肝癌TIL细胞转导IL-2基因的生物学变化研究
作者：李东复 王树和 太京华 张国荣
单位：白求恩医科大学第二临床学院消化内科，长春130041；王树和 白求恩医科大学基础医学院免疫教研室，长春130021
关键词：逆转录病毒载体；基因转移；肝癌浸润淋巴细胞(TIL)
中国免疫学杂志990717 中国图书分类号 R392.12
摘 要 目的：为探讨IL-2基因导入肝癌浸润淋巴细胞及对其生物学活性的影响。方法：应用逆转录病毒载体介导IL-2基因导入人肝癌浸润淋巴细胞(TIL)，同时对经转导IL-2基因的肝癌浸润淋巴细胞的杀伤活性，增殖能力及表型等进行了观察。结果：转导IL-2基因后的肝癌浸润淋巴细胞能表达一定量的IL-2，明显高于未转导细胞，但其杀伤肿瘤细胞活性，增殖能力及表型等没有显著变化。结论：应用逆转录病毒载体介导IL-2基因导入人肝癌浸润淋巴细胞获得成功，亦有IL-2基因产物表达。
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Study on transferation with PZIP new SV.IL-2 gene complexs into TIL from hepatocellular carcinoma and effect on biological activities of transfered IL-2 gene TIL
LI Dong-Fu， Wang Shu-He， TAI Jing-Hua et al.
Department of Digestive Medicine of Second Teaching Hospital， Bethune University of Medical Sciences， Changchun 130041
Abstract Objective：To study on transferation with PZIP new SV.IL-2 gene complexs into TIL from hepatocellular carcinoma and effect on biological activities of transfered IL-2 gene TIL.Methods：An eukaryotic expression vector containing human interleukin-2 gene (PZIP new SV.IL-2)was transduced into TIL from hepatocellular carcinoma by retroviral vector gene complexs and in same time phenotype，killing activity and proliferation of transduced IL-2 gene TIL were observed.Results：Transduced IL-2 gene TIL could secret general level IL-2 that was higher than that of TIL secretion，killing activity，proliferation and phenotype of transduced IL-2 gene TIL were no significant change.Conclusion：It was successful that human IL-2 gene was transduced into TIL and TIL cells of transduced IL-2 gene began to secrete IL-2 after 48 h.
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Key words Retroviral vector Gene transduction Tumor infiltrating cells
免疫基因治疗是随着现代分子生物学研究进展而出现的将免疫基因通过载体转染细胞进而表达免疫分子，达到治疗肿瘤目的的一种新的治疗方法[1]。借助逆转录病毒载体将细胞因子基因导入肿瘤细胞或其他载体细胞，并使转导细胞表达基因产物，在体内提高宿主对肿瘤的免疫反应，是国内外肿瘤基因治疗的研究热点之一。本实验通过逆转录病毒载体将IL-2基因导入人肝癌TIL细胞，获得导入基因稳定表达，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞系及其培养 病毒包装细胞系PA317，小鼠成纤维细胞NIH3T3及肝癌TIL细胞均培养在含10%小牛或人AB型血清IMDM培养液中，37℃，5%CO2饱和湿度的条件下每3天换液传代一次。
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1.2 含IL-2cDNA逆转录病毒载体的构建 逆转录病毒载体PZIP NeoSV.(X)1，从北京军科院引进，于载体BamHI单一位点插入IL-2全长cDNA，构建成PZIP NeoSV.IL-2。
1.3 重组病毒的增殖 采用DNA磷酸钙共沉淀法[2]转染病毒包装细胞PA317，转染细胞经G418(1 mg/ml)选择培养2 w后，扩增G418抗性集落，收获24 h含病毒的培养上清，用NIH3T3细胞测定PA317细胞上清中的病毒滴度。
1.4 肝癌TIL细胞的分离 手术切除的肝癌肿块，在无菌条件下去除肿瘤瘤体表面的坏死组织，将瘤体剪成0.5～1.0 mm3的组织碎块，置于含抗生素的IMDM培养液及磁力搅拌棒的烧杯中，加0.1%胶原酶，0.002%I型DNA酶及0.01%透明质酸酶。在磁力搅拌下，于37℃消化2～6 h，消化后的悬液用100目尼龙网过滤去除未消化的瘤体或细胞团，用Hank′s液洗2次，制得细胞悬液，置于底层比重为1.077的100%淋巴细胞分层液，上层为以IMDM培养液稀释的比重为1.055的70%淋巴细胞分层液的液面上。经2 200 r/min 20 min不连续密度梯度离心后，分别收集淋巴细胞与肿瘤细胞。
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1.5 重组病毒感染肝癌TIL细胞 制备的TIL细胞经IL-2培养2～3 w，细胞生长活跃，以3×105细胞/ml置入24孔板内，培养24 h，加入不同稀释倍数含重组病毒的PA317细胞培养上清及终浓度为4 μg/ml的聚凝胺(Sigma公司产品)，10%人AB血清的IMDM培养液中培养24～48 h，G418选择培养2 w，扩增G418抗性集落。
1.6 细胞增殖活性测定及形态学观察 将细胞以5×103/孔的浓度置入96孔板内培养不同时间，用MTT比色法检测细胞增殖活性，并计算倍增时间；用Wright Giemsa原位染色观察细胞形态；CD3、CD4、CD8细胞表型测定，采用间接免疫荧光法。
1.7 转基因TIL细胞杀伤活性与基因表达测定 TIL细胞杀伤活性测定采用3H-TdR释放法，靶细胞为Anip973与K562细胞[3]；IL-2活性测定采用CTLL-2细胞MTT比色法[4]。
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2 结果
2.1 基因转导TIL细胞上清中的IL-2活性 基因转导的TIL细胞在不含G418的IMDM中培养不同时间，收获培养上清，用IL-2依赖细胞系CTLL-2以MTT比色法检测IL-2活性，测得的结果，基因转染TIL上清中含有IL-2，活性明显高于转导PZIP NeoSV.(X)1空载体及未转导的肝癌TIL细胞上清IL-2活性，见图1。
图1 转导IL-2基因后TIL细胞培养上清中IL-2水平
Fig.1 IL-2 level secreted by TIL cell after transfered with IL-2 DNA
2.2 细胞形态学、表型、增殖与杀伤活性变化 在倒置显微镜下及用Wright Giemsa原位染色观察基因转导TIL与未转导TIL细胞未见明显形态学改变。将转导IL-2基因TIL细胞与未转导IL-2基因细胞平行培养12 d，观察其增殖、表型分析与杀伤活性测定，转导前与转导后TIL表型与杀伤活性没有明显变化。其增殖活性略低于转导前，见图2。
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图2 细胞增殖活性动态观察
Fig.2 Kinetic observation of transduced TIL proliferative activity
3 讨论 本研究结果表明，逆转录病毒载体介导IL-2基因导入肝癌TIL细胞后，外源基因在人肝癌TIL细胞系可获得表达，表达量明显高于未进行基因转导的TIL，且转导后的TIL细胞表型、增殖及杀伤肿瘤细胞活性均未见显著改变。TIL细胞的临床应用开始于80年代中后期，是继LAK细胞疗法之后又一新的杀伤自体肿瘤细胞的过继免疫治疗方法，尤其是TIL具有“回巢”和特异性杀伤肿瘤细胞功能，经基因转导后，TIL能表达IL-2基因产物，但其表达IL-2水平尚不够高，因此获得高表达、高特异性转基因TIL，增强患者机体免疫功能，特异性杀伤循环中游离的癌细胞是十分必要的，也是有待于解决的问题。
作者简介：李东复，男，43岁，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要研究消化系肿瘤基因诊断，过继免疫与基因治疗
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4 参考文献
1 Pattel P M，Flemming C L，Rusell S J et al.Cytokine gene transfer as a therapeutic strategy.J Immunol， 1993；149：310
2 Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992：787-793
3 李东复，张兴义，宋玉芳 et al. 肺癌术后患者肿瘤浸润淋巴细胞回输的临床疗效观察.中华肿瘤杂志，1995；17(2)：152
4 Gillis S，Form M M. T cell growth factor：parmetors of production and quantitative microassay for activity.J Immunol，1978；120：2027
收稿1998-08-22 二次修回1999-04-28, http://www.100md.com
单位：白求恩医科大学第二临床学院消化内科，长春130041；王树和 白求恩医科大学基础医学院免疫教研室，长春130021
关键词：逆转录病毒载体；基因转移；肝癌浸润淋巴细胞(TIL)
中国免疫学杂志990717 中国图书分类号 R392.12
摘 要 目的：为探讨IL-2基因导入肝癌浸润淋巴细胞及对其生物学活性的影响。方法：应用逆转录病毒载体介导IL-2基因导入人肝癌浸润淋巴细胞(TIL)，同时对经转导IL-2基因的肝癌浸润淋巴细胞的杀伤活性，增殖能力及表型等进行了观察。结果：转导IL-2基因后的肝癌浸润淋巴细胞能表达一定量的IL-2，明显高于未转导细胞，但其杀伤肿瘤细胞活性，增殖能力及表型等没有显著变化。结论：应用逆转录病毒载体介导IL-2基因导入人肝癌浸润淋巴细胞获得成功，亦有IL-2基因产物表达。
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Study on transferation with PZIP new SV.IL-2 gene complexs into TIL from hepatocellular carcinoma and effect on biological activities of transfered IL-2 gene TIL
LI Dong-Fu， Wang Shu-He， TAI Jing-Hua et al.
Department of Digestive Medicine of Second Teaching Hospital， Bethune University of Medical Sciences， Changchun 130041
Abstract Objective：To study on transferation with PZIP new SV.IL-2 gene complexs into TIL from hepatocellular carcinoma and effect on biological activities of transfered IL-2 gene TIL.Methods：An eukaryotic expression vector containing human interleukin-2 gene (PZIP new SV.IL-2)was transduced into TIL from hepatocellular carcinoma by retroviral vector gene complexs and in same time phenotype，killing activity and proliferation of transduced IL-2 gene TIL were observed.Results：Transduced IL-2 gene TIL could secret general level IL-2 that was higher than that of TIL secretion，killing activity，proliferation and phenotype of transduced IL-2 gene TIL were no significant change.Conclusion：It was successful that human IL-2 gene was transduced into TIL and TIL cells of transduced IL-2 gene began to secrete IL-2 after 48 h.
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Key words Retroviral vector Gene transduction Tumor infiltrating cells
免疫基因治疗是随着现代分子生物学研究进展而出现的将免疫基因通过载体转染细胞进而表达免疫分子，达到治疗肿瘤目的的一种新的治疗方法[1]。借助逆转录病毒载体将细胞因子基因导入肿瘤细胞或其他载体细胞，并使转导细胞表达基因产物，在体内提高宿主对肿瘤的免疫反应，是国内外肿瘤基因治疗的研究热点之一。本实验通过逆转录病毒载体将IL-2基因导入人肝癌TIL细胞，获得导入基因稳定表达，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 细胞系及其培养 病毒包装细胞系PA317，小鼠成纤维细胞NIH3T3及肝癌TIL细胞均培养在含10%小牛或人AB型血清IMDM培养液中，37℃，5%CO2饱和湿度的条件下每3天换液传代一次。
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1.2 含IL-2cDNA逆转录病毒载体的构建 逆转录病毒载体PZIP NeoSV.(X)1，从北京军科院引进，于载体BamHI单一位点插入IL-2全长cDNA，构建成PZIP NeoSV.IL-2。
1.3 重组病毒的增殖 采用DNA磷酸钙共沉淀法[2]转染病毒包装细胞PA317，转染细胞经G418(1 mg/ml)选择培养2 w后，扩增G418抗性集落，收获24 h含病毒的培养上清，用NIH3T3细胞测定PA317细胞上清中的病毒滴度。
1.4 肝癌TIL细胞的分离 手术切除的肝癌肿块，在无菌条件下去除肿瘤瘤体表面的坏死组织，将瘤体剪成0.5～1.0 mm3的组织碎块，置于含抗生素的IMDM培养液及磁力搅拌棒的烧杯中，加0.1%胶原酶，0.002%I型DNA酶及0.01%透明质酸酶。在磁力搅拌下，于37℃消化2～6 h，消化后的悬液用100目尼龙网过滤去除未消化的瘤体或细胞团，用Hank′s液洗2次，制得细胞悬液，置于底层比重为1.077的100%淋巴细胞分层液，上层为以IMDM培养液稀释的比重为1.055的70%淋巴细胞分层液的液面上。经2 200 r/min 20 min不连续密度梯度离心后，分别收集淋巴细胞与肿瘤细胞。
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1.5 重组病毒感染肝癌TIL细胞 制备的TIL细胞经IL-2培养2～3 w，细胞生长活跃，以3×105细胞/ml置入24孔板内，培养24 h，加入不同稀释倍数含重组病毒的PA317细胞培养上清及终浓度为4 μg/ml的聚凝胺(Sigma公司产品)，10%人AB血清的IMDM培养液中培养24～48 h，G418选择培养2 w，扩增G418抗性集落。
1.6 细胞增殖活性测定及形态学观察 将细胞以5×103/孔的浓度置入96孔板内培养不同时间，用MTT比色法检测细胞增殖活性，并计算倍增时间；用Wright Giemsa原位染色观察细胞形态；CD3、CD4、CD8细胞表型测定，采用间接免疫荧光法。
1.7 转基因TIL细胞杀伤活性与基因表达测定 TIL细胞杀伤活性测定采用3H-TdR释放法，靶细胞为Anip973与K562细胞[3]；IL-2活性测定采用CTLL-2细胞MTT比色法[4]。
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2 结果
2.1 基因转导TIL细胞上清中的IL-2活性 基因转导的TIL细胞在不含G418的IMDM中培养不同时间，收获培养上清，用IL-2依赖细胞系CTLL-2以MTT比色法检测IL-2活性，测得的结果，基因转染TIL上清中含有IL-2，活性明显高于转导PZIP NeoSV.(X)1空载体及未转导的肝癌TIL细胞上清IL-2活性，见图1。
图1 转导IL-2基因后TIL细胞培养上清中IL-2水平
Fig.1 IL-2 level secreted by TIL cell after transfered with IL-2 DNA
2.2 细胞形态学、表型、增殖与杀伤活性变化 在倒置显微镜下及用Wright Giemsa原位染色观察基因转导TIL与未转导TIL细胞未见明显形态学改变。将转导IL-2基因TIL细胞与未转导IL-2基因细胞平行培养12 d，观察其增殖、表型分析与杀伤活性测定，转导前与转导后TIL表型与杀伤活性没有明显变化。其增殖活性略低于转导前，见图2。
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图2 细胞增殖活性动态观察
Fig.2 Kinetic observation of transduced TIL proliferative activity
3 讨论 本研究结果表明，逆转录病毒载体介导IL-2基因导入肝癌TIL细胞后，外源基因在人肝癌TIL细胞系可获得表达，表达量明显高于未进行基因转导的TIL，且转导后的TIL细胞表型、增殖及杀伤肿瘤细胞活性均未见显著改变。TIL细胞的临床应用开始于80年代中后期，是继LAK细胞疗法之后又一新的杀伤自体肿瘤细胞的过继免疫治疗方法，尤其是TIL具有“回巢”和特异性杀伤肿瘤细胞功能，经基因转导后，TIL能表达IL-2基因产物，但其表达IL-2水平尚不够高，因此获得高表达、高特异性转基因TIL，增强患者机体免疫功能，特异性杀伤循环中游离的癌细胞是十分必要的，也是有待于解决的问题。
作者简介：李东复，男，43岁，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要研究消化系肿瘤基因诊断，过继免疫与基因治疗
, 百拇医药
4 参考文献
1 Pattel P M，Flemming C L，Rusell S J et al.Cytokine gene transfer as a therapeutic strategy.J Immunol， 1993；149：310
2 Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T.分子克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社，1992：787-793
3 李东复，张兴义，宋玉芳 et al. 肺癌术后患者肿瘤浸润淋巴细胞回输的临床疗效观察.中华肿瘤杂志，1995；17(2)：152
4 Gillis S，Form M M. T cell growth factor：parmetors of production and quantitative microassay for activity.J Immunol，1978；120：2027
收稿1998-08-22 二次修回1999-04-28, http://www.100md.com