粘附分子选择素在IgA肾病中变化的临床意义
作者：周 同 李 晓 郝翠兰 傅秀兰 姚 建 陈 楠 董德长
单位：上海第二医科大学附属瑞金医院肾脏科，上海200025
关键词：IgA肾病；粘附分子；P选择素
中国免疫学杂志990716 中国图书分类号 R593.24
摘 要 目的：为探讨IgA肾病患者血和肾组织中P选择素改变与疾病的关系。方法：采用酶联免疫吸附法、免疫组化及原位杂交技术检测了45例IgA肾病患者血浆和肾组织中P选择素含量及表达水平。结果：IgA肾病患者血浆P选择素含量明显高于正常人，其中肾病综合征组和肾功能减退组含量又较肉眼血尿组、尿检异常组和肾炎综合征组显著增高。P选择素在患者肾组织中广泛表达，其中在Ⅳ级和Ⅴ级IgA肾病肾小球中表达水平明显高于Ⅱ级和Ⅲ级，而它们在肾小管、肾间质中的表达水平又与肾小管间质病变程度密切相关。结论：P选择素可能参与了IgA肾病的发病机制，其血和肾组织中水平可成为判断IgA肾病严重程度及预后的指标。
, 百拇医药
Significance of P-selectin expression in IgA nephropathy
ZHOU Tong, LI Xiao, HAO Cui-Lan et al.
Department of Nephrology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025
Abstract Objective: To investigate the role of P-selectin in IgA nephropathy (IgA N). Methods: Serum P-selectin level was measured by ELISA and P-selectin expression in renal tissue was detected by immunohistochemistry and in situ hybridization in 45 patients with IgA N. Results: s-P-selectin level in the patients was significantly higher than the controls. That in the patients with nephropathy syndrome or renal function insufficient was much higher than in the patients with gross hematuria, abnormal urine analyses or nephritis syndrome. P-selectin extensively expressed in renal tissue in IgA N. Up-regulated glomerular expression of P-selectin in class Ⅳ and Ⅴof IgA N was higher than in classⅡ and Ⅲ. Moreover P-selectin expression in renal tubule and interstitium was associated with tubulointerstitial lesions. Conclusion: The results suggested that P-selectin might play an important role in IgA N, and the level of P-selectin in serum and renal tissue might predict renal outcome in IgA N.
, http://www.100md.com
Key words IgA nephropathy Adhesion molecules P-selectin
IgA肾病是最常见的肾小球疾病之一，近年对其研究已取得长足进展[1]。目前细胞粘附分子在肾小球疾病中的作用已引起人们关注[2]，然而有关选择素与IgA肾病关系的研究报道尚不多见。故本研究检测了45例IgA肾病患者血浆和肾组织中P选择素含量及表达，并就其临床意义进行探讨。
1 材料与方法1.1 对象 由本科肾活检(光镜、免疫荧光、电镜)和临床资料确诊的45例IgA肾病患者，男性25例，女性20例，年龄12～61岁(平均年龄25.4岁)。所有患者均排除系统性红斑狼疮、肝脏疾病、过敏性紫癜及肿瘤等所致的继发性IgA肾病。根据临床表现分为肉眼血尿组、尿检异常组、肾炎综合征组、肾病综合征组及肾功能减退组。并按WHO 1982年病理分级标准分为5级。另外25例健康工作人员血浆及10例正常肾组织作为对照。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 酶联免疫吸附试验 静脉采血，置于含1/10体积2%EDTA抗凝管内，3 000 r/min离心10 min，收集上层血浆置-20℃下保存待测。血浆P选择素检测试剂盒购于苏州医学院，按说明书进行操作。
1.2.2 免疫组化方法 采用链菌素抗生物素蛋白-生物素酶标法(LSAB)。小鼠抗人P选择素单抗购于苏州医学院，LSAB试剂盒购于福建迈新生物技术开发公司(美国加州生物技术公司产品)，操作按说明书进行。PBS代替一抗作空白对照。结果判断：根据染色阳性细胞占该类细胞的比例进行双盲打分(4级半定量法)，0分：阴性；0.5分：阳性细胞少于10%；1.0分：阳性细胞少于25%；2.0分：阳性细胞少于50%；3.0分：阳性细胞大于50%。
1.2.3 原位杂交 肾活检标本经O.C.T包埋后-80℃保存，原位杂交当日冰冻切片(5～6 μm)。反义P选择素寡核苷酸探针(35 bp)由中科院上海细胞生物研究所合成，地高辛标记和检测试剂盒购自德国宝灵曼公司。原位杂交程序参照试剂盒说明书，设空白对照。
, 百拇医药
1.2.4 统计学处理 血浆P选择素含量以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验；两组肾小球P选择素表达水平比较采用等级秩和检验；肾小管、肾间质P选择素表达与肾小管间质病变程度相关性采用等级相关分析。
2 结果
2.1 血浆P选择素含量 45例IgA肾病血浆P选择素较正常人组明显增高(P<0.01)，其中肾病综合征组和肾功能减退组又显著高于肉眼血尿组、尿检异常组和肾炎综合征组，见表1。
表1 IgA肾病患者血浆P选择素含量变化(x±s)
Tab.1 P-selectin level in patients with IgA nephritis(x±s) Groups
n
, 百拇医药 P-selectin (ng/ml)
Controls
25
32.72±10.65
IgA nephropathy
45
49.12±25.252)
Gross hematuria
13
38.95±16.21
Abnomal urine analyses
, 百拇医药
6
40.16±19.851)
Nephritis syndrome
12
48.52±21.322)
Nephropathy syndrome
8
72.12±27.433)4)
Renal function insufficient
6
, 百拇医药 65.34±25.873)4)
Notes:compared with the controls 1)P<0.05 2)P<0.01 3)P<0.001; compared with the groups of gross hematuria, abnormal urine analyses and nephritis syndrome 4)P<0.01
2.2 肾组织中P选择素表达 正常人肾组织中P选择素基本不表达。在IgA肾病肾组织中，P选择素主要分布于肾小球的系膜区、毛细血管及小管间质等部位(图1)，Ⅳ级和Ⅴ级的肾小球P选择素表达水平显著高于Ⅱ级和Ⅲ级(H=5.42,P<0.05)。肾小管间质病变程度(根据肾小管萎缩、间质炎细胞浸润和纤维化程度分为轻、中、重)与P选择素在肾小管、间质的表达水平明显相关(分别为rs=0.395和rs=0.371,P均<0.05)。
, 百拇医药
图1 免疫组化LSAB法检测显示肾小管上皮细胞P选择素阳性染色(×400)
Fig.1 Positive stainning of P-selectin in tubular epithelium by immunohistochemistry (×400)
2.3 原位杂交 对其中15例肾组织冰冻切片进行原位杂交，结果显示肾小球毛细血管袢、系膜区、肾小管上皮细胞及肾间质、血管内皮部位细胞浆中均可见紫蓝色颗粒阳性信号，表明P选择素蛋白质表达部位与其mRNA表达部位一致(图2)。
图2 原位杂交检测显示肾小球系膜区P选择素阳性染色(×1 000)
Fig.2 Expression of P-selectin in mesangium by in situ hybridization(×1 000)
, 百拇医药
3 讨论
IgA肾病发病机制仍不甚清楚，临床和病理表现复杂多样，且预后不尽相同[1]。P选择素系由激活血小板等分泌表达的活化分子或标志，已证明其可介导活化血小板、内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞粘附，在早期炎症、血栓形成中起关键作用[3]。且目前认为，炎细胞与血小板共同参与了炎症与血栓形成过程，抗P选择素单抗可抑制血栓部位的炎细胞浸润，并能进一步减少纤维蛋白的沉积[4]。
本研究发现，IgA肾病患者血浆P选择素明显增高，尤见易发微血栓形成的肾病综合征和肾功能不全患者，表明IgA肾病患者体内不同程度存在血小板激活状态，P选择素可能参与了IgA肾病的血小板激活和血栓形成。一般认为肾内微血栓形成是促使疾病进展乃至肾小球硬化的一个重要因素，并与疾病的严重程度密切相关[5]。本文结果提示，检测由激活血小板释放的P选择素血中水平可反映体内血小板活化及损伤的程度[3]。
, http://www.100md.com
本研究表明P选择素在IgA肾病肾小球中广泛表达，且阳性染色部位与GPIIb/IIIa(血小板膜上含量最多的膜标志糖蛋白)表达部位一致(另文报道)，表明P选择素在病变肾小球中主要表达在血小板上[6，7]。进一步发现P选择素在病变较严重的Ⅳ级和Ⅴ级肾小球中表达水平明显高于Ⅱ级和Ⅲ级，这与血小板在细胞增生为主肾炎肾小球中明显聚集活化相吻合。由此推测活化血小板在P选择素介导下，进一步粘附聚集并释放更多炎性介质，加重肾脏损伤或放大损伤效应[6，8]。
近年认为，肾小管间质病变对肾小球肾炎进展及患者预后具有重要意义。IgA肾病肾小管间质损伤包括上皮细胞变性、坏死、萎缩、间质炎细胞浸润及纤维化[1，9]。本研究发现P选择素也可在肾小管上皮细胞表达，且表达水平高于肾小球和肾间质。进一步发现，IgA肾病肾小管间质病变程度与P选择素在肾小管和肾间质的表达水平显著相关。已知肾小管上皮细胞作为具有抗原提呈作用免疫效应细胞，其可主动参与免疫反应中的抗原提呈，并对淋巴细胞浸润具有趋化和调节作用[10]。而P选择素也被证明可与淋巴细胞等粘附，介导后者在炎症处聚集调节促炎物质产生[11，12]。故本研究推测P选择素可能通过其粘附介导作用，也参与了由肾小管上皮细胞启动的肾小管免疫损伤及相继的肾间质炎细胞浸润，并是随后发展成为肾脏损害的重要因素。
, 百拇医药
总之，本研究表明P选择素作为血小板活化标志和分子，其参与了IgA肾病肾内血小板聚集活化及血栓形成，并在肾小管损伤、间质炎细胞浸润以及纤维化发生中可能具有重要介导作用。对其检测可成为判断IgA肾病严重程度及预后的指标，有待进一步研究。
①本课题受上海市自然科学基金资助(97ZB14016)
作者简介：周 同，男，44岁，副教授，硕士生导师，主要从事肾脏免疫研究
4 参考文献
1 Donadio J V, Granda J P. Immunoglobulin A Nephropathy: A clinical perspective. J Am Soc Nephrol, 1997;8:1324
2 周 同,董德长.细胞粘附分子与肾脏疾病研究进展.国外医学.泌尿系统分册,1994;14(3):97
, 百拇医药
3 李 晓,周 同,董德长. P选择素及其临床意义.上海第二医科大学学报,1997;17(1):62
4 Furis B, Furie B C. The molecular basis of platelet and endothelial cell interaction with neutrophils and monocytes: role of P-selectin ligand, PSGL-1. Thromb Haemostas, 1995;74:224
5 周 同,王鸿利.肾脏疾病与血栓形成.见:李家增,王鸿利主编.血栓病学.北京:科学出版社，1998:213-220
6 Seagwa C, Yokoyama H, Hisada Y et al. In situ expression and soluble form of P-selectin in human glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol, 1996;7:1780
, 百拇医药
7 周 同，李 晓，郝翠兰 et al. 粘附分子P选择素在人类肾小球疾病中表达意义.中华肾脏病杂志，1998；14(3)：155
8 Zoja C, Remuzzi G. Role of platelets in progressive glomerular diseases. Pediatr Nephrol, 1995;9:495
9 Radford M G, Donadio J V, Bergstralh E J et al. Predicting renal outcome in IgA nephropathy. J Am Soc Nephrol, 1997;8:199
10 Singer G G, Yokoyama H, Bloom R D et al. Stimulated renal tubular epithelial cells induce anergy in CD4+ T cells. Kidney Int, 1993;44:1030
, 百拇医药
11 Damle N K, Klussman K, Dietsch M T et al. GMP140 (P-selectin/ CD62p) binds to chronically stimulated but resting CD4+ T lymphocytes and regulates their production of proinflammatory cytokines. Eur J Immunol, 1992;22:1789
12 Moore K I, Thompson L F. P-selectin (CD62p) binds to subpopulations of human T lymphocytes and natural killer cell. Biochem Biophys Res Commun, 1992;186:173
收稿1998-10-23 修回1999-02-01, http://www.100md.com
单位：上海第二医科大学附属瑞金医院肾脏科，上海200025
关键词：IgA肾病；粘附分子；P选择素
中国免疫学杂志990716 中国图书分类号 R593.24
摘 要 目的：为探讨IgA肾病患者血和肾组织中P选择素改变与疾病的关系。方法：采用酶联免疫吸附法、免疫组化及原位杂交技术检测了45例IgA肾病患者血浆和肾组织中P选择素含量及表达水平。结果：IgA肾病患者血浆P选择素含量明显高于正常人，其中肾病综合征组和肾功能减退组含量又较肉眼血尿组、尿检异常组和肾炎综合征组显著增高。P选择素在患者肾组织中广泛表达，其中在Ⅳ级和Ⅴ级IgA肾病肾小球中表达水平明显高于Ⅱ级和Ⅲ级，而它们在肾小管、肾间质中的表达水平又与肾小管间质病变程度密切相关。结论：P选择素可能参与了IgA肾病的发病机制，其血和肾组织中水平可成为判断IgA肾病严重程度及预后的指标。
, 百拇医药
Significance of P-selectin expression in IgA nephropathy
ZHOU Tong, LI Xiao, HAO Cui-Lan et al.
Department of Nephrology, Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025
Abstract Objective: To investigate the role of P-selectin in IgA nephropathy (IgA N). Methods: Serum P-selectin level was measured by ELISA and P-selectin expression in renal tissue was detected by immunohistochemistry and in situ hybridization in 45 patients with IgA N. Results: s-P-selectin level in the patients was significantly higher than the controls. That in the patients with nephropathy syndrome or renal function insufficient was much higher than in the patients with gross hematuria, abnormal urine analyses or nephritis syndrome. P-selectin extensively expressed in renal tissue in IgA N. Up-regulated glomerular expression of P-selectin in class Ⅳ and Ⅴof IgA N was higher than in classⅡ and Ⅲ. Moreover P-selectin expression in renal tubule and interstitium was associated with tubulointerstitial lesions. Conclusion: The results suggested that P-selectin might play an important role in IgA N, and the level of P-selectin in serum and renal tissue might predict renal outcome in IgA N.
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Key words IgA nephropathy Adhesion molecules P-selectin
IgA肾病是最常见的肾小球疾病之一，近年对其研究已取得长足进展[1]。目前细胞粘附分子在肾小球疾病中的作用已引起人们关注[2]，然而有关选择素与IgA肾病关系的研究报道尚不多见。故本研究检测了45例IgA肾病患者血浆和肾组织中P选择素含量及表达，并就其临床意义进行探讨。
1 材料与方法1.1 对象 由本科肾活检(光镜、免疫荧光、电镜)和临床资料确诊的45例IgA肾病患者，男性25例，女性20例，年龄12～61岁(平均年龄25.4岁)。所有患者均排除系统性红斑狼疮、肝脏疾病、过敏性紫癜及肿瘤等所致的继发性IgA肾病。根据临床表现分为肉眼血尿组、尿检异常组、肾炎综合征组、肾病综合征组及肾功能减退组。并按WHO 1982年病理分级标准分为5级。另外25例健康工作人员血浆及10例正常肾组织作为对照。
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1.2 方法
1.2.1 酶联免疫吸附试验 静脉采血，置于含1/10体积2%EDTA抗凝管内，3 000 r/min离心10 min，收集上层血浆置-20℃下保存待测。血浆P选择素检测试剂盒购于苏州医学院，按说明书进行操作。
1.2.2 免疫组化方法 采用链菌素抗生物素蛋白-生物素酶标法(LSAB)。小鼠抗人P选择素单抗购于苏州医学院，LSAB试剂盒购于福建迈新生物技术开发公司(美国加州生物技术公司产品)，操作按说明书进行。PBS代替一抗作空白对照。结果判断：根据染色阳性细胞占该类细胞的比例进行双盲打分(4级半定量法)，0分：阴性；0.5分：阳性细胞少于10%；1.0分：阳性细胞少于25%；2.0分：阳性细胞少于50%；3.0分：阳性细胞大于50%。
1.2.3 原位杂交 肾活检标本经O.C.T包埋后-80℃保存，原位杂交当日冰冻切片(5～6 μm)。反义P选择素寡核苷酸探针(35 bp)由中科院上海细胞生物研究所合成，地高辛标记和检测试剂盒购自德国宝灵曼公司。原位杂交程序参照试剂盒说明书，设空白对照。
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1.2.4 统计学处理 血浆P选择素含量以均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用t检验；两组肾小球P选择素表达水平比较采用等级秩和检验；肾小管、肾间质P选择素表达与肾小管间质病变程度相关性采用等级相关分析。
2 结果
2.1 血浆P选择素含量 45例IgA肾病血浆P选择素较正常人组明显增高(P<0.01)，其中肾病综合征组和肾功能减退组又显著高于肉眼血尿组、尿检异常组和肾炎综合征组，见表1。
表1 IgA肾病患者血浆P选择素含量变化(x±s)
Tab.1 P-selectin level in patients with IgA nephritis(x±s) Groups
n
, 百拇医药 P-selectin (ng/ml)
Controls
25
32.72±10.65
IgA nephropathy
45
49.12±25.252)
Gross hematuria
13
38.95±16.21
Abnomal urine analyses
, 百拇医药
6
40.16±19.851)
Nephritis syndrome
12
48.52±21.322)
Nephropathy syndrome
8
72.12±27.433)4)
Renal function insufficient
6
, 百拇医药 65.34±25.873)4)
Notes:compared with the controls 1)P<0.05 2)P<0.01 3)P<0.001; compared with the groups of gross hematuria, abnormal urine analyses and nephritis syndrome 4)P<0.01
2.2 肾组织中P选择素表达 正常人肾组织中P选择素基本不表达。在IgA肾病肾组织中，P选择素主要分布于肾小球的系膜区、毛细血管及小管间质等部位(图1)，Ⅳ级和Ⅴ级的肾小球P选择素表达水平显著高于Ⅱ级和Ⅲ级(H=5.42,P<0.05)。肾小管间质病变程度(根据肾小管萎缩、间质炎细胞浸润和纤维化程度分为轻、中、重)与P选择素在肾小管、间质的表达水平明显相关(分别为rs=0.395和rs=0.371,P均<0.05)。
, 百拇医药
图1 免疫组化LSAB法检测显示肾小管上皮细胞P选择素阳性染色(×400)
Fig.1 Positive stainning of P-selectin in tubular epithelium by immunohistochemistry (×400)
2.3 原位杂交 对其中15例肾组织冰冻切片进行原位杂交，结果显示肾小球毛细血管袢、系膜区、肾小管上皮细胞及肾间质、血管内皮部位细胞浆中均可见紫蓝色颗粒阳性信号，表明P选择素蛋白质表达部位与其mRNA表达部位一致(图2)。
图2 原位杂交检测显示肾小球系膜区P选择素阳性染色(×1 000)
Fig.2 Expression of P-selectin in mesangium by in situ hybridization(×1 000)
, 百拇医药
3 讨论
IgA肾病发病机制仍不甚清楚，临床和病理表现复杂多样，且预后不尽相同[1]。P选择素系由激活血小板等分泌表达的活化分子或标志，已证明其可介导活化血小板、内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞粘附，在早期炎症、血栓形成中起关键作用[3]。且目前认为，炎细胞与血小板共同参与了炎症与血栓形成过程，抗P选择素单抗可抑制血栓部位的炎细胞浸润，并能进一步减少纤维蛋白的沉积[4]。
本研究发现，IgA肾病患者血浆P选择素明显增高，尤见易发微血栓形成的肾病综合征和肾功能不全患者，表明IgA肾病患者体内不同程度存在血小板激活状态，P选择素可能参与了IgA肾病的血小板激活和血栓形成。一般认为肾内微血栓形成是促使疾病进展乃至肾小球硬化的一个重要因素，并与疾病的严重程度密切相关[5]。本文结果提示，检测由激活血小板释放的P选择素血中水平可反映体内血小板活化及损伤的程度[3]。
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本研究表明P选择素在IgA肾病肾小球中广泛表达，且阳性染色部位与GPIIb/IIIa(血小板膜上含量最多的膜标志糖蛋白)表达部位一致(另文报道)，表明P选择素在病变肾小球中主要表达在血小板上[6，7]。进一步发现P选择素在病变较严重的Ⅳ级和Ⅴ级肾小球中表达水平明显高于Ⅱ级和Ⅲ级，这与血小板在细胞增生为主肾炎肾小球中明显聚集活化相吻合。由此推测活化血小板在P选择素介导下，进一步粘附聚集并释放更多炎性介质，加重肾脏损伤或放大损伤效应[6，8]。
近年认为，肾小管间质病变对肾小球肾炎进展及患者预后具有重要意义。IgA肾病肾小管间质损伤包括上皮细胞变性、坏死、萎缩、间质炎细胞浸润及纤维化[1，9]。本研究发现P选择素也可在肾小管上皮细胞表达，且表达水平高于肾小球和肾间质。进一步发现，IgA肾病肾小管间质病变程度与P选择素在肾小管和肾间质的表达水平显著相关。已知肾小管上皮细胞作为具有抗原提呈作用免疫效应细胞，其可主动参与免疫反应中的抗原提呈，并对淋巴细胞浸润具有趋化和调节作用[10]。而P选择素也被证明可与淋巴细胞等粘附，介导后者在炎症处聚集调节促炎物质产生[11，12]。故本研究推测P选择素可能通过其粘附介导作用，也参与了由肾小管上皮细胞启动的肾小管免疫损伤及相继的肾间质炎细胞浸润，并是随后发展成为肾脏损害的重要因素。
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总之，本研究表明P选择素作为血小板活化标志和分子，其参与了IgA肾病肾内血小板聚集活化及血栓形成，并在肾小管损伤、间质炎细胞浸润以及纤维化发生中可能具有重要介导作用。对其检测可成为判断IgA肾病严重程度及预后的指标，有待进一步研究。
①本课题受上海市自然科学基金资助(97ZB14016)
作者简介：周 同，男，44岁，副教授，硕士生导师，主要从事肾脏免疫研究
4 参考文献
1 Donadio J V, Granda J P. Immunoglobulin A Nephropathy: A clinical perspective. J Am Soc Nephrol, 1997;8:1324
2 周 同,董德长.细胞粘附分子与肾脏疾病研究进展.国外医学.泌尿系统分册,1994;14(3):97
, 百拇医药
3 李 晓,周 同,董德长. P选择素及其临床意义.上海第二医科大学学报,1997;17(1):62
4 Furis B, Furie B C. The molecular basis of platelet and endothelial cell interaction with neutrophils and monocytes: role of P-selectin ligand, PSGL-1. Thromb Haemostas, 1995;74:224
5 周 同,王鸿利.肾脏疾病与血栓形成.见:李家增,王鸿利主编.血栓病学.北京:科学出版社，1998:213-220
6 Seagwa C, Yokoyama H, Hisada Y et al. In situ expression and soluble form of P-selectin in human glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol, 1996;7:1780
, 百拇医药
7 周 同，李 晓，郝翠兰 et al. 粘附分子P选择素在人类肾小球疾病中表达意义.中华肾脏病杂志，1998；14(3)：155
8 Zoja C, Remuzzi G. Role of platelets in progressive glomerular diseases. Pediatr Nephrol, 1995;9:495
9 Radford M G, Donadio J V, Bergstralh E J et al. Predicting renal outcome in IgA nephropathy. J Am Soc Nephrol, 1997;8:199
10 Singer G G, Yokoyama H, Bloom R D et al. Stimulated renal tubular epithelial cells induce anergy in CD4+ T cells. Kidney Int, 1993;44:1030
, 百拇医药
11 Damle N K, Klussman K, Dietsch M T et al. GMP140 (P-selectin/ CD62p) binds to chronically stimulated but resting CD4+ T lymphocytes and regulates their production of proinflammatory cytokines. Eur J Immunol, 1992;22:1789
12 Moore K I, Thompson L F. P-selectin (CD62p) binds to subpopulations of human T lymphocytes and natural killer cell. Biochem Biophys Res Commun, 1992;186:173
收稿1998-10-23 修回1999-02-01, http://www.100md.com