ICAM-1在着床期小鼠PBLC及EC/DC中表达的研究①
作者：李 宾 周春喜 王黎明 王 妮 陈幼珍 曹泳清
单位：李 宾 周春喜 王黎明 解放军总医院，北京100853；王 妮 陈幼珍 曹泳清 中科院动物所生殖生物学国家重点实验室，北京100080
关键词：ICAM-1；PBLC；子宫内膜；蜕膜；着床
中国免疫学杂志990710 中国图书分类号 R392.1
摘 要 目的：研究细胞间粘附因子-1(ICAM-1)在着床期外周血淋巴细胞(PBLC)、子宫内膜及蜕膜细胞(EC/DC)中的不同表达特点及动态变化规律。方法：以着床期小鼠为动物模型，细胞分析采用单抗免疫荧光标记及多参数流式细胞术分析技术。结果：发现ICAM-1在PBLC、EC/DC中的表达均存在明显的动态变化；其中ICAM-1的表达在PBLC中于妊娠第2天(D2)达最低水平，而在EC/DC中于妊娠第4天(D4)降至最低。结论：ICAM-1在PBLC及EC/DC中的动态表达具有不同的调控机制，这种动态变化参与了着床过程中局部免疫耐受的形成及调控。
, 百拇医药
Study on dynamic changes of ICAM-1 in mouse PBLC and EC/DC at peri-implantation stage
LI Bin,ZHOU Chun-Xi, WANG Li-Ming et al.
Flow Cytometry Lab, General Hospital of PLA, Beijing 100853
Abstract Objctive:The study was to investigate the expressions and dynamic changes of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) in peripheral blood lymphocytes(PBLC),endometrial and decidual cells(EC/DC) at peri-implantation stage. Methods:Cells were stained by direct immunofluorescence staining with FITC-conjugated antimouse ICAM-1 McAb and studied by multi-parameter flow cytometry. Results:Substantial levels of ICAM-1 expression were found in PBLC and EC/DC. Both ICAM-1 expressions in PBLC and EC/DC had a significant dynamic change during peri-implantation stage. The lowest level of ICAM-1 expression was on the second day of pregnancy (D2) in PBLC whereas in EC/DC the lowest level was on D4. Conclusion:The expression of ICAM-1 in EC/DC was regulated in a manner different from that in PBLC. The dynamic changes of ICAM-1 expression may be adapted to accommodate local immune tolerance and could be essential for the regulation of the maternal immune response to the genetically foreing fetus.
, 百拇医药
Key words ICAM-1 PBLC Endometrium Decidua Implantation
细胞粘附分子可介导细胞间及细胞与间质的相互作用并传导信息，参与机体胚胎发育、免疫调节、炎症反应及肿瘤转移等生理和病理过程。细胞间粘附分子-1(ICAM-1或CD54)属免疫球蛋白超家族成员，在静息T细胞上仅有少量表达，当受到IL-1、TNF等炎症因子刺激后，可表达于活化的T细胞、内皮细胞等[1]。由于母体与胎儿具有不同的组织相容性抗原，因而胚泡着床可视为半同种异体移植，与临床移植所不同的是胚泡不被排斥。母体对胚胎的免疫耐受具有复杂的整体和局部反应调控机制。子宫内膜和蜕膜是母体与胚胎滋养层直接接触的特殊组织，已发现蜕膜中含有大量的大颗粒淋巴细胞为蜕膜淋巴细胞，该细胞参与了局部免疫耐受的形成[2]。本研究从整体和局部角度对着床过程中外周血淋巴细胞(PBLC)及子宫内膜细胞(EC)/蜕膜细胞(DC)ICAM-1的不同表达特点进行了动态观察和对比性分析，并探讨了ICAM-1在着床过程中的整体及局部作用。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 动物模型制备及取材 取健康成年雌、雄性昆明系小鼠，自然交配。以合笼次日有阴栓者确定为妊娠第1天(D1)，并依次计算妊娠天数。未孕鼠为对照(Con)。动物模型由中科院发育生物学研究所实验动物中心制备，实验共分6组(Con,D1～D5)，每组雌性小鼠5只。
小鼠经眼球取血300～500 μl，肝素抗凝备用。取血后将鼠处死，开腹，切下子宫，纵向剪开，经生理盐水清洗后滤纸吸干，以手术刀片轻轻刮取内膜组织。EC/DC悬液制备按文献[3]方法进行，调整细胞数为1×106 ml-1。
1.2 试剂 FITC标记抗小鼠ICAM-1(CD54单抗，Clone：3E2(BD-Pharmingen，美国)。IgG1-FITC同型荧光对照单抗，FACSLysing红细胞裂解液(BDIS，美国)。
, 百拇医药
1.3 荧光染色 所有细胞染色均采用直接免疫荧光标记。外周抗凝血采用全血红细胞裂解技术[4]。取EC/DC悬液离心去上清，加入FITC标记抗小鼠ICAM-1单抗20 μl，混匀，避光染色30 min；PBS洗细胞两次，悬于0.6 ml PBS中上机。每组样品均设有IgG1-FITC同型荧光对照。
1.4 流式细胞术分析 流式细胞术分析采用FACSCalibur型流式细胞仪(Becton-Dickinson，美国)，激光光源激发光波长488 nm，FITC荧光检测波长530 nm。所有流式参数均采用CellQuest(Becton-Dickinson)软件进行获取和分析。在前向角及侧向角三维散射光图中对PBLC进行设门(R1)，使R1内PBLC大于98%，单核及粒细胞低于2%(图1a)；由于EC/DC的散射光相对不集中，在其二维散点图中对整个EC/DC群体进行设门(R2)(图1b)。获取细胞总数10 000个。在FL1荧光图中，以IgG1-FITC荧光对照为基础测定ICAM-1阳性细胞表达比率(图1c)。每组进行3个实验取均值(x±s)。两组间统计资料比较采用t检验。
, 百拇医药
图1 流式细胞术分析
Fig.1 FCM analysis
2 结果2.1 着床期外周血淋巴细胞ICAM-1的表达 由表1及图2可见，着床过程小鼠外周血淋巴细胞ICAM-1的表达存在明显的动态变化，其表达水平于D1即开始降低，D2降至最低点，D3开始恢复，至D4 ICAM-1的表达基本恢复到Con水平。
图2 ICAM-1在着床期PBLC和EC/DC中的动态变化
Fig.2 Dynamic changes of ICAM-1 in PBLC and EC/DC at peri-implantation stage
, 百拇医药 表1 ICAM-1在着床期小鼠PBLC及EC/DC中的表达
Tab.1 ICAM-1 expression in mouse PBLC and EC/DC at peri-implantation stage
Con
D1
D2
D3
D4
D5
PBLC
39.48±4.08
28.74±2.361)
, 百拇医药
20.98±1.501)
25.80±1.301)
37.02±1.30
37.05±2.20
EC/DC
64.40±3.32
58.20±3.82
44.05±7.281)
28.56±5.771)
22.85±3.821)
, 百拇医药
32.33±1.531)
Note: 1)P<0.05 vs control;PBLC:peripheral blood lymphocyte;DC:decidua cell;EC:endometrial cell
2.2 着床期EC/DC ICAM-1的表达 实验结果显示，与PBLC相似，ICAM-1在着床期小鼠EC/DC中的表达亦存在着明显的动态变化(表1，图2)。但与前者不同的是，EC/DC 中ICAM-1的表达于D2开始降低，至D4降到最低点，D5开始恢复，但尚未恢复到D1和Con水平。
3 讨论
胚泡着床是一个细胞识别、粘附的过程，其中包含着复杂的免疫识别和免疫耐受机制。ICAM-1为单链跨膜糖蛋白，其受体为整合素家族的粘附分子——白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)。已发现ICAM-1/LFA-1的相互作用在淋巴细胞与内皮细胞的结合及淋巴细胞介导的细胞毒反应过程中具有至关重要的作用。IFNγ、TNFα和IL-1等细胞因子可影响ICAM-1在多种细胞表面的表达，参与免疫反应或促进炎症的发生和发展[5]。Igor等的研究发现，早孕10 w的人蜕膜组织中，CD3+细胞的ICAM-1表达明显高于外周血淋巴细胞的ICAM-1表达[6]。组化实验亦显示早孕人蜕膜淋巴细胞有大量ICAM-1表达[7]。上述研究者均认为，与外周血相比，蜕膜淋巴细胞处于局部活化状态，类似于局部炎症反应。然而，蜕膜中的淋巴细胞是否在原位被活化且活化状态持续存在是个十分重要的问题；因为如果蜕膜中活化的淋巴细胞识别胚胎半抗原并发生免疫应答，就很难解释胚胎的植入和存活。我们的研究发现，在子宫内膜/蜕膜细胞中确有一定量的ICAM-1表达，但这种表达在着床过程中存在明显的动态学变化。
, 百拇医药
生理状态下，小鼠胚泡于D1～D2游离于子宫腔，D3～D3.5进行胚泡识别和粘附，D4完成植入，本实验发现，着床期小鼠PBLC中ICAM-1表达于胚泡识别、粘附前即D2降至最低；而EC/DC中的ICAM-1表达于胚泡完成植入时即D4达最低点，与PBLC相比滞后2 d。而D2～D4恰为胚泡进行识别、粘附和植入的时期，在此阶段PBLC及EC/DC表面ICAM-1的相继降低，体现了整体和局部在着床这一特定时期免疫反应性的降低，而且这种免疫反应的改变其整体变化在先，局部变化在后。基于上述实验发现和结论，有理由认为，ICAM-1在着床期PBLC及EC/DC中的表达具有特定的免疫学意义，ICAM-1表达阳性的细胞代表着活化的功能性细胞，但这种活化状态并非持续不变。ICAM-1在PBLC及EC/DC的表达于着床期D2～D4的降低，提示由ICAM-1/LFA-1介导的静息淋巴细胞的活化及白细胞与内皮细胞的粘附、游走等作用受到抑制，而这种抑制作用参与了胚泡着床过程中局部免疫耐受的形成。上述细胞ICAM-1动态表达的机制尚有待深入研究。
, http://www.100md.com ①本课题由中科院动物所生殖生物学国家重点实验室资助
作者简介：李 宾，男，31岁，助理研究员，主要研究分析细胞学；
曹泳清，女，70岁，研究员，主要研究生殖生物学
4 参考文献
1 Scheynius A, Lamp R， Pur E. Reduced contact sensitivity reactions in mice treated with monoclonal antibodies to leukocyte function-associated molecule-1 and intercellular adhesion molecule-1. J Immunol, 1993;150:655
2 Bulmer J N, Morrison L, Longfellow M et al. Cellular and molecular biolgy of the materno-fetal relationship. Paris: John Libbey Euroyext, 1991:189-196
, 百拇医药
3 Victor P C, Igor I S, Genady I B. Phenotypic characterization of CD7+,CD3+ and CD8+ lymphocytes from first trimester human decidua using two-color flow cytometry. Americal J Rep Immounol， 1993;29:5
4 Ludwig E, Frans S, Peter V et al. Multivareate reconstruction of lymphocyte profiles in a two-dimensional graphical model as a tool for the investigation of lymphocyte subset distrbution in health and disease. Cytometry, 1997;28:200
, 百拇医药
5 Mackay C R, Imhof B A. Cell adhesion in the immune system. Immunol Today, 1993;14:99
6 Igor I S, Victor P C, Alena A M et al. Differential expression of adhesion and homing molecules by human decidual and peripheral blood 1ymphocytes in early pregncy. Cellular Immunol， 1994;158:29
7 Peter R, Klaus M, Edwin K et al. Distribution of cell adhesion molecules in decidua of early human pregnancy: an immunohistochemical study. Lab Invest,1994;71(1):94
收稿1998-02-14 修回1999-02-01, 百拇医药
单位：李 宾 周春喜 王黎明 解放军总医院，北京100853；王 妮 陈幼珍 曹泳清 中科院动物所生殖生物学国家重点实验室，北京100080
关键词：ICAM-1；PBLC；子宫内膜；蜕膜；着床
中国免疫学杂志990710 中国图书分类号 R392.1
摘 要 目的：研究细胞间粘附因子-1(ICAM-1)在着床期外周血淋巴细胞(PBLC)、子宫内膜及蜕膜细胞(EC/DC)中的不同表达特点及动态变化规律。方法：以着床期小鼠为动物模型，细胞分析采用单抗免疫荧光标记及多参数流式细胞术分析技术。结果：发现ICAM-1在PBLC、EC/DC中的表达均存在明显的动态变化；其中ICAM-1的表达在PBLC中于妊娠第2天(D2)达最低水平，而在EC/DC中于妊娠第4天(D4)降至最低。结论：ICAM-1在PBLC及EC/DC中的动态表达具有不同的调控机制，这种动态变化参与了着床过程中局部免疫耐受的形成及调控。
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Study on dynamic changes of ICAM-1 in mouse PBLC and EC/DC at peri-implantation stage
LI Bin,ZHOU Chun-Xi, WANG Li-Ming et al.
Flow Cytometry Lab, General Hospital of PLA, Beijing 100853
Abstract Objctive:The study was to investigate the expressions and dynamic changes of intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) in peripheral blood lymphocytes(PBLC),endometrial and decidual cells(EC/DC) at peri-implantation stage. Methods:Cells were stained by direct immunofluorescence staining with FITC-conjugated antimouse ICAM-1 McAb and studied by multi-parameter flow cytometry. Results:Substantial levels of ICAM-1 expression were found in PBLC and EC/DC. Both ICAM-1 expressions in PBLC and EC/DC had a significant dynamic change during peri-implantation stage. The lowest level of ICAM-1 expression was on the second day of pregnancy (D2) in PBLC whereas in EC/DC the lowest level was on D4. Conclusion:The expression of ICAM-1 in EC/DC was regulated in a manner different from that in PBLC. The dynamic changes of ICAM-1 expression may be adapted to accommodate local immune tolerance and could be essential for the regulation of the maternal immune response to the genetically foreing fetus.
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Key words ICAM-1 PBLC Endometrium Decidua Implantation
细胞粘附分子可介导细胞间及细胞与间质的相互作用并传导信息，参与机体胚胎发育、免疫调节、炎症反应及肿瘤转移等生理和病理过程。细胞间粘附分子-1(ICAM-1或CD54)属免疫球蛋白超家族成员，在静息T细胞上仅有少量表达，当受到IL-1、TNF等炎症因子刺激后，可表达于活化的T细胞、内皮细胞等[1]。由于母体与胎儿具有不同的组织相容性抗原，因而胚泡着床可视为半同种异体移植，与临床移植所不同的是胚泡不被排斥。母体对胚胎的免疫耐受具有复杂的整体和局部反应调控机制。子宫内膜和蜕膜是母体与胚胎滋养层直接接触的特殊组织，已发现蜕膜中含有大量的大颗粒淋巴细胞为蜕膜淋巴细胞，该细胞参与了局部免疫耐受的形成[2]。本研究从整体和局部角度对着床过程中外周血淋巴细胞(PBLC)及子宫内膜细胞(EC)/蜕膜细胞(DC)ICAM-1的不同表达特点进行了动态观察和对比性分析，并探讨了ICAM-1在着床过程中的整体及局部作用。
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1 材料与方法
1.1 动物模型制备及取材 取健康成年雌、雄性昆明系小鼠，自然交配。以合笼次日有阴栓者确定为妊娠第1天(D1)，并依次计算妊娠天数。未孕鼠为对照(Con)。动物模型由中科院发育生物学研究所实验动物中心制备，实验共分6组(Con,D1～D5)，每组雌性小鼠5只。
小鼠经眼球取血300～500 μl，肝素抗凝备用。取血后将鼠处死，开腹，切下子宫，纵向剪开，经生理盐水清洗后滤纸吸干，以手术刀片轻轻刮取内膜组织。EC/DC悬液制备按文献[3]方法进行，调整细胞数为1×106 ml-1。
1.2 试剂 FITC标记抗小鼠ICAM-1(CD54单抗，Clone：3E2(BD-Pharmingen，美国)。IgG1-FITC同型荧光对照单抗，FACSLysing红细胞裂解液(BDIS，美国)。
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1.3 荧光染色 所有细胞染色均采用直接免疫荧光标记。外周抗凝血采用全血红细胞裂解技术[4]。取EC/DC悬液离心去上清，加入FITC标记抗小鼠ICAM-1单抗20 μl，混匀，避光染色30 min；PBS洗细胞两次，悬于0.6 ml PBS中上机。每组样品均设有IgG1-FITC同型荧光对照。
1.4 流式细胞术分析 流式细胞术分析采用FACSCalibur型流式细胞仪(Becton-Dickinson，美国)，激光光源激发光波长488 nm，FITC荧光检测波长530 nm。所有流式参数均采用CellQuest(Becton-Dickinson)软件进行获取和分析。在前向角及侧向角三维散射光图中对PBLC进行设门(R1)，使R1内PBLC大于98%，单核及粒细胞低于2%(图1a)；由于EC/DC的散射光相对不集中，在其二维散点图中对整个EC/DC群体进行设门(R2)(图1b)。获取细胞总数10 000个。在FL1荧光图中，以IgG1-FITC荧光对照为基础测定ICAM-1阳性细胞表达比率(图1c)。每组进行3个实验取均值(x±s)。两组间统计资料比较采用t检验。
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图1 流式细胞术分析
Fig.1 FCM analysis
2 结果2.1 着床期外周血淋巴细胞ICAM-1的表达 由表1及图2可见，着床过程小鼠外周血淋巴细胞ICAM-1的表达存在明显的动态变化，其表达水平于D1即开始降低，D2降至最低点，D3开始恢复，至D4 ICAM-1的表达基本恢复到Con水平。
图2 ICAM-1在着床期PBLC和EC/DC中的动态变化
Fig.2 Dynamic changes of ICAM-1 in PBLC and EC/DC at peri-implantation stage
, 百拇医药 表1 ICAM-1在着床期小鼠PBLC及EC/DC中的表达
Tab.1 ICAM-1 expression in mouse PBLC and EC/DC at peri-implantation stage
Con
D1
D2
D3
D4
D5
PBLC
39.48±4.08
28.74±2.361)
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20.98±1.501)
25.80±1.301)
37.02±1.30
37.05±2.20
EC/DC
64.40±3.32
58.20±3.82
44.05±7.281)
28.56±5.771)
22.85±3.821)
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32.33±1.531)
Note: 1)P<0.05 vs control;PBLC:peripheral blood lymphocyte;DC:decidua cell;EC:endometrial cell
2.2 着床期EC/DC ICAM-1的表达 实验结果显示，与PBLC相似，ICAM-1在着床期小鼠EC/DC中的表达亦存在着明显的动态变化(表1，图2)。但与前者不同的是，EC/DC 中ICAM-1的表达于D2开始降低，至D4降到最低点，D5开始恢复，但尚未恢复到D1和Con水平。
3 讨论
胚泡着床是一个细胞识别、粘附的过程，其中包含着复杂的免疫识别和免疫耐受机制。ICAM-1为单链跨膜糖蛋白，其受体为整合素家族的粘附分子——白细胞功能相关抗原-1(LFA-1)。已发现ICAM-1/LFA-1的相互作用在淋巴细胞与内皮细胞的结合及淋巴细胞介导的细胞毒反应过程中具有至关重要的作用。IFNγ、TNFα和IL-1等细胞因子可影响ICAM-1在多种细胞表面的表达，参与免疫反应或促进炎症的发生和发展[5]。Igor等的研究发现，早孕10 w的人蜕膜组织中，CD3+细胞的ICAM-1表达明显高于外周血淋巴细胞的ICAM-1表达[6]。组化实验亦显示早孕人蜕膜淋巴细胞有大量ICAM-1表达[7]。上述研究者均认为，与外周血相比，蜕膜淋巴细胞处于局部活化状态，类似于局部炎症反应。然而，蜕膜中的淋巴细胞是否在原位被活化且活化状态持续存在是个十分重要的问题；因为如果蜕膜中活化的淋巴细胞识别胚胎半抗原并发生免疫应答，就很难解释胚胎的植入和存活。我们的研究发现，在子宫内膜/蜕膜细胞中确有一定量的ICAM-1表达，但这种表达在着床过程中存在明显的动态学变化。
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生理状态下，小鼠胚泡于D1～D2游离于子宫腔，D3～D3.5进行胚泡识别和粘附，D4完成植入，本实验发现，着床期小鼠PBLC中ICAM-1表达于胚泡识别、粘附前即D2降至最低；而EC/DC中的ICAM-1表达于胚泡完成植入时即D4达最低点，与PBLC相比滞后2 d。而D2～D4恰为胚泡进行识别、粘附和植入的时期，在此阶段PBLC及EC/DC表面ICAM-1的相继降低，体现了整体和局部在着床这一特定时期免疫反应性的降低，而且这种免疫反应的改变其整体变化在先，局部变化在后。基于上述实验发现和结论，有理由认为，ICAM-1在着床期PBLC及EC/DC中的表达具有特定的免疫学意义，ICAM-1表达阳性的细胞代表着活化的功能性细胞，但这种活化状态并非持续不变。ICAM-1在PBLC及EC/DC的表达于着床期D2～D4的降低，提示由ICAM-1/LFA-1介导的静息淋巴细胞的活化及白细胞与内皮细胞的粘附、游走等作用受到抑制，而这种抑制作用参与了胚泡着床过程中局部免疫耐受的形成。上述细胞ICAM-1动态表达的机制尚有待深入研究。
, http://www.100md.com ①本课题由中科院动物所生殖生物学国家重点实验室资助
作者简介：李 宾，男，31岁，助理研究员，主要研究分析细胞学；
曹泳清，女，70岁，研究员，主要研究生殖生物学
4 参考文献
1 Scheynius A, Lamp R， Pur E. Reduced contact sensitivity reactions in mice treated with monoclonal antibodies to leukocyte function-associated molecule-1 and intercellular adhesion molecule-1. J Immunol, 1993;150:655
2 Bulmer J N, Morrison L, Longfellow M et al. Cellular and molecular biolgy of the materno-fetal relationship. Paris: John Libbey Euroyext, 1991:189-196
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3 Victor P C, Igor I S, Genady I B. Phenotypic characterization of CD7+,CD3+ and CD8+ lymphocytes from first trimester human decidua using two-color flow cytometry. Americal J Rep Immounol， 1993;29:5
4 Ludwig E, Frans S, Peter V et al. Multivareate reconstruction of lymphocyte profiles in a two-dimensional graphical model as a tool for the investigation of lymphocyte subset distrbution in health and disease. Cytometry, 1997;28:200
, 百拇医药
5 Mackay C R, Imhof B A. Cell adhesion in the immune system. Immunol Today, 1993;14:99
6 Igor I S, Victor P C, Alena A M et al. Differential expression of adhesion and homing molecules by human decidual and peripheral blood 1ymphocytes in early pregncy. Cellular Immunol， 1994;158:29
7 Peter R, Klaus M, Edwin K et al. Distribution of cell adhesion molecules in decidua of early human pregnancy: an immunohistochemical study. Lab Invest,1994;71(1):94
收稿1998-02-14 修回1999-02-01, 百拇医药