴性可能与细胞长期体外培养下某些分子表达下调甚至停止表达有关。
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观察14个克隆的生长状态，表明细胞存在接触性抑制现象。各克隆的倍增时间长短不一。最短为16 h，最长达36 h，提示克隆间存在着异质性，我室已建立多种细胞因子(如IL-1，2，3，4，6，7，GM-CSF，趋化因子等)的生物学检测方法。本室曾经对MTSC4进行了一系列鉴定，发现其能分泌多种细胞因子，如IL-1、IL-6、IL-7、CSF、IFN及趋化因子。已发现IL-6 能影响胸腺细胞的增殖和分化，而趋化因子可能在Pro-T 从骨髓向胸腺迁移以及胸腺细胞在胸腺内定向发育中起作用，故我们选择性地检测了各克隆的IL-6和趋化因子活性。对于IL-6及趋化因子分泌活性的研究显示，各克隆间细胞因子的分泌存在着较大差异，但各克隆均可分泌IL-6，有的克隆(如4-4、4-5)IL-6 水平较高，而趋化因子有的克隆分泌较高(如4-3和4-5)，有的(如4-10、4-12～4-14)则几乎无趋化活性。因此所得的14个克隆成为研究细胞自分泌因子网络调节的很好系统，不同克隆分泌趋化因子能力不同，可用PCR方法显示其差异，以克隆新型趋化因子。
, 百拇医药 从所获14个克隆特性分析，证明本室所建小鼠胸腺树突状细胞系(MTSC4)为匀质的DC细胞群，不混杂有其他类型细胞，但各克隆间的特性有明显差异，是来源于不同DC亚群，或体外长期培养导致细胞突变所致，目前尚不能定论。
①本研究受ICGEB基金资助
作者简介：裴丽红，女，27岁，硕士；
刘祝公，男，28岁，博士；
指导教师，陈慰峰，男，61岁，教授，博士生导师，主要研究T细胞发育等
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〔收稿1997-07-10 修回1998-03-23〕, http://www.100md.com