细胞因子对小鼠α2(I)型前胶原基因启动子活性影响的研究①
作者：高春芳 印 彤 王 皓 孔宪涛
单位：高春芳 王 皓 孔宪涛 上海第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心，上海200003；印 彤 上海瑞金医院临床免疫学教研室，上海200020
关键词：细胞因子；胶原；基因
中国免疫学杂志990704 中国图书分类号 R392
摘 要 目的：探讨细胞因子对小鼠α2(I)型前胶原基因上游启动子活性的影响。方法：以小鼠α2(I)型前胶原基因启动子(-2 kb～+54 bp)为靶序列，将它与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成的重组体pAZ1009用脂质体法转染至胶原产生细胞NIH/3T3细胞，讨论IFNα、IFNγ、TNFα对小鼠α2(I)型前胶原基因上游启动子活性的影响。结果：TNFα抑制小鼠α2(I)型前胶原基因启动子活性，TNFα分别与IFNγ、IFNα联合应用能加强这种抑制作用。结论：TNFα分别与IFNγ、IFNα联合应用能加强抑制作用，这可能与IFNγ、IFNα诱导TNFα受体表达，从而加强TNFα抑制作用有关，而IFNγ抑制胶原蛋白合成作用与该序列无直接相关。
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The effect of cytokines on promoter activity of α2(I)procollagen gene
GAO Chun-Fang, YIN Tong, WANG Hao et al.
Clinical Immunology Center, Changzheng Hospital , Shanghai 200003
Abstract Objective: To study the effect of cytokines on promoter activity of α2(I) procollagen gene. Methods: This study focused on the promoter sequence -2 kb ～ +54 bp of mouse α2(I) procollagen gene and the effect of TNFα, IFNα, IFNγ on promoter activity. The construction pAZ1009 containing this sequence and CAT as reporter gene was transfected to cytokines-treated NIH/3T3 cells with liposomal transfection method. Cytokines treatment was continued for another 24 hours after transfection. Results: The study reveals that TNFα inhibits promoter activity of mouse α2(I) procollagen gene, this inhibition effect is even stronger when TNFα was used in combination with IFNγ or IFNα. Conclusion: A potential explanation for this synergism is provided by the finding that IFNγ, IFNα can increase the number of TNFα receptor, thus making these cells more susceptible to TNFα modulation. The inhibition effect of IFNγ on procollagen production seems have no direct relation with the promoter sequence.
, 百拇医药
Key words Cytokines Collagein Gene
胶原蛋白异常沉积是危及机体多种器官的纤维化疾病的重要特征，肺、肝脏、肾脏、心脏、皮肤等均可能是这种纤维化损伤的靶器官。研究表明，过度沉积的胶原蛋白如I型胶原与其产生细胞相应基因的激活有关[1，2]。早期的研究已证实肝纤维化形成时肝脏贮脂细胞合成的I型胶原mRNA水平显著上升[3]。尽管目前纤维化疾病中胶原基因表达激活机理仍不清楚，但胶原基因的激活常与炎症损伤相伴出现，提示细胞因子与胶原基因激活有关[4，5]。目前较明确的多肽类生长因子TGFβ能显著激活前胶原基因[6，7]，而淋巴因子TNFα、IFNγ有一定的抗纤维化活性[8，9]。本研究应用小鼠α2(I)前胶原基因启动子(-2 kb～+54 bp)与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成的重组体及基因转染技术，探讨IFNα、IFNγ、TNFα对小鼠α2(I)前胶原基因上游启动子活性的影响。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养 小鼠NIH/3T3细胞以含10%FCS的1640(Gibco)培养，0.125%胰蛋白酶(Sigma)消化传代。
1.2 重组体质粒的制备 含小鼠α2(I)前胶原基因启动子-2 kb～+54 bp及报告基因的重组体质粒pZA1009美国NIC Crombrugghe教授惠赠[10](见图1)，经转染至大肠杆菌并筛选，酶切鉴定正确后，Qiagen plasmid midi kit大量扩增抽提、纯化质粒，紫外分光光度计(Du-600, Beckman)测得率、纯度，-20℃保存待用。作内对照用的碱性磷酸酶表达质粒pSVA2P(Merck & Co.InC.惠赠)及阳性对照含CAT的表达质粒pSV2CAT(Invitrogen)亦经同上方法扩增，抽提纯化后-20℃保存待用[11]。
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图1 含小鼠α 2(I)型前胶原基因-2 kb～+54 bp片段(黑色部分)及CAT报告基因的质粒pAZ1009
Fig.1 Plasmid PAZ 1009 contains-2 kb～+54 bp fragment of mouse α2(I) procollagen gene (black part) and CAT as reporter gene
1.3 DNA转染及细胞因子处理 DNA转染采用Dosper脂质体转染法(Boehringer-Mannheim)：NIH/3T3细胞以5×105/孔接种于6孔培养板(Nunc)，细胞贴壁后分别用rhTNFα(第二军医大学)100 U/ml、 rhIFNα(Roche)1 000 U/ml+rhTNFα 100 U/ml、rhIFNγ人或鼠(第二军医大学)1 000 U/ml+rhTNFα 100 U/ml处理24 h换新鲜但不含FCS的培养基，质粒DNA以脂质体/DNA复合物形式加入上述细胞培养孔中，同时转染碱性磷酸酶表达质粒pSVA2P(Merck&Co.InC.惠赠)作内对照及含CAT的表达质粒(Invitrogen)作阳性对照。转染后6 h，每孔细胞加两倍于正常量的FCS(20%)，24 h后换新鲜含10%FCS的培养基，并加转染前相同种类、数量的细胞因子，继续培养24 h后，测报告基因CAT活性。
, 百拇医药
1.4 CAT及碱性磷酸酶(AP)活性测定 终止培养的细胞用预冷的PBS洗3遍，以裂解缓冲液(Boehringer-Mannheim)裂解细胞后，进行蛋白定量(Bradford法)、AP活性测定(Trace CB171半自动生化分析仪)及CAT-ELISA(Boehringer-Mannheim)定量。
2 结果
胶原产生细胞NIH/3T3细胞经细胞因子预处理和转染后再处理24 h，ELISA测定细胞裂解液中CAT表达量，同时测定蛋白浓度及AP活性，AP表达活性作为内对照以保持转染效率，相同条件下比较CAT表达量。CAT测定结果用相应蛋白含量及AP活性校正后与未经细胞因子处理的细胞裂解液CAT的相对比值见图2，即TNFα 100 U/ml，IFNα 1 000 U/ml+TNFα 100 U/ml，IFNγ 1 000 U/ml+TNFα 100 U/ml预处理24 h及后处理24 h的细胞CAT表达活性下降，亦即上述细胞因子下调小鼠α2(I)型前胶原基因启动活性。
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图2 转染pAZ1009的NIH/3T3细胞经细胞因子处理与未处理者CAT相对表达量
Fig.2 Relative expression levels of CAT in pAZ1009-transfected NIH/3T3 cells treatd with IFNs and TNFα
Note:values shown represent the average ratio for three seperate experiments
3 讨论
I型胶原由两种蛋白肽链α1(I)、α2(I)组成。组织损伤后纤维母细胞I型前胶原基因表达激活，参与疤痕或纤维化，这也正是临床上常见的器官纤维化如肝纤维化、皮肤疤痕形成等典型例证。调节I型胶原蛋白产生的机制可发生在转录水平和转录后水平，其中转录水平的调节主要通过靶基因上顺式DNA序列与其反式蛋白因子相互作用完成。目前研究已在人、鼠I型前胶原基因启动子及第一个内含子中发现存在重要的调控序列[12]。能显著促进纤维化形成的细胞因子TGFβ的反应元件即位于小鼠α2(I)转录起始点上游几百bp处，SP-1(Specific protein-1)与该序列作用是TGFβ诱导小鼠α2(I)前胶原基因表达的重要机制之一，其它核蛋白转录因子亦参与了这种激活过程[13]。TNFα、IFNγ是目前较为明确的抗纤维化因子，我们早期的研究表明，TNFα在单细胞水平可降低大鼠肝贮脂细胞及NIH/3T3细胞前胶原Ⅰ、Ⅲ mRNA表达[14]，为进一步研究这两种细胞因子抗纤维化的作用机制，本研究以能调控胶原α2(I)型特异表达的小鼠前胶原α2(I)基因5′侧翼区2 kb～+54 bp(包括部分外显子I)的片段为靶序列，CAT作报告基因，脂质体法转染该重组体pAZ1009至NIH/3T3细胞，结果发现，TNFα(100 U/ml)抑制CAT表达，亦即抑制小鼠α2(I)前胶原2 kb～+54 bp启动活性，TNFα分别与IFNγ(1 000 U/ml)、IFNα(1 000 U/ml)联合应用也具有抑制作用，但单独应用IFNγ或IFNα不仅无抑制活性相反有轻度促进作用(资料未显示)，本结果与Kahari等的报道类似[8]。单独应用IFNγ、 IFNα无抑制作用的可能原因为：IFNγ、 IFNα抑制小鼠α2(I)型前胶原基因转录活性的作用靶部位可能位于2 kb～+54 bp以外；IFNγ、IFNα抑制胶原合成的作用机制可能在于降低胶原mRNA稳定性或调控作用发生于转录后水平[8]。目前我们正致力于研究定位抗纤维化因子TNFα、IFNγ及致纤维化因子(如TGFβ)对小鼠α2(I)型胶原启动子(2 kb～+54 bp)的调控靶序列及其相应反式作用蛋白，有望在激活态胶原产生细胞中发现纤维化相关的新的或特异核转录因子，这一研究将有助于我们进一步认识纤维化(硬化)发生中胶原基因如何被转录激活，为纤维化的逆转提供新的思路。
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致谢：王爱华副主任技师和张玲珍主管技师对本文研究工作给予极大支持和帮助，特此致谢!
①本课题为国家自然科学基金资助项目
作者简介：高春芳，女，35岁，博士，副研究员，主要研究肝纤维化的免疫原及分子生物学机制研究；
王 皓，男，28岁，技师，主要研究肝病分子生物学机制
4 参考文献
1 Bissel M D,Friedman S L,Maher J J et al. Connective tissue biology and hepatic fibrosis: report of conference. Hepatology, 1990;11:599
2 Milani S,Herbst H,Schuppan D et al. Cellular localization of type I, type Ⅲ and Ⅳ procollagen gene transcripts in normal and fibrotic human liver. Am J Pathol, 1990;137:59
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3 Friedman S L. The cellular basis of hepatic fibrosis. Mechanisms and treatment strategies. N Eng1 J Med, 1993;328:1828
4 Peterson T C, Isbrucker R A. Fibroproliferation in liver disease: role of monocyte factors. Hepatology, 1992;15:191
5 Rockey D C, Chung J J. Interferon γ inhibits lipocyte activation and extracellular matrix mRNA expression during experimental liver injury: implication for treatment of hepatic fibrosis. J Investig Med, 1994;42:660
, http://www.100md.com
6 Gao C F, Gressner G, Zoremba M et al. Transforming growth factor β expression in isolated and cultured rat hepatocytes. J Cell Physiol, 1996;167:394
7 Inagaki Y, Truter S, Tanaka S et al. Overlapping pathways mediate the opposing actions of TNF alpha and TGF beta on alpha2(I) collagen transcription. J Biol Chem, 1995;270:3353
8 Kahari V M, Chen Y Q, Su M W et al. Tumor necrosis factor alpha and interferon gamma suppress the activation of human type I collagen expression by TG Fbetal. J Clin Invest, 1990;86:1498
, http://www.100md.com
9 Rockey D C, Maher J J, Jarnagin W R et al. Inhibition of rat hepatic lipocyte activation in culture by interferon γ. Hepatology,1992;16:776
10 Schmidt A, Rossi P, Crombrugghe B. Transcriptional control of the mouse ahpha2(I) collagen gene: functional deletion analysis of the promoter and evidence for cell-speific expression. Mol Cell Biol, 1986;6:347
11 Yoon K, Thiede M, Rodan G A. Alkaline phosphatase as a report enzyme. Gene, 1998;66:1110
, 百拇医药
12 Li L, Artlett C M, Jimenez S A et al. Positive regulation of human alpha1(I) collagen promoter activity by transcriptional factor SP1. Gene, 1995；164:229
13 高春芳，孔宪涛.胶原转录反式调控因子研究进展.国外医学*分子生物学分册，1997；4(9)：163
14 高春芳，孔宪涛，范列英.TNFα对NIH/3T3细胞、肝贮脂细胞增殖及前胶原表达的影响.中华消化杂志，1994；14(1)：25
收稿1997-11-27 修回1998-02-20, 百拇医药
单位：高春芳 王 皓 孔宪涛 上海第二军医大学附属长征医院全军临床免疫中心，上海200003；印 彤 上海瑞金医院临床免疫学教研室，上海200020
关键词：细胞因子；胶原；基因
中国免疫学杂志990704 中国图书分类号 R392
摘 要 目的：探讨细胞因子对小鼠α2(I)型前胶原基因上游启动子活性的影响。方法：以小鼠α2(I)型前胶原基因启动子(-2 kb～+54 bp)为靶序列，将它与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成的重组体pAZ1009用脂质体法转染至胶原产生细胞NIH/3T3细胞，讨论IFNα、IFNγ、TNFα对小鼠α2(I)型前胶原基因上游启动子活性的影响。结果：TNFα抑制小鼠α2(I)型前胶原基因启动子活性，TNFα分别与IFNγ、IFNα联合应用能加强这种抑制作用。结论：TNFα分别与IFNγ、IFNα联合应用能加强抑制作用，这可能与IFNγ、IFNα诱导TNFα受体表达，从而加强TNFα抑制作用有关，而IFNγ抑制胶原蛋白合成作用与该序列无直接相关。
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The effect of cytokines on promoter activity of α2(I)procollagen gene
GAO Chun-Fang, YIN Tong, WANG Hao et al.
Clinical Immunology Center, Changzheng Hospital , Shanghai 200003
Abstract Objective: To study the effect of cytokines on promoter activity of α2(I) procollagen gene. Methods: This study focused on the promoter sequence -2 kb ～ +54 bp of mouse α2(I) procollagen gene and the effect of TNFα, IFNα, IFNγ on promoter activity. The construction pAZ1009 containing this sequence and CAT as reporter gene was transfected to cytokines-treated NIH/3T3 cells with liposomal transfection method. Cytokines treatment was continued for another 24 hours after transfection. Results: The study reveals that TNFα inhibits promoter activity of mouse α2(I) procollagen gene, this inhibition effect is even stronger when TNFα was used in combination with IFNγ or IFNα. Conclusion: A potential explanation for this synergism is provided by the finding that IFNγ, IFNα can increase the number of TNFα receptor, thus making these cells more susceptible to TNFα modulation. The inhibition effect of IFNγ on procollagen production seems have no direct relation with the promoter sequence.
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Key words Cytokines Collagein Gene
胶原蛋白异常沉积是危及机体多种器官的纤维化疾病的重要特征，肺、肝脏、肾脏、心脏、皮肤等均可能是这种纤维化损伤的靶器官。研究表明，过度沉积的胶原蛋白如I型胶原与其产生细胞相应基因的激活有关[1，2]。早期的研究已证实肝纤维化形成时肝脏贮脂细胞合成的I型胶原mRNA水平显著上升[3]。尽管目前纤维化疾病中胶原基因表达激活机理仍不清楚，但胶原基因的激活常与炎症损伤相伴出现，提示细胞因子与胶原基因激活有关[4，5]。目前较明确的多肽类生长因子TGFβ能显著激活前胶原基因[6，7]，而淋巴因子TNFα、IFNγ有一定的抗纤维化活性[8，9]。本研究应用小鼠α2(I)前胶原基因启动子(-2 kb～+54 bp)与氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成的重组体及基因转染技术，探讨IFNα、IFNγ、TNFα对小鼠α2(I)前胶原基因上游启动子活性的影响。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养 小鼠NIH/3T3细胞以含10%FCS的1640(Gibco)培养，0.125%胰蛋白酶(Sigma)消化传代。
1.2 重组体质粒的制备 含小鼠α2(I)前胶原基因启动子-2 kb～+54 bp及报告基因的重组体质粒pZA1009美国NIC Crombrugghe教授惠赠[10](见图1)，经转染至大肠杆菌并筛选，酶切鉴定正确后，Qiagen plasmid midi kit大量扩增抽提、纯化质粒，紫外分光光度计(Du-600, Beckman)测得率、纯度，-20℃保存待用。作内对照用的碱性磷酸酶表达质粒pSVA2P(Merck & Co.InC.惠赠)及阳性对照含CAT的表达质粒pSV2CAT(Invitrogen)亦经同上方法扩增，抽提纯化后-20℃保存待用[11]。
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图1 含小鼠α 2(I)型前胶原基因-2 kb～+54 bp片段(黑色部分)及CAT报告基因的质粒pAZ1009
Fig.1 Plasmid PAZ 1009 contains-2 kb～+54 bp fragment of mouse α2(I) procollagen gene (black part) and CAT as reporter gene
1.3 DNA转染及细胞因子处理 DNA转染采用Dosper脂质体转染法(Boehringer-Mannheim)：NIH/3T3细胞以5×105/孔接种于6孔培养板(Nunc)，细胞贴壁后分别用rhTNFα(第二军医大学)100 U/ml、 rhIFNα(Roche)1 000 U/ml+rhTNFα 100 U/ml、rhIFNγ人或鼠(第二军医大学)1 000 U/ml+rhTNFα 100 U/ml处理24 h换新鲜但不含FCS的培养基，质粒DNA以脂质体/DNA复合物形式加入上述细胞培养孔中，同时转染碱性磷酸酶表达质粒pSVA2P(Merck&Co.InC.惠赠)作内对照及含CAT的表达质粒(Invitrogen)作阳性对照。转染后6 h，每孔细胞加两倍于正常量的FCS(20%)，24 h后换新鲜含10%FCS的培养基，并加转染前相同种类、数量的细胞因子，继续培养24 h后，测报告基因CAT活性。
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1.4 CAT及碱性磷酸酶(AP)活性测定 终止培养的细胞用预冷的PBS洗3遍，以裂解缓冲液(Boehringer-Mannheim)裂解细胞后，进行蛋白定量(Bradford法)、AP活性测定(Trace CB171半自动生化分析仪)及CAT-ELISA(Boehringer-Mannheim)定量。
2 结果
胶原产生细胞NIH/3T3细胞经细胞因子预处理和转染后再处理24 h，ELISA测定细胞裂解液中CAT表达量，同时测定蛋白浓度及AP活性，AP表达活性作为内对照以保持转染效率，相同条件下比较CAT表达量。CAT测定结果用相应蛋白含量及AP活性校正后与未经细胞因子处理的细胞裂解液CAT的相对比值见图2，即TNFα 100 U/ml，IFNα 1 000 U/ml+TNFα 100 U/ml，IFNγ 1 000 U/ml+TNFα 100 U/ml预处理24 h及后处理24 h的细胞CAT表达活性下降，亦即上述细胞因子下调小鼠α2(I)型前胶原基因启动活性。
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图2 转染pAZ1009的NIH/3T3细胞经细胞因子处理与未处理者CAT相对表达量
Fig.2 Relative expression levels of CAT in pAZ1009-transfected NIH/3T3 cells treatd with IFNs and TNFα
Note:values shown represent the average ratio for three seperate experiments
3 讨论
I型胶原由两种蛋白肽链α1(I)、α2(I)组成。组织损伤后纤维母细胞I型前胶原基因表达激活，参与疤痕或纤维化，这也正是临床上常见的器官纤维化如肝纤维化、皮肤疤痕形成等典型例证。调节I型胶原蛋白产生的机制可发生在转录水平和转录后水平，其中转录水平的调节主要通过靶基因上顺式DNA序列与其反式蛋白因子相互作用完成。目前研究已在人、鼠I型前胶原基因启动子及第一个内含子中发现存在重要的调控序列[12]。能显著促进纤维化形成的细胞因子TGFβ的反应元件即位于小鼠α2(I)转录起始点上游几百bp处，SP-1(Specific protein-1)与该序列作用是TGFβ诱导小鼠α2(I)前胶原基因表达的重要机制之一，其它核蛋白转录因子亦参与了这种激活过程[13]。TNFα、IFNγ是目前较为明确的抗纤维化因子，我们早期的研究表明，TNFα在单细胞水平可降低大鼠肝贮脂细胞及NIH/3T3细胞前胶原Ⅰ、Ⅲ mRNA表达[14]，为进一步研究这两种细胞因子抗纤维化的作用机制，本研究以能调控胶原α2(I)型特异表达的小鼠前胶原α2(I)基因5′侧翼区2 kb～+54 bp(包括部分外显子I)的片段为靶序列，CAT作报告基因，脂质体法转染该重组体pAZ1009至NIH/3T3细胞，结果发现，TNFα(100 U/ml)抑制CAT表达，亦即抑制小鼠α2(I)前胶原2 kb～+54 bp启动活性，TNFα分别与IFNγ(1 000 U/ml)、IFNα(1 000 U/ml)联合应用也具有抑制作用，但单独应用IFNγ或IFNα不仅无抑制活性相反有轻度促进作用(资料未显示)，本结果与Kahari等的报道类似[8]。单独应用IFNγ、 IFNα无抑制作用的可能原因为：IFNγ、 IFNα抑制小鼠α2(I)型前胶原基因转录活性的作用靶部位可能位于2 kb～+54 bp以外；IFNγ、IFNα抑制胶原合成的作用机制可能在于降低胶原mRNA稳定性或调控作用发生于转录后水平[8]。目前我们正致力于研究定位抗纤维化因子TNFα、IFNγ及致纤维化因子(如TGFβ)对小鼠α2(I)型胶原启动子(2 kb～+54 bp)的调控靶序列及其相应反式作用蛋白，有望在激活态胶原产生细胞中发现纤维化相关的新的或特异核转录因子，这一研究将有助于我们进一步认识纤维化(硬化)发生中胶原基因如何被转录激活，为纤维化的逆转提供新的思路。
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致谢：王爱华副主任技师和张玲珍主管技师对本文研究工作给予极大支持和帮助，特此致谢!
①本课题为国家自然科学基金资助项目
作者简介：高春芳，女，35岁，博士，副研究员，主要研究肝纤维化的免疫原及分子生物学机制研究；
王 皓，男，28岁，技师，主要研究肝病分子生物学机制
4 参考文献
1 Bissel M D,Friedman S L,Maher J J et al. Connective tissue biology and hepatic fibrosis: report of conference. Hepatology, 1990;11:599
2 Milani S,Herbst H,Schuppan D et al. Cellular localization of type I, type Ⅲ and Ⅳ procollagen gene transcripts in normal and fibrotic human liver. Am J Pathol, 1990;137:59
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3 Friedman S L. The cellular basis of hepatic fibrosis. Mechanisms and treatment strategies. N Eng1 J Med, 1993;328:1828
4 Peterson T C, Isbrucker R A. Fibroproliferation in liver disease: role of monocyte factors. Hepatology, 1992;15:191
5 Rockey D C, Chung J J. Interferon γ inhibits lipocyte activation and extracellular matrix mRNA expression during experimental liver injury: implication for treatment of hepatic fibrosis. J Investig Med, 1994;42:660
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6 Gao C F, Gressner G, Zoremba M et al. Transforming growth factor β expression in isolated and cultured rat hepatocytes. J Cell Physiol, 1996;167:394
7 Inagaki Y, Truter S, Tanaka S et al. Overlapping pathways mediate the opposing actions of TNF alpha and TGF beta on alpha2(I) collagen transcription. J Biol Chem, 1995;270:3353
8 Kahari V M, Chen Y Q, Su M W et al. Tumor necrosis factor alpha and interferon gamma suppress the activation of human type I collagen expression by TG Fbetal. J Clin Invest, 1990;86:1498
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9 Rockey D C, Maher J J, Jarnagin W R et al. Inhibition of rat hepatic lipocyte activation in culture by interferon γ. Hepatology,1992;16:776
10 Schmidt A, Rossi P, Crombrugghe B. Transcriptional control of the mouse ahpha2(I) collagen gene: functional deletion analysis of the promoter and evidence for cell-speific expression. Mol Cell Biol, 1986;6:347
11 Yoon K, Thiede M, Rodan G A. Alkaline phosphatase as a report enzyme. Gene, 1998;66:1110
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12 Li L, Artlett C M, Jimenez S A et al. Positive regulation of human alpha1(I) collagen promoter activity by transcriptional factor SP1. Gene, 1995；164:229
13 高春芳，孔宪涛.胶原转录反式调控因子研究进展.国外医学*分子生物学分册，1997；4(9)：163
14 高春芳，孔宪涛，范列英.TNFα对NIH/3T3细胞、肝贮脂细胞增殖及前胶原表达的影响.中华消化杂志，1994；14(1)：25
收稿1997-11-27 修回1998-02-20, 百拇医药